紫外分光光度法测定GOD活性的方法

摘要

本发明提供紫外分光光度法测定GOD活性的方法，涉及GOD活性测定技术领域。该紫外分光光度法测定GOD活性的方法，具体包括以下步骤：S1.仪器试剂预备；S2.酶活度测定；S3.曲线分析；S4.测定波长及H2O2工作曲线方程；S5.H

说明书

技术领域

本发明涉及GOD活性测定技术领域，具体为紫外分光光度法测定GOD活性的方法。

背景技术

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)是一种高效高度专一的生物催化剂，广泛存在于动物、植物和微生物体内，微生物中的主要生产菌株有黑曲霉和青霉。在GOD生产、使用和研发过程中，需要不定期进行酶活性检测，目前常用检测方法有滴定法、电化学法和连续分光光度法，上述方法均因其稳定差、灵敏度不高、过程复杂等不足而难以推广，限制了其在医药卫生领域的应用。因此建立一种高效、快速、实用、低成本的检测方法，是GOD研发生产中迫切要解决的问题。

“惠瑶瑶，郑斐，王倩楠等.一种检测GOD活力的新方法[J].食品与发酵工业，2020,46(09):255-259”最新开发建立了一种新的GOD活性测定方法：碘－淀粉分光光度法。以葡萄糖为底物，利用GOD专一性催化氧化作用生成中间产物H

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了紫外分光光度法测定GOD活性的方法，解决了现有的检测方法操作过程过于复杂，影响检测效率的问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：紫外分光光度法测定GOD活性的方法，具体包括以下步骤：

S1.仪器试剂预备

预备紫外可见分光光度计，GOD工作液、GOD标准液、H

S2.酶活度测定

在10mL比色管中加入0.1mo l/L葡萄糖1.00mL，用微量取样器准确取GOD样品液100μL与其混合，加磷酸盐缓冲液2.00mL，37℃温育30mi n后立即加入3mo l/LH

S3.曲线分析

按照步骤S2的实验方法，以蒸馏水为参比，分别对葡萄糖、KI、H

S4.测定波长及H2O2工作曲线方程

用1×10—

S5.H

用1×10—

S6.酶催化反应条件优化

进行底液葡萄糖体积的确定、酶催化氧化反应时间考察和酶催化反应终止剂选择。

S7.酶样共存物质的干扰

取5.25×10

S8.方法验证

进行线性实验和精密度实验。

优选的，所述步骤S1中试剂详细的为GOD工作液：2.50×10—

优选的，所述步骤S6中底液葡萄糖体积的确定为取5.25×10

优选的，所述步骤S6中酶催化氧化反应时间考察为取5.25×10-2U/mLGOD标准液100μL，仅改变酶催化氧化反应时间，按步骤S2方法测定吸光度。

优选的，所述步骤S8中线性实验为配制0.00、0.01、0.02、0.03、0.04、0.06、0.08U/mLGOD标准系列，按步骤S1中方法测定酶活性。

优选的，所述步骤S8中精密度实验为连续10次对2.5×10—3mg/mLGOD工作液活性进行测定。

(三)有益效果

本发明提供了紫外分光光度法测定GOD活性的方法。具备以下有益效果：

本发明提供了紫外分光光度法测定GOD活性的方法，本发明依据紫外分光光度法测定GOD活性的机理在O

附图说明

图1为本发明不同组成溶液紫外光谱；

图2为本发明不同浓度H

图3为本发明不同峰位H

图4为本发明氧化反应时间与吸光度图；

图5为本发明酶催化氧化反应时间与吸光度图；

图6为本发明硫酸体积与酶灭活试验图；

图7为本发明实测结果和理论设定值线性拟合图；

图8为本发明硫酸体积与吸光度图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例：

如图1-8所示，本发明实施例提供紫外分光光度法测定GOD活性的方法，具体包括以下步骤：

S1.仪器试剂预备

紫外可见分光光度计(UH5300)。

GOD工作液：2.50×10—

葡萄糖、磷酸盐缓冲液、蒸馏水在实验前37℃预热20mi n；

S2.酶活度测定

在10mL比色管中加入0.1mo l/L葡萄糖1.00mL，用微量取样器准确取GOD样品液(<0.10U/mL)100μL与其混合，加磷酸盐缓冲液(pH7.0)2.00mL，37℃温育30mi n后立即加入3mo l/LH

酶样液活度计算公式如下：

X:GOD活性，单位U/mL

A：吸光度(扣除酶空白)

t：酶催化氧化反应时间，t＝60min

f：稀释倍数，f＝10

1000：单位换算系数

ε：288nm波长处H

(mol·cm)

V

S3.曲线分析

按照步骤S2的实验方法，以蒸馏水为参比，分别对葡萄糖、KI、H

图1的不同组成溶液紫外光谱，Fig1.Ultraviolet spectra of solutions withdifferent compositions，a.葡萄糖；b.KI；c.H

S4.测定波长及H2O2工作曲线方程

用1×10—

扫描结果见图2的不同浓度H

图2表明，两峰吸光度仅与H

表1：吸光度与H

Table 1:H

结果表明，在288nm和352nm两波长处，吸光度与H

S5.H

用1×10—

H

S6.酶催化反应条件优化

底液葡萄糖体积的确定

取5.25×10

酶催化氧化反应时间考察

取5.25×10

酶活度体现了的是H

此外，在无酶(酶催化氧化反应时间为0mi n)情况下，同条件下溶液吸光度A＝0.157，

这说明酸性情况下溶解氧依然带来的副反应：O

酶催化反应终止剂选择

比较3种常用终止剂H

S7.酶样共存物质的干扰

取5.25×10

S8.方法验证

线性实验

配制0.00、0.01、0.02、0.03、0.04、0.06、0.08U/mLGOD标准系列，按步骤S1中方法测定酶活性。以理论设定值作为x值，实测值作为y值进行回归分析，测定结果见图7。实测结果和理论设定值线性相关性良好，y＝1.02x，R＝0.9970。斜率接近于1，截距接近于0，说明方法有较高的准确度。

精密度实验

连续10次对2.5×10—

表2精密度实验

Table2Testforprecision

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。