一种血清外泌体miR-3614-3p作为眼肌型重症肌无力诊断性生物标志物的应用

摘要

本发明提供了一种检测血清外泌体miRNA表达量的试剂在制备诊断眼肌型重症肌无力的产品中的应用，所述血清外泌体miRNA为miR‑3614‑3p。本发明通过提取OMG和健康对照组的血清外泌体miRNA并进行深度测序及验证，结合生物信息学分析方法，结果表明，与健康对照组相比，OMG患者血清外泌体的miR‑3614‑3p水平显著下降，在OMG和健康对照组间的差异具有统计学意义，经过验证具有良好的诊断效能，灵敏度及特异性更高，与由此可见，血清外泌体来源的miR‑3614‑3p可以作为OMG诊断性生物标记物应用，以减少OMG的漏诊误诊。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种血清外泌体miR-3614-3p作为眼肌型重症肌无力诊断性生物标志物的应用。

背景技术

重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是一种主要由乙酰胆碱受体抗体介导的、T细胞依赖、补体和细胞因子参与，累及到神经肌肉接头的获得性自身免疫性疾病[1]。MG可累及全身骨骼肌，表现为波动性肌无力[1]。根据改良Osserman分型，MG可分为眼肌型、全身型、重度激进型、迟发重度型及肌萎缩型等[1]。当肌无力累及到面肌、四肢肌、延髓肌等其他骨骼肌时，称全身型重症肌无力(systemic myasthenia gravis GMG)。GMG较眼肌型重症肌无力(ocular myasthenia gravis,OMG)患者更容易出现严重的症状，甚至可能发生呼吸肌无力而危及生命。因此，OMG的早发现、早诊断和早治疗，是延缓甚至防止OMG进展为GMG的关键。

OMG是MG中最常见的一种亚型，仅累及提上睑肌、眼轮匝肌、眼外肌，占MG的50％。OMG主要表现为波动性的上睑下垂、复视/斜视、眼睑闭合不全。当上睑下垂或斜视症状明显时，处于视力发育关键期的儿童患者易发生弱视和立体视觉障碍。OMG受累眼肌无力的程度具有波动性，疲劳后加重，休息、睡眠和低温后改善。OMG可发生于所有年龄、种族和民族，但临床症状和对治疗的反应差异很大。

根据中国重症肌无力诊断和治疗指南(2022版)，OMG诊断依据：1)波动性眼肌无力：上睑下垂、复视和/或斜视；2)乙酰胆碱受体抗体(acetylcholine receptorsantibody,AChR-Ab)、肌肉特异性酪氨酸激酶受体抗体(muscle-specific kinaseantibody,MuSK-Ab)、低密度脂蛋白相关蛋白4受体抗体(lipoprotein-related protein4antibody,LRP4-Ab)任一个阳性；3)肌电图阳性；4)新斯的明试验阳性；5)治疗性药物试验阳性。符合上述诊断标准中的第1点以及其他2至5项中任意一点，同时排除其他疾病引起的眼肌麻痹即可明确诊断。

但是，目前临床上对OMG的诊断存在一定的困难，原因如下：

1)在临床表现方面，对于神经内科医生和眼科医生来说，累及提上睑肌引起的上睑下垂症状诊断并不困难，但是眼外肌受累出现斜视或复视时，早期表现较为隐匿，临床检查较为专业，无论对于神经科医生还是非眼肌专业的眼科医生来讲，都具有一定的难度。

2)在新斯的明试验方面，在新发病例中敏感性高，但针对病程较长的病例，由于发病时间较长引起的眼外肌肌肉挛缩，可使眼球固定于某一眼位，导致药物作用不明显。

3)现有的抗体检测，包括AChR-Ab、MuSK-Ab，LRP4-Ab，其中任一抗体阳性即可确诊。据报道AChR-Ab阳性率在GMG中为85％-90％[6]，而在OMG中阳性率仅为50％左右[1]，远低于GMG。在AchR-Ab阴性MG患者中，70％的患者存在血清MuSK-Ab阳性，可进一步协助MG诊断，但MuSK-MG患者主要为累及延髓、颈部、肩部及面部肌肉的GMG，眼部受累较为少见[2,3]。LRP4-Ab在国外MG患者中的阳性率为0.45％～40％[4]，在国人MG患者中阳性率仅0.7％-1.7％[5],远低于国外报道，可能与种族差异有关。

