药食同源组合物或其提取物的超高效液相特征图谱及其构建方法和在含量测定中的用途

摘要

本发明提供药食同源组合物或其提取物的超高效液相特征图谱及其构建方法和在含量测定中的用途，包括：制得药食同源组合物的供试品溶液，并以绿原酸作为对照品制得对照品溶液；对药食同源组合物的供试品溶液和对照品溶液进行超高效液相色谱检测；药食同源组合物包含金银花、牛蒡根、紫苏叶、桔梗、山楂、人参、红茶和甘草；超高效液相色谱检测的条件包括：在327nm的波长下，以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂，以乙腈为流动相A，以甲酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱的方式洗脱。本发明构建的超高效液相特征图谱为全面、准确地鉴定药食同源组合物或其提取物、实现其成分分析与含量检测提供了可靠的保障。

说明书

技术领域

本发明属于中药和食品分析及检测技术领域。具体地，本发明涉及一种药食同源组合物或其提取物的超高效液相特征图谱及其构建方法和在含量测定中的用途。

背景技术

由金银花、牛蒡根、紫苏叶、桔梗、山楂、人参、红茶和甘草组成的药食同源组合物的组方由清感冬饮化裁而来。该方可益气固表、清热解毒、宣肺止咳，可用于预防流感、慢性咽炎。药茶合用共奏扶正固表，宣肺利咽之功。

有必要开发该药食同源组合物的超高效液相(UPLC)特征图谱及构建方法、以及基于该特征图谱的药食同源组合物中成分含量的全面、准确的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种药食同源组合物或其提取物的超高效液相特征图谱及其构建方法和在含量测定中的用途。该构建方法以绿原酸为特征成分，通过超高效液相色谱有效地构建了药食同源组合物或其提取物的特征图谱，为更全面、更准确地实现该药食同源组合物中各成分的分析与含量检测提供了可靠的保障。

本发明的上述目的是通过提供以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种药食同源组合物或其提取物的超高效液相特征图谱的构建方法，其包括：

(a)制得药食同源组合物的供试品溶液，并以绿原酸作为对照品制得对照品溶液；

(b)对所述药食同源组合物的供试品溶液和对照品溶液进行超高效液相色谱检测；

其中，所述药食同源组合物包含金银花、牛蒡根、紫苏叶、桔梗、山楂、人参、红茶和甘草；

所述超高效液相色谱检测的条件包括：

在327nm的波长下，以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂，以乙腈为流动相A，以甲酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱的方式洗脱。

优选地，在步骤(a)中，制得所述药食同源组合物的供试品溶液的步骤包括：使所述药食同源组合物的供试品溶解于甲醇水溶液中，经超声提取、过滤后制得。

优选地，所述药食同源组合物的供试品溶液的浓度可以为5～50mg/mL。在本发明中，所述药食同源组合物的供试品溶液的浓度可以选择例如5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、15mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、50mg/mL、或以上点值中任意两个组成的范围或其中的任意点值。

优选地，所述药食同源组合物的供试品可以为包含所述药食同源组合物的固体饮料，例如由所述药食同源组合物组成的方冠茶。

优选地，在步骤(a)中，制得所述对照品溶液的步骤包括：将绿原酸溶解于甲醇水溶液中。

优选地，所述对照品溶液的浓度为10.74μg/mL～1074.48μg/mL，优选为50μg/mL。

优选地，所述超声提取在260～520W的功率和30～50kHz的频率下进行10～40min。在本发明中，所述超声提取例如可以在260W、270W、280W、290W、300W、310W、320W、330W、340W、350W、360W、370W、380W、390W、400W、410W、420W、430W、440W、450W、470W、490W、500W、510W、520W、或以上点值中任意两个组成的范围或其内的任意点值的功率，和30kHz、35kHz、40kHz、45kHz、50kHz、或以上点值中任意两个组成的范围或其内的任意点值的频率下进行10min、25min、30min、35min、40min、或以上点值中任意两个组成的范围或其内的任意点值的时间。

