茶多酚作为解毒剂在蜜蜂抗杀虫剂中毒中的应用

摘要

本发明公开了茶多酚作为解毒剂在蜜蜂抗杀虫剂中毒中的应用，可以缓解新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的毒性。茶多酚(tea polyphenol)是茶叶中多酚类物质的总称，包括儿茶素类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。一方面，茶多酚可以改善蜜蜂学习能力、嗅觉记忆以及爬行能力，另一方面茶多酚可以显著提高蜜蜂的存活率以及食物消耗量，减少蜜蜂体内的毒素积累。茶多酚抗菌杀毒的作用使其有望成为防治杀虫剂的新型生物活性分子，为感染性毒性防控研究提供新思路。本发明所公开的茶多酚作为解毒剂在蜜蜂抗杀虫剂中毒中的应用可用于缓解新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的危害，且具有明显的解毒效果。

说明书

技术领域

本发明涉及解毒剂技术领域，尤其涉及一种茶多酚作为解毒剂在蜜蜂抗杀虫剂中毒中的应用。

背景技术

蜜蜂在整个生态系统中，起到了非常重要的作用。蜜蜂为植物进行授粉保证了开花植物的遗传多样性，维持了生态平衡，维持了植物种类的多样性，同时提高了农作物的产量和质量；蜜蜂还提供蜂蜜、蜂胶、蜂王浆等蜂产品，为各项工业、民用等产品提供基础原材料，保证国民身体健康。

新烟碱类杀虫剂自20世纪80年代上市以来便受到广泛应用，新烟碱类杀虫剂作用于昆虫中枢神经系统中烟碱型乙酰胆碱受体，通过高效阻断昆虫的正常神经传递致使昆虫死亡，是全球用量最大的杀虫剂品种，登记国家超过120个。传统新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的种群危害十分严重，不仅长期残留在蜜蜂脑内，影响其学习能力和采集活动，还会降低蜜蜂的生存能力，缩短其寿命。所以研究如何缓解新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的危害迫在眉睫。

茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称，包括儿茶素类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等，其中儿茶素类化合物为茶多酚的主体成分，具有强效的抗菌与杀毒作用，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、DNA病毒及RNA病毒都具有抑制活性。由于茶多酚无毒副作用，具有保健功能，对机体无刺激等特点，因此被广泛应用于食品化工、医疗卫生等行业。茶多酚抗菌杀毒的作用使其有望成为防治疾病的新型生物活性分子，为感染性疾病防控研究提供新思路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种茶多酚作为解毒剂在蜜蜂抗杀虫剂中毒中的应用。茶多酚能显著提高新烟碱类杀虫剂危害下蜜蜂的存活率，降低其死亡率。茶多酚能够抑制蜜蜂体内农药毒性，降低抗氧化酶、解毒酶等活性；同时，还能提高蜜蜂学习记忆、爬行能力以及食物摄取量。茶多酚可用于误食残留在花粉中新烟碱类杀虫剂的蜜蜂，对于养蜂产业具有重要意义，具有良好的市场应用价值。

为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

第一方面，提供茶多酚或其同源异构体在制备用于治疗或预防蜜蜂中毒的药物中的应用。

第二方面，提供茶多酚或其同源异构体在制备用于治疗或预防蜜蜂中毒的饲料中的应用。

第三方面，提供茶多酚或其同源异构体在抑制蜜蜂致病真菌增殖中的应用。

第四方面，提供茶多酚或其同源异构体在制备用于新烟碱类杀虫剂的解毒剂中的应用。

第五方面，提供茶多酚或其同源异构体在制备用于提高蜜蜂解毒能力的药物中的应用。

进一步地，药物、饲料或解毒剂的活性成分包括茶多酚或其同源异构体中的一种或多种。还可包含除茶多酚以外的其它能够提高蜜蜂免疫力或抗真菌能力的活性成分。

进一步地，药物还可包含药学领域允许的辅料；药物的剂型可为药学领域允许的任意剂型。

进一步地，饲料可包含茶多酚，也可包含茶多酚和其同源异构体中的多种；还可包含除茶多酚以外的其它活性成分(例如：其它能够提高蜜蜂免疫力或抗病毒能力的活性成分)；除上述活性成分外，饲料还可包含蜜蜂所需的营养物质，例如：花粉、蜂王浆、糖类、酵母粉、无机盐、维生素、水等。