4)在肌电图方面，重复神经电刺激(repetitive neuroelectrical stimulation，RNS)是目前最常用于诊断OMG的神经电生理检查技术，但其阳性率较低(11％-35％)。由于目前技术限制，斜视及复视患者无法行眼外肌肌电图检测，无疑增加了OMG的诊断难度[5]。

OMG临床表现复杂多样并具有波动性和易疲劳性，血清学抗体阳性率低，肌电图灵敏度低，有文献报道高达46％的OMG患者在发病1年内无法确诊[6]。OMG易被误诊多种与OMG有相似表现的疾病，如颅神经麻痹[7]、双上转肌麻痹、甲状腺相关眼病、糖尿病性动眼神经麻痹、干眼症、结膜炎等疾病。研究发现30％-80％未经免疫治疗的OMG患者将于2年内进展为GMG，需长期用药缓解，甚至可能可累及呼吸肌引发呼吸衰竭,导致死亡[8,9]。因此，临床上迫切需要用于OMG诊断的灵敏度及特异性更高的生物标志物，减少OMG漏诊误诊。

最近，许多研究报告miRNA在MG和OMG中发挥了重要作用。根据Cheng Z的报道[10],与健康对照组相比，MG患者外周血单个核细胞(periph-eral blood mononuclearcells，PBMCs)中miR-320a水平下降，同时伴有炎症免疫相关因子白细胞介素(interleu-kin，IL)IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-17的mRNA表达增高，具有抗炎作用的IL-4mRNA表达降低，主要通过ERK/NF-κB通路产生作用，提示miR-320a可能参与MG的免疫调节机制。另一项临床研究[11]对AChR-Ab阳性的MG患者进行血浆测定，结果显示has-miR150-5p、has-miR21-5p显著升高，hsa-miR27a-3p下降。Hsa-miR150-5p、has-miR21-5p具有调节T细胞分化及免疫应答功能的作用，其中has-miR150-5p在胸腺瘤切除术后下降明显，且患者临床症状改善，但AChR抗体滴度无变化。has-miR27a-3p与NK细胞毒性相关，对MG特异性T细胞及产生AChR-Ab的B细胞功能产生影响，表明上述三个miRNA可能为MG患者免疫相关的血液标记物，并可能成为MG诊断和治疗的靶点。在OMG方面，有报道miRNA在OMG向GMG转化中预测作用[12]。与OMG相比，GMG组有两种miRNA显著增高：miR-30e-5p和miR-150-5p。在这两种miRNAs中，miR-30e-5p鉴别OMG和GMG的敏感性为96％，对50岁以上的OMG患者敏感性为100％[12]。有文献报道半数以上未经治疗的OMG患者可能转化为GMG，糖皮质激素治疗可以延缓OMG进展为GMG[13]。目前尚无关于miRNA在OMG诊断中的作用研究。

miR-3614-3p是位于17号染色体上的一种基因内miRNA，成熟序列是UAGCCUUCAGAUCUUGGUGUUUU，平均大小是0.91。miR-3614-3p可以结合重要的宿主基因TRIM25的3′-UTR区域，从而对其抑制，参与了乳腺癌的发病机制[14]。此外，miR-3614广泛参与机体的炎症反应，包括TRAF6、MAPK、NF-kB等途径都已证实与miR-3614有关。近期的研究表明miR-3614与Akt信号途径也存在关联，miR-3614-3p可以靶向抑制Akt3的表达，从而对人类乳腺癌细胞的侵袭性进行抑制[15,16]。然而，关于miR-3614-3p与PI3K-Akt-mTOR之间的关系在OMG中的作用，目前尚不明确。

根据食品和药物管理局(FDA)和美国国立卫生研究院(NIH)生物标记物工作组的定义，生物标记物被定义为正常或不正常的生理过程或对干预的反应的易于测量的指标[17]。理想情况下，一个有效的MG生物标志物应该能够很容易区分MG患者和健康人，并能够反映疾病疗效及转归。由此可见，miRNA作为OMG诊断的生物标记物，具有很大的潜能。然而，目前所提取的血清miRNA主要来源于血液中凋亡细胞释放的微泡，存在易于降解的问题，这限制了其在临床中的应用。目前越来越多的学者把目光聚焦到了外泌体。