优选地，所述甲醇水溶液的体积比浓度为0％～100％。在本发明中，所述甲醇水溶液的体积浓度可以选择例如0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或以上点值中任意两个组成的范围或其内的任意点值。进一步优选地，所述甲醇水溶液的体积浓度为70％。在本发明中，当所述甲醇水溶液的体积浓度选择“0％”时，表示在这种情况下将所述药食同源组合物的供试品和/或绿原酸溶解于水中，以制得所述药食同源组合物的供试品溶液和/或对照品溶液；当所述甲醇水溶液的体积浓度选择“100％”时，表示在这种情况下将所述药食同源组合物的供试品和/或绿原酸溶解于甲醇中，以制得所述药食同源组合物的供试品溶液和/或对照品溶液。

优选地，作为流动相B，所述甲酸水溶液的体积浓度为0.08％～0.15％，优选为0.1％。

优选地，以所述流动相A和所述流动相B的体积分数计，所述梯度洗脱的程序包括：

0min～16min，以5％～10％流动相A-95％～80％流动相B洗脱；

16min～18min，以10％～16％流动相A-90％～84％流动相B洗脱；

18min～50min，以16％流动相A-84％流动相B洗脱。

优选地，所述流动相的流速为0.2～0.6mL/min，优选为0.3mL/min。

优选地，所述色谱柱的柱温为25～35℃，优选为30℃。

优选地，所述供试品溶液和对照品溶液的进样量为0.8～1.2μL，优选为1μL。

优选地，所述药食同源组合物包含金银花10～25重量份、牛蒡根10～25重量份、紫苏叶5～20重量份、桔梗5～20重量份、山楂5～20重量份、人参3～15重量份、红茶3～15重量份和甘草0.3～2.0重量份。

进一步优选地，所述药食同源组合物包含金银花15～21重量份、牛蒡根15～21重量份、紫苏叶9～15重量份、桔梗9～15重量份、山楂9～15重量份、人参7～13重量份、红茶7～13重量份和甘草0.7～1.3重量份。

进一步优选地，所述药食同源组合物包含金银花18重量份、牛蒡根18重量份、紫苏叶12重量份、桔梗12重量份、山楂12重量份、人参10重量份、红茶10重量份和甘草1重量份。

优选地，在本发明的药食同源组合物或其提取物的超高效液相特征图谱的构建方法中，超高效液相色谱的系统适用性满足：按绿原酸峰计算，理论板数不低于3000。

第二方面，本发明提供了根据第一方面的方法构建的药食同源组合物或其提取物的超高效液相特征图谱。

优选地，所述超高效液相特征图谱包含6个特征峰，其中，相对于对照品特征峰2(S)的保留时间，其余特征峰的保留时间分别在以下规定值的±10％范围内：特征峰1：0.55、特征峰3：1.08、特征峰4：1.16、特征峰5：1.78以及特征峰6：3.07。更优选地，所述6个特征峰的分离度均大于1.5。在本发明中，特征峰的分离度是指该特征峰与所述超高效液相特征图谱中与其最邻近的峰的分离度。

第三方面，本发明提供一种药食同源组合物或其提取物的鉴定方法，其包括：采用根据第一方面的药食同源组合物或其提取物的超高效液相特征图谱的构建方法分别获得作为标准品的药食同源组合物和待鉴定的药食同源组合物样品的超高效液相色谱谱图，并将两者进行对照。

第四方面，本发明提供一种药食同源组合物或其提取物的成分含量检测方法，其包括：采用根据第一方面的药食同源组合物或其提取物的超高效液相特征图谱的构建方法获得待检测的药食同源组合物的超高效液相色谱谱图，并基于对照品浓度、对照品峰面积以及供试品峰面积计算所述待检测的药食同源组合物样品的成分含量。