第六方面，提供一种用于治疗或预防蜜蜂中毒的产品，该产品的活性成分包括茶多酚或其同源异构体中的一种或多种；产品为药物、饲料或饲料添加剂。

本发明的有益效果在于：

1.本发明首次发现茶多酚能够显著提高误食新烟碱类杀虫剂呋虫胺的蜜蜂的存活率，降低其死亡率。本发明的实验结果表明，使用茶多酚后误食新烟碱类杀虫剂的蜜蜂的死亡率大幅下降，且解毒后的的蜜蜂也很健康；同时，茶多酚饲喂后中毒蜜蜂食物消耗量上升；茶多酚饲喂后蜜蜂学习记忆和爬行能力均显著上调，降低了解毒酶以及抗氧化酶等活性，茶多酚干预可以改善表观健康蜜蜂杀虫剂中毒程度，有助于蜜蜂的正常采蜜。

2.本发明提供了茶多酚对于蜜蜂新烟碱类杀虫剂感染的新功能并为蜜蜂免疫防御机制的研究提供基础。茶多酚可应用于制备防治杀虫剂或提高蜜蜂免疫力的药物或饲喂料，为防治杀虫剂提供了新方法，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1为茶多酚干预健康蜜蜂和染毒蜜蜂后的存活率和死亡率分析示意图；

图2为茶多酚干预染毒蜜蜂后食物消耗量分析示意图；

图3为茶多酚干预对蜜蜂蔗糖敏感性以及嗅觉学习和记忆行为的影响示意图；

图4为茶多酚干预对蜜蜂爬行能力的影响示意图；

图5为茶多酚干预对蜜蜂酶活的影响示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1利用茶多酚干预健康蜜蜂和中毒蜜蜂

1、供试样本

意大利蜜蜂来自中国养蜂研究所的养蜂场(N39♀59035.3300，E116♀11059.7400)。测试蜜蜂是健康的，它们在实验前没有接触过杀虫剂。

2、糖浆的制备

糖浆的制备与饲喂，参照2016年饲喂意大利蜜蜂幼虫的标准并在此基础上进行调整(Karl Crailsheim,Robert Brodschneider,Pierrick Aupinel,Dieter Behrens,ElkeGenersch,Jutta Vollmann&Ulrike Riessberger-Gallé.Standard methods forartificial rearing of Apis mellifera larvae.Journal of Apicultural Research,2013,52(1):1-15.)。

3、茶多酚的制备

用灭菌后的超纯水配制成1g/l的母液后备用。试验时按各日龄需要用蜜蜂饲料进行、稀释，得到茶多酚高低两个浓度(茶多酚高浓度-100mg/kg；茶多酚低浓度-20mg/kg)。

4、新烟碱类杀虫剂呋虫胺制备

用灭菌后的超纯水配制成1mg/ml的母液后备用。试验时按各日龄需要用蜜蜂饲料进行、稀释，呋虫胺饲喂浓度取急性暴露48h后的LC10。

5、蔗糖敏感性行为测试

在饲养的第14天，从每个处理组随机选取24只刚出房的蜜蜂进行伸喙反应(PER)的行为测试。将测试蜜蜂先饥饿处理4小时后，将蜜蜂固定在空心塑料管中，保证其身体固定，头部露在管外并且可以自由活动。首先进行蜜蜂对不同浓度蔗糖敏感性的测试：使用装有浓度为0.3％、1％、％、10％、30％蔗糖溶液的尖头棉签分别依次靠近蜜蜂触角3s，测试记录每只蜜蜂是否会主动发出伸喙反射，每个测试浓度间隔2分钟，在测试过程中蜜蜂没有真正食用糖水。待测试完毕后，给予蜜蜂1μl 30％的糖水。