外泌体(exosome)是一种直径为30-100nm的生物活性微泡，其具有脂质双分子层膜结构，由自体细胞内多泡体通过出芽方式形成，再与细胞膜融合后释放至细胞外基质中，广泛分布于人体血清、唾液、尿液、乳汁和脑脊液等体液当中[18]。多种细胞在正常情况下或在细胞外刺激等应激条件下都能产生外泌体，来自不同细胞类型的外泌体作用机制及功能有很大区别。外泌体可通过膜蛋白与靶细胞膜蛋白结合、膜蛋白碎片与细胞膜上受体结合、膜与靶细胞膜融合等方式传递生物活性分子，从而参与机体免疫、细胞分化等过程。外泌体包含膜蛋白、胞质核蛋白、细胞外基质蛋白、代谢产物和核酸(mRNA、非编码RNA和DNA)。蛋白质组学分析揭示了外泌体标志物的异质性，试验可根据标志物的不同来设计。外泌体还具有功能异质性，因为其来源细胞、表达方式不一定相同，不同组别外泌体很可能行使不同功能[19]。外泌体的异质性决定了其功能的复杂和多样，使其在多组织多器官中承担不同的调控作用。外泌体miRNA是最常用的诊断性分子生物标志物。活细胞分泌的外泌体作为循环miRNA的富集体，保护miRNA免受RNase的降解，克服了微泡miRNA难以保存的问题，从而增加miRNA作为疾病生物标志物的潜力。

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发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提出一种血清外泌体miR-3614-3p作为眼肌型重症肌无力诊断性生物标志物的应用，使OMG诊断的灵敏度及特异性更高，减少OMG漏诊误诊。

本发明的目的之一在于，检测血清外泌体miRNA表达量的试剂在制备诊断眼肌型重症肌无力的产品中的应用，所述血清外泌体miRNA为miR-3614-3p。

进一步的，所述产品为检测试剂、试剂盒、微阵列或生物芯片。

进一步的，所述试剂的引物包括：

hsa-miR-3614-3p-RT，如SEQ ID NO.1所示；

hsa-miR-3614-3p-F3，如SEQ ID NO.2所示。

本发明采用血清外泌体miR-3614-3p作为眼肌型重症肌无力诊断性生物标志物的优越性在于：

(1)本发明采用的外泌体作为细胞分泌的泡状小体，内含多种蛋白、脂质、核酸分子，外泌体脂质膜结构能保护RNA免受核酸酶的降解，是miRNA富集体；外泌体源性miRNA能反映来源细胞的功能、状态,可预测疾病的演变和治疗反应，具有作为生物标志物的潜力。

(2)本发明采用的外泌体在血清中具有很高的浓度，且血清样本具有采集容易、可重复获得以及对患者创伤小的特点。

(3)本发明通过提取OMG和健康对照组的血清外泌体miRNA并进行深度测序及验证，结合生物信息学分析方法，结果表明，与健康对照组相比，OMG患者血清外泌体的miR-3614-3p水平显著下降，经过验证具有良好的诊断效能(ROC曲线下面积＝0.790)，灵敏度及特异性更高，与由此可见，血清外泌体来源的miR-3614-3p可以作为OMG诊断性生物标记物应用，以减少OMG的漏诊误诊。

(4)本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系，初期通过预实验筛选多种血清外泌体miRNAs，应用Real-time PCR等方法进行二次验证，采用分层评分系统对诊断结果进行标化，保证了该血清外泌体miRNA生物标志物和诊断试剂盒的可靠性。

附图说明

图1为本发明实施例3EXO透射电镜下的血清外泌体形态，标尺为200nm；

图2为本发明实施例3粒径检测仪检测的血清外泌体的粒径分布；

图3为本发明实施例3中血清外泌体的Western blot检测图；

图4为本发明实施例5的OMG和健康对照组中miR-3614-3p的相对表达量；

图5为本发明实施例5的OMG和健康对照组中miR-3614-3p的ROC曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明设计、阳性样本验证和结果分析。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1.血清样本的收集

使用一次性真空采血管促凝管(黄盖)收集眼肌型重症肌无力(OMG)患者组和健康对照组的外周血4ml，4℃冰箱竖直放置2小时，等待血液完全凝集后，放入离心机在室温，1,000×g条件下离心20分钟，将上清淡黄色液体吸入另一预冷的干净离心管，保存于-80℃冰箱备用。