与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

(1)本发明所提供的药食同源组合物或其提取物的超高效液相特征图谱及其构建方法以绿原酸为特征成分，为更全面、更准确地鉴定药食同源组合物或其提取物、实现对药食同源组合物或其提取物中各成分的分析与含量检测提供了可靠的保障。

(2)本发明所提供的检测药食同源组合物或其提取物的成分的方法具有准确度好、精密度高、专属性强、稳定性好的优势，符合中药质量标准研究的技术要求，为分析并测定药食同源组合物或其提取物中各成分的准确含量提供了可靠的途径。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为实施例1中对供试品进行全波长扫描所获得的谱图(210～400nm)；

图2为实施例1中绿原酸的光谱图；

图3为实施例1中确定的UPLC特征图谱；

图4是实施例2中供试品溶剂用量考察的UPLC色谱图；

图5是实施例2中提取溶剂浓度考察的UPLC色谱图；

图6是实施例2中超声功率考察的UPLC色谱图；

图7是实施例2中提取时间考察的UPLC色谱图；

图8是实施例3中绿原酸含量测定精密度考察的UPLC色谱图；

图9是实施例3中绿原酸含量测定重复性考察的UPLC色谱图；

图10是实施例3中绿原酸加样回收试验的UPLC色谱图；

图11是实施例3中绿原酸含量测定线性范围考察的UPLC色谱图；

图12是实施例3中绿原酸的标准曲线；

图13是实施例3中绿原酸含量测定专属性考察的UPLC色谱图；

图14是实施例3中供试品稳定性考察的UPLC色谱图；

图15是实施例3中ACQUITY H-CLASS PLUS(PDA检测器)考察的UPLC色谱图；

图16是实施例3中Thermo Vanquish(DAD检测器)考察的UPLC色谱图；

图17是实施例3中方冠茶绿原酸含量测定三倍洗脱时间考察的UPLC图谱；

图18是实施例3中方冠茶特征图谱精密度考察的UPLC色谱图；

图19是实施例3中方冠茶特征图谱重复性考察的UPLC色谱图峰；

图20是实施例3中方冠茶特征图谱稳定性考察的UPLC色谱图峰。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

本发明实施例中所采用的部分试剂与试药和仪器的信息如下所列。

试剂与试药：方冠茶颗粒(批号：20220121，配方为：金银花、牛蒡根、紫苏叶、桔梗、山楂、人参、红茶和甘草，其具体制备方法参见申请号为202211691135.8的中国专利申请的实施例1)；绿原酸(批号：110753-202119，纯度96.3％)对照品购自中国食品药品检定研究院；乙腈(天津渤化化学试剂有限公司，20210220，色谱纯)；甲醇(天津渤化化学试剂有限公司，20201208，分析纯)；甲酸(上海市试剂一厂，2019-1-2，色谱纯)。

仪器：分析天平(赛多利斯，SQP QUINTIX224-1CN，德国)；Thermo Vanquish型超高效液相色谱仪(配有DAD检测器、控温型柱温箱、控温型自动进样器，美国)；Waters AcquityH-CLASS PULS型超高效液相色谱仪(配有PDA检测器、控温型柱温箱、控温型自动进样器，美国)；高速台式离心机(SIGMA，1-14，德国)；超纯水仪(CASCADA，PALL，美国)；超声波清洗仪(天津奥特赛恩斯，AS20500BT，中国)。

另外，需要说明的是，以下实施例中的RSD值是基于原始数据(保留小数点后多位)计算所得，表中所示用于计算RSD值的数据均为修约数值(如在原始数据基础上保留两位)。

实施例1

取方冠茶颗粒适量，研细，取约0.5g，精密称定，精密加入70％(v/v)甲醇水溶液25mL，密塞，称定重量，超声提取(功率520W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，获得供试品溶液。

取绿原酸对照品适量，精密称定，加入甲醇制成每50μg/mL的溶液，获得对照品溶液。

按照以下色谱条件，对所述供试品溶液和对照品溶液进行超高效液相色谱检测：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％(v/v)甲酸水溶液为流动相B，按以下表1中所列的程序进行梯度洗脱；流速为0.3mL/min；柱温为30℃；PDA全波长扫描(210～400nm)。