6、蜜蜂学习、记忆行为测试

在蜜蜂对不同浓度蔗糖溶液敏感性行为测试之后，接下来对蜜蜂进行学习和记忆行为的检测，由于蜜蜂对蔗糖溶液具有正常敏感反应是测试学习记忆能力的基础，那些对任何浓度蔗糖溶液都没有伸喙反射行为的蜜蜂在学习记忆行为测试中被剔除了。然后再进行学习和记忆行为测试，首先进行气味学习，用棉签蘸取芳樟醇，接触蜜蜂触角3s，记录伸喙反应。测试分为2个阶段，(1)条件刺激阶段(CS)：保持蜜蜂接触芳樟醇，同时接触蜜蜂3s，同时在第3s时给予蜜蜂蔗糖溶液作为奖励。(2)无条件刺激阶段(US)：保持主气流和气味刺激气流开放3s，无蔗糖溶液作为奖励，观察蜜蜂是否主动发生伸喙反射。

学习能力测试：蜜蜂每完成1次条件刺激后进行无条件刺激测试，检验其是否主动发生伸喙反射，记录每只蜜蜂首次发生伸喙反射时使用条件刺激的次数。

记忆能力测试：蜜蜂重复3次学习能力测试后，再次对蜜蜂进行无条件刺激测试，检验其是否主动发生伸喙反射并记录。每次记忆能力检测结束后将固定好的蜜蜂放回培养箱内，并且保持每1小时喂食蜜蜂一小部分的蔗糖溶液以用来维持蜜蜂正常生理反应。

7、蜜蜂爬行能力测试

根据蜜蜂的趋光性，利用自制的爬行装置来测定蜜蜂的爬行能力，即在光源的引导下，记录从黑暗的下部爬到上部的时间。

8、蜜蜂体内酶活的变化

每个处理随机选取12只蜜蜂，用液氮速冻，在研钵中快速将组织磨成粉末，转移至1.5ml离心管，加入生理盐水，于冷冻高速离心机中2500转/分4℃离心10min，取上清，制备成粗酶液，置冰上待测。蛋白含量测定采取BCA蛋白浓度检测法，SOD、POD、ACHE、CAT、GSH、GR、NAD-MDH、LPO活性的测量均按照南京建成试剂盒说明书测量。

9、试验

从群势强无明显疾病症状且无农药污染的健康蜂群提取一张即将出房的封盖子脾，装入限王产卵框中，在恒温培养箱中培养，在培养箱中培养24h后，收集足够数量刚出房的幼蜂，随机分为7组，ck对照组，cr溶剂对照组，dig是呋虫胺+高浓度茶多酚处理组、did是呋虫胺+低浓度茶多酚处理组、dis是呋虫胺+蔗糖溶液处理组、stg是蔗糖溶液+高浓度茶多酚处理组、std是蔗糖溶液+低浓度茶多酚处理组、每组30只样本，重复三次。对照组14d只饲喂蔗糖溶液；dig、did、dis三个处理组前七天饲喂呋虫胺，处理7d后分别饲喂100mg/ml的茶多酚、20mg/ml的茶多酚和50％的糖水；stg、std三个处理组前七天饲喂蔗糖溶液，处理7d后分别饲喂100mg/ml的茶多酚、20mg/ml的茶多酚，溶剂对照组饲喂掺有DMSO的蔗糖溶液，暴露14天，观察并记录蜜蜂的摄食情况和死亡率，并检测蜜蜂的学习记忆能力和爬行能力。

实施例2茶多酚干预健康蜜蜂和染毒蜜蜂后的存活率和死亡率分析

如图1所示，只饲喂糖水和茶多酚的对照组的蜜蜂存活率都能达到80％以上，说明茶多酚干预不会造成健康蜜蜂的异常死亡，不影响健康蜜蜂的生长发育。结果显示，采用茶多酚干预能够使染病蜜蜂免于病死，使中毒蜂群免于崩溃，对蜂群的恢复和繁衍起到了重要作用。

对实施例1中的各组蜜蜂蜜蜂进行死亡率统计，蜜蜂死亡率的测定方法如下：预培养及感染当日的蜜蜂死亡数不计入分析，以排除实验过程中蜜蜂机械致死的影响，从感染次日开始每天定时对蜜蜂的死亡数进行统计，并移除死亡蜜蜂，重复上述步骤至14日龄结束。