实施例2.血清外泌体的提取

将实施例1获得的血清样本进行外泌体的提取，具体步骤如下：

(1)将冰冻血清样品从-80℃冰箱内取出解冻，用移液枪取1ml血清，在室温，2,000×g条件下离心10分钟，以去除残留细胞及碎片。

(2)转移上清液至新的离心管中，加入1/3体积的外泌体分离试剂A。

(3)颠倒混匀或移液器吹打混匀，4℃放置15min。

(4)室温，13,000×g离心10min，小心吸弃上清；室温，13,000×g离心30s，小心吸弃残留上清。

(5)加入与外泌体分离试剂A等体积的外泌体分离试剂B，使用移液器吹打混匀，13,000×g离心10min，丢弃上清液并收集沉淀物，其为粗外泌体。

(6)在1500×g下再次离心5分钟后，使用PBS溶解收集的沉淀物，并获得相对纯的外泌体。

上述操作在4℃的无菌条件下进行。所得沉淀即为外泌体，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)(0.22μm过滤、灭菌)重悬。分装保存于-80℃。

实施例3.血清外泌体的鉴定

将实施例2获得的血清外泌体进行鉴定，具体步骤如下：

(1)透射电子显微镜鉴定血清外泌体

1)外泌体用PBS重悬后吸取2μL悬液到新EP管中，加入8μL PBS，用移液枪轻柔吹打混匀。

2)滴1滴上一步制备的悬液到蜡盘上，取铜网使有支持膜的表面与样本液表面接触，静置10min。

3)取出铜网，用滤纸条吸去多余的液滴，稍微晾干。

4)取2％磷钨酸钠溶液，滴一小滴于蜡盘上，使外泌体样本与染液接触染色30s。

5)将铜网用镊子取出，用滤纸条吸去多余磷钨酸钠溶液，白炽灯下晾干。

6)使用透射电镜进行观察、拍照。图1为血清外泌体在EXO透射电镜下的形态，箭头指向的圆形泡为外泌体，直径约170nm。

(2)血清外泌体粒径检测

取纯水配制0.22μm滤器过滤并灭菌的PBS 100μL，重悬外泌体，再用PBS稀释5倍。使用ZetaView粒径检测仪进行测量。粒径检测仪检测外泌体粒径分布，结果如图2所示，EXO透射电镜下的形态，箭头指向的圆形泡为外泌体，直径约170nm。

(3)血清外泌体标志蛋白的蛋白免疫印迹(Western blot,WB)检测

1)蛋白样品准备

向外泌体沉淀中加入200μL添加1mm PMSF的RIPA裂解液，混匀后于冰上裂解，时间为30min。随后在4℃10000×g条件下离心5min，上清液即为外泌体。

取CD9、CD63及CD81蛋白作为阳性对照，Calnexin蛋白作为阴性对照。

将外泌体蛋白、无外泌体对照用蛋白检测法(bicinchoninic acid，BCA)定量，定量后稀释到相同浓度，加入1/4体积的5x SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，95℃5min变性样本，放冰上备用，长期保存放-20℃备用。

2)制胶

制备SDS-PAGE胶，下层分离胶浓度10％，上层浓缩胶浓度5％。

3)上样、电泳

向内槽和外槽倒入蛋白电泳缓冲液，每孔加样50g。电泳条件80V，15min，然后调至120V，至溴酚蓝跑出PAGE胶(约90min)。

4)转膜

电泳完后小心撬开玻璃板，将PVDF膜在甲醇中活化2min，连同PAGE胶在湿转缓冲液中浸泡5min，依次在转移夹上铺上海绵垫、滤纸、PVDF膜、PAGE胶、滤纸、海绵垫。每层都要去除中间的空气。安装好转移夹后将电泳槽放在冰水混合物盆子中，倒入适量湿转缓冲液，连接电源，条件：200mA，90min。

5)封闭、一抗、二抗孵育

转膜后将PVDF膜用PBST冲洗两次，将PVDF膜在封闭液(5％脱脂奶粉)中60Hz封闭1小时。

封闭结束后用PBST冲洗，分别用CD9抗体、CD63抗体、CD81抗体及Calnexin抗体4℃过夜孵育。

PBST洗膜(80Hz)三次，每次10min。5％脱脂牛奶稀释荧光二抗山羊抗兔IgG(1:2000)，室温避光孵育2h。再用PBST洗膜(80Hz)三次，每次10min。