表1梯度洗脱程序

供试品的全波长扫描图谱和绿原酸的光谱图分别参见图1和图2。由实验和图中结果发现，在3D光谱图中，从190nm～400nm范围内改变波长，观察不同波长下色谱图，发现在327nm的检测波长下，色谱图能体现出最多的化合物信息；绿原酸的光谱图显示，绿原酸在327nm附近存在较好吸收。因此，将构建特征图谱及含量测定的检测波长确定为327nm(参见图3)。

实施例2

本实施例分别考察了在供试品溶液的制备过程中溶剂用量、超声提取(包括提取溶剂、提取时间、提取功率)对结果的影响，具体如下：

方冠茶颗粒(批号：20220121)，按照实施例1的方法，分别采用10mL、25mL、50mL、100mL的70％(v/v)甲醇水溶液作为提取溶剂制备供试品溶液，并进行液相测定，考察不同体积70％(v/v)甲醇水溶液对供试品提取结果的影响。其中，以绿原酸含量为评价指标。图4示出了供试品溶剂用量考察的UPLC色谱图结果，其中A、B、C、D、E分别表示绿原酸对照品、10mL提取溶剂、25mL提取溶剂、50mL提取溶剂以及100mL提取溶剂的图谱。如表2中结果所示，采用10ml、25mL、50mL、100mL的提取溶剂提取，绿原酸含量RSD值均小于5％，无显著性差别，为便于操作，选择25mL的70％(v/v)甲醇水溶液作为提取溶剂。

表2溶剂体积考察结果

取方冠茶颗粒(批号：20220121)，按照实施例1中的制备方法与色谱条件，分别采用纯水、30％(v/v)甲醇水溶液、50％(v/v)甲醇水溶液、70％(v/v)甲醇水溶液、甲醇作为提取溶剂制备供试品溶液，考察以纯水、30％(v/v)甲醇水溶液、50％(v/v)甲醇水溶液、70％(v/v)甲醇水溶液、甲醇作为提取溶剂对供试品提取结果的影响，以绿原酸含量为评价指标。图5示出了提取溶剂浓度考察的UPLC色谱图结果，其中A、B、C、D、E、F分别表示绿原酸对照品、纯水提取、30％(v/v)甲醇水溶液提取、50％(v/v)甲醇水溶液提取、70％(v/v)甲醇水溶液提取以及甲醇提取的图谱。如表3中结果所示，甲醇不利于供试品的提取，以70％(v/v)甲醇水溶液作为提取溶剂较佳。

表3提取溶剂浓度考察结果

取方冠茶颗粒(批号：20220121)，按照实施例1中的制备方法与色谱条件，分别采用50％、75％、100％额定功率(520W，40kHz)制备供试品，考察50％、75％、100％额定功率(520W，40kHz)对供试品提取结果的影响，选取绿原酸含量为评价指标。图6示出了超声功率考察的UPLC色谱图结果，其中A、B、C、D分别表示绿原酸对照品、100％超声功率提取、75％超声功率提取及50％超声功率提取的图谱。如表4中结果所示，不同超声功率均可实现绿原酸的有效提取，效果无显著差别。

表4超声功率考察结果

取方冠茶颗粒(批号：20220121)，按照实施例1的方法，在520W、40kHz下，分别超声提取10min、20min、30min、40min制备供试品溶液，考察不同超声提取时间对供试品提取结果的影响，选取绿原酸含量为评价指标。图7示出了提取时间考察的UPLC色谱图结果，其中A、B、C、D、E分别表示绿原酸对照品、提取40min、提取30min、提取20min及提取10min的图谱。如表5中结果所示，10min、20min、30min、40min四个提取时间，绿原酸含量RSD值均小于5％，无显著性差异。