每日蜜蜂死亡率＝每天蜜蜂的死亡数量/每天蜜蜂存活的数量×100％；

全过程蜜蜂死亡率＝蜜蜂死亡数量/样本总数×100％。

结果显示，常规饲喂的对照组蜜蜂每天的死亡率很低，茶多酚干预后蜜蜂每天死亡率无变化，说明茶多酚干预不影响蜜蜂的生长发育，可以用于蜜蜂的辅助饲喂。蜜蜂杀虫剂处理后死亡率大幅上升。到7日龄时实验蜜蜂仅有大约50％成功存活。与处理组相比，茶多酚干预后各日龄蜜蜂死亡率大幅下降，到7日龄时蜜蜂存活率高达到80％以上。结果表明，采用茶多酚干预能够大幅减少染毒蜜蜂的病死率，使染病蜂群免于崩溃，对蜂群的恢复和繁衍起到了重要作用。

实施例3茶多酚干预染毒蜜蜂后食物消耗量

对实施例1中处理组、对照组蜜蜂进行检测，如图2所示，发现未经茶多酚干预的处理组中蜜蜂食物消耗量大幅度减少。说明饲喂杀虫剂后感染蜜蜂体内产生了中毒反应，而茶多酚干预后蜜蜂食物消耗量明显升高，说明喂食茶多酚缓解了了杀虫剂对蜜蜂的毒性，从而改善了了蜜蜂的食欲。

实施例4茶多酚干预对蜜蜂蔗糖敏感性以及嗅觉学习和记忆行为的影响

为分析茶多酚干预对于蜜蜂嗅觉记忆及学习记忆的影响，采用不同浓度的蔗糖对实施例1中各组蜜蜂进行检测。如图3所示，在呋虫胺处理后，dis处理组的伸喙率明显低于dig与did处理组，在加入茶多酚后，伸喙率明显升高，几乎与ck组持平；同时，ck组加入茶多酚后其学习记忆率也略高于ck组。同样地，也是在呋虫胺处理组出现学习记忆下降的结果，在加入茶多酚后出现升高。结果表明，茶多酚具有明显的抑菌和抗病毒等功效作用，可有效清除体内自由基及毒素；保护细胞免受自由基侵害、抑制病原菌的增殖，具有较好的抗应激作用，缓解应激引起的生产性能下降。

实施例5茶多酚干预对蜜蜂爬行能力的影响

如图4所示，在加入茶多酚后蜜蜂的爬行能力明显高于呋虫胺处理组，且加入茶多酚干预后爬行时间也略低于对照组。结果表明茶多酚可以改善喂食呋虫胺后的损伤，减少蜜蜂爬行时间。

实施例6茶多酚干预对蜜蜂酶活的影响

如图5所示，慢性暴露14d后，从图中可以看出喂食呋虫胺组几乎显著的升高了各个酶活，然而茶多酚干预后，各个酶活显著降低。结果显示茶多酚干预后，蜜蜂体内的抗氧化酶以及解毒酶等酶活显著下降，说明茶多酚在蜜蜂体内起到一定的抗氧化以及解毒作用。

本发明以杀虫剂处理的的蜜蜂为研究对象，利用蜜蜂对不同浓度糖水的敏感程度和学习情况，对茶多酚在杀虫剂中毒和健康蜂蜜蜂发育阶段的表达情况进行了记忆检测，以及喂食茶多酚后食物消耗量的增长，明确了茶多酚的解毒能力；茶多酚干预强烈抵御了杀虫剂对蜜蜂的侵害，减少了蜜蜂的病死率，形成一种快速有效的防御机制，用来迅速杀死或清除外源的病原微生物，保护蜜蜂的正常采蜜。

综上所述，茶多酚能够提高机体免疫力，提高消化吸收率，促进动物体生长。另一方面，茶多酚还有明显的抗氧化、抑菌和抗病毒等功效作用，可有效清除体内自由基及毒素；保护细胞免受自由基侵害、促进新陈代谢，抑制病原菌的增殖，具有较好的抗应激作用，缓解应激引起的生产性能下降。因此可用于预防和治疗蜜蜂杀虫剂中毒。

根据茶多酚对于缓解蜜蜂中毒的作用，含有酚类化合物结构、能够在体内代谢产生酚类的物质或是其他酚类衍生物也应具有相同的作用。本发明所述含有酚类化合物结构的衍生物包括酚类、黄酮、异黄酮、鞣酸等多种类型化合物。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。