6)化学发光检测

二抗孵育结束后，弃除二抗后，分别用TBST和TBS洗膜。使用Odysseyclx红外荧光成像仪进行曝光，导出图像并保存。结果如图3所示，CD9、CD63、CD81三种外泌体标志蛋白均为阳性，Calnexin蛋白为阴性，因此通过以上检测，可以确定所提取的为外泌体。

实施例4.miRNA提取(miRNeasy Micro Kit试剂盒法)

采用miRcute血清/血浆miRNA提取试剂盒，根据相关说明分离血清外泌体RNA，具体步骤如下：

(1)样品裂解：外泌体样本中加入4倍体积的裂解液MZA，颠倒混匀。

(2)样本于室温放置5分钟，使核酸蛋白复合物分离。

(3)加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置5分钟。

(4)12,000rpm(～13,400×g)，4℃，离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，白色的中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中，进行下一步操作

(5)量取转移液的体积，缓慢加入转移液2倍体积的无水乙醇，混匀。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute，室温放置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，离心后弃掉流出液，保留吸附柱miRelute。

(6)向吸附柱miRelute中加入700μl去蛋白液MRD，室温静置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液。

(7)向吸附柱miRelute中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液。

(8)重复步骤7一次。

(9)室温12,000rpm(～13,400×g)离心，离心后将吸附柱miRelute在室温放置片刻，晾干。

(10)将吸附柱miRelute转入一个新的RNase-Free 1.5ml离心管中，向吸附膜中心位置加15-30μl RNase-Free ddH

实施例5.血清外泌体miRNA的实时荧光定量PCR

反转录反应

(1)将RNA样本从-80℃冰箱中取出，将样本及所需试剂置于冰上解冻，试剂组分及使用量如下表所示。

(2)按如下程序进行反转录：

将如上反应体系混合后进行短暂离心，放入普通PCR仪进行逆转录反应。逆转录反应如下：37℃孵育15分钟，85℃酶灭活5分钟。用Rnase-free water将逆转录后的cDNA定容至100μl，保存于-20℃冰箱备用。

定量PCR检测

(1)将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。

(2)冰上配制下表中的反应液

(3)将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。

(4)采用三步法程序进行反应：

相对定量△△Ct分析

待反应结束后，使用Real-time PCR扩增曲线对设计的引物进行检测，采用ΔΔCT法分析miRNA在OMG外周血中的相对表达量：

A＝CT(目的基因，实验样本)-CT(内标基因，实验样本)

B＝CT(目的基因，对照样本)-CT(内标基因，对照样本)

K＝A-B

表达倍数＝2-K

在本实验中，使用Primer 6.0软件进行引物设计，并使用GAPDH作为内参。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列如下表：

表1miR-3614-3p与靶基因的对应关系(使用miRTarBase、TargetScan和miRDB对miR-3614-3p进行靶基因的预测)

对miR-320d在OMG和健康对照组的血清外泌体中的表达进行了RT-qPCR验证。OMG和健康对照组中miR-3614-3p的相对表达量如图4所示，与健康对照组相比，miR-3614-3p显著下调，miR-3614-3p的相对表达量存在差异且p值＜0.05(p＝0.02881)，说明miR-3614-3p在OMG和健康对照组间的差异具有统计学意义。

分别对OMG和健康对照组的miR-4712-3p进行了ROC曲线分析。OMG和健康对照组中miR-3614-3p的ROC曲线图如图5所示，miR-3614-3p对OMG诊断效能AUC值0.790(＞0.7)，具有较高的准确性。

综述所述，本发明通过提取OMG和健康对照组的血清外泌体miRNA并进行深度测序及验证，结合生物信息学分析方法，结果表明，与健康对照组相比，OMG患者血清外泌体的miR-3614-3p水平显著下降，在OMG和健康对照组间的差异具有统计学意义，经过验证具有良好的诊断效能，灵敏度及特异性更高，与由此可见，血清外泌体来源的miR-3614-3p可以作为OMG诊断性生物标记物应用，以减少OMG的漏诊误诊。

以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。