表5提取时间考察结果

实施例3

本实施例考察了本发明的方法的精密度、重复性、准确度、线性与范围、专属性、稳定性、色谱柱耐用性、仪器重现性、特征图谱精密度、特征图谱重复性以及特征图谱稳定性，具体如下：

对照品溶液的制备：取绿原酸对照品适量，精密称定，加入甲醇制成50μg/mL的溶液，获得对照品溶液。

供试品溶液的制备：取供试品适量，研细，取约0.5g，精密称定，精密加入70％(v/v)甲醇水溶液25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率520W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％(v/v)甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，获得供试品溶液。

参照《中国药典》2020年版四部通则0512的规范，色谱条件与系统适用性试验：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)，以乙腈为流动相A，以0.1％(v/v)甲酸水溶液为流动相B，按表1中所列的程序进行梯度洗脱；流速为0.3mL/min；柱温为30℃；含量测定检测波长为327nm，特征图谱检测波长为327nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪进行检测。

取绿原酸对照品，采用以上色谱方法，重复进样6针，计算绿原酸峰面积相对标准偏差，图8中A、B、C、D、E、F分别表示绿原酸对照品第1次进样至第6次进样的图谱。如图8和表6中结果所示，绿原酸6针进样峰面积RSD值为0.2％，表明仪器精密度良好，符合药品质量标准分析方法验证指导原则(《中国药典》2020年版四部通则9101)要求。

表6绿原酸含量测定精密度考察结果

参照本实施例的前述方法分别制备6份供试品溶液，并采用本实施例前述色谱条件进样，分析供试品中绿原酸含量RSD值，以考察本发明方法的重复性。图9中A、B、C、D、E、F分别表示方冠茶第1次至第6次制备供试品所测得的图谱。如图9和表7中结果所示，6份供试品溶液中绿原酸含量RSD值为1.8％，表明本发明的方法重复性良好，符合药品质量标准分析方法验证指导原则(《中国药典》2020年版四部通则9101)要求。

表7绿原酸含量测定重复性试验结果

定量计算方法依据《中国药典》2020年版四部通则0512超高效液相色谱法中有关规定进行计算，即测量对照品溶液和供试品溶液中待测物质的峰面积，按以下等式计算含量：

含量(C

等式中，A

准确度系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率(％)表示。

取方冠茶颗粒(批号：20220121)样品，分别加入不同比例对照品进行加样(n＝9)，制备供试品溶液，并按照本实施例前述的色谱条件进行超高效液相色谱分析，分析结果取平均值。图10中A、B、C、D分别表示绿原酸对照品、1.5∶1加入对照品、1∶1加入对照品及0.5∶1加入对照品的图谱。如图10和表8中结果所示，加样回收试验中，绿原酸的平均回收率为105.7％，RSD为0.82％，符合药品质量标准分析方法验证指导原则(《中国药典》2020年版四部通则9101)要求。

表8绿原酸加样回收试验结果

取绿原酸对照品适量，精密称定，加入甲醇制成1074.48μg/mL的标准溶液母液。吸取标准溶液，分别稀释至浓度为标准溶液浓度的1％、10％、25％、50％、75％、100％的绿原酸标准溶液，并按照本实施例前述的色谱条件进行超高效液相色谱分析。图11中A、B、C、D、E、F分别表示浓度为母液浓度的1％、10％、25％、50％、75％、100％的绿原酸对照品溶液图谱。如图11和图12中结果所示，以浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，拟合绿原酸标准曲线为：Y＝0.1796X-0.2034(n＝6)，R

取不含有金银花、牛蒡根及山楂药材制备成的阴性样品适量，按照本实施例前述的方法制备供试品溶液。取方冠茶供试品溶液、绿原酸标准品溶液和阴性样品溶液，按照本实施例前述的色谱条件进行超高效液相色谱分析。图13中A、B、C分别表示绿原酸对照品图谱、方冠茶颗粒供试品图谱及阴性样品图谱。如图13中结果所示，绿原酸在阴性位置处无干扰峰，表明含量测定专属性良好。

取方冠茶颗粒(批号：20220121)，按照本实施例中前述的方法制备供试品溶液，并按照本实施例前述的色谱条件进行超高效液相色谱分析。在0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h分别进样测定，将峰面积作为指标，考察样品在24h内的稳定性。如图14(A至I分别对应上述0～24h内各进样时间点的进样结果)和表9中结果所示，对于绿原酸含量测定，供试品24h内峰面积RSD为0.2％，表明稳定性良好。

表9供试品的稳定性考察结果

在不同仪器上考察方冠茶含量测定和特征图谱方法系统适用性，仪器信息及考察结果参见表10、表11和图15、图16。结果表明，在不同仪器上，绿原酸色谱峰均达到基线分离，且阴性样品中无干扰峰，表明本发明的方冠茶绿原酸含量测定方法在不同仪器上重现性良好。

表10绿原酸含量测定液相色谱仪信息

表11不同仪器考察结果

取方冠茶颗粒(批号：20220121)，按照本实施例中前述的方法与色谱条件制备供试品溶液并进行超高效液相色谱检测。将色谱梯度延长至150min，考察方冠茶绿原酸含量测定三倍洗脱时间图谱。图17中A、B、C分别表示绿原酸对照品图谱、50min洗脱得到的供试品图谱及150min洗脱得到的供试品图谱。如图17中所示，经三倍洗脱，50min之后基本无色谱峰，因此将洗脱时间确定为50min。

取方冠茶颗粒(批号：20220121)，按照本实施例中前述的方法和色谱条件制备供试品溶液并进行超高效液相色谱检测，重复进样6针，以绿原酸为S峰，计算其他特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积RSD值，结果参见图18和表12、表13。图18中A、B、C、D、E、F、G分别表示方冠茶颗粒供试品第1次至第6次进样得到的供试品图谱。结果显示，特征峰的相对保留时间与相对峰面积RSD均小于2％，表明精密度良好。而且，各特征峰与色谱图中与其最邻近的峰之间的分离度均大于1.5(两种物质之间分离度大于等于1.5时，二者含量的测定不受相互影响)。

表12方冠茶特征图谱精密度考察结果(相对保留时间)

表13方冠茶特征图谱精密度考察结果(相对峰面积)

取方冠茶颗粒(批号：20220121)，按照本实施例中前述的方法与色谱条件制备供试品溶液6份并进行液相色谱检测。以绿原酸为S峰，计算其他特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积RSD值，结果参见图19和表14、表15。图19中A、B、C、D、E、F分别表示制备第1份供试品至第6份供试品测得的图谱。结果显示，特征峰的相对保留时间与相对峰面积RSD均小于2％，表明特征图谱重复性良好。

表14方冠茶特征图谱重现性考察结果(相对保留时间)

表15方冠茶特征图谱重现性考察结果(相对峰面积)

特征图谱稳定性考察：取方冠茶颗粒(批号：20220121)，按照本实施例中前述的方法与色谱条件制备供试品溶液并进行超高效液相色谱检测。分别在0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h时进样测定，记录峰保留时间与峰面积。以绿原酸为S峰，计算其他特征峰与S峰相对保留时间及相对峰面积RSD值，结果参见图20和表16、表17。图20中A、B、C、D、E、F、G、H、I分别对应上述0h至24h内各进样时间点的进样结果。结果显示，特征峰的相对保留时间与相对峰面积RSD均小于2％，表明供试品的特征图谱在24h内稳定性良好。

表16方冠茶特征图谱稳定性考察结果(相对保留时间)

表17方冠茶特征图谱稳定性试验结果(相对峰面积)

以上所述仅是本发明的几个示例性实施例，并非对本发明做任何形式的限制。虽然本发明以较佳的实施例揭示如上，然而其并非用以限制本发明。任何熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰而获得的等同或等效实施例，均属于本发明的范围。