一类肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽及其制备方法

摘要

本发明公开了一类肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽及其制备方法，属于生物化学领域。一类肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽是通过在齐考诺肽不同位点的赖氨酸K侧链用肉豆蔻醛进行修饰，得到单位点和双位点修饰的齐考诺肽。本发明以齐考诺肽、肉豆蔻醛、氰基硼氢化钠为原料，通过醛的还原胺化反应得到一类肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽。本发明方法所涉制备步骤操作简单，无需复杂的仪器设备，可为多肽修饰与镇痛药物的研究提供参考。

说明书

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一类肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽及其制备方法。

技术背景

ω-芋螺毒素是海洋生物芋螺分泌的毒液中所含有的一类小分子活性肽，属于O-芋螺超家族的成员。齐考诺肽是ω-芋螺毒素的合成等效物，是特异性N型电压敏感型钙通道拮抗剂，于2004年批准上市，用于难治性慢性疼痛的治疗，临床上其通过鞘内注射途径给药。

但齐考诺肽使用后不良反应较为严重，头晕、恶心呕吐、嗜睡和虚弱无力是该药最常见的不良反应。在112名应用该药治疗的患者中，有47％出现头昏，41％出现恶心呕吐，22％出现嗜睡和虚弱无力。其他常见不良事件还包括腹泻、共济失调、异常步态等。该药大多数不良反应都是剂量依赖性的，可随着剂量的降低而消退，因此临床上主要通过连续输注的方式缓慢给药。

为了高效利用多肽类药物，人们尝试对多肽药物进行修饰和改造，将修饰基团的性质赋予药物，有助于研发更多具有实际意义的治疗性药物，减轻病患痛苦，如糖基化修饰、融合长效化片段、聚乙二醇修饰、缀合脂肪酸链等策略。其中脂肪酸是构成人体脂肪、类脂和细胞膜磷脂的重要成分，可有助于提高药物的脂溶性，增强药物与受体的结合。亲水作用力和疏水作用力是两亲性肽自组装的主要驱动力，亲水性的齐考诺肽经过疏水性的烷基链修饰后会变成两亲性肽。齐考诺肽的亲水、疏水部分会自发地根据亲疏水力靠近或远离，齐考诺肽由此可以被赋予自组装的性能，在自组装驱动力下可形成不同形态的齐考诺肽纳米自组装体，有望会展现出缓慢释放、药效作用时间长等优良性能。

目前关于齐考诺肽的修饰制备技术少有报道，本发明旨在解决齐考诺肽的修饰及其制备方法，使得其缓慢释放、药效作用时间长并减少不良反应。

发明内容

本发明的目的是解决现有齐考诺肽的修饰制备技术的不足，提升齐考诺肽在镇痛领域的应用问题，提供一类用肉豆蔻醛对不同位点赖氨酸K侧链进行修饰的齐考诺肽及其制备方法，以齐考诺肽、肉豆蔻醛、氰基硼氢化钠为原料，通过醛的还原胺化反应得到单位点、双位点肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽的方法。

其氨基酸序列如下表1所示：

表1肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽氨基酸序列

其中，肉豆蔻醛又名十四烷醛，C14表示十四碳的烷基链，*表示C端酰胺化。

本发明中一类肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽的制备方法步骤如下：

步骤1：按照1:1～1:3的摩尔比分别称取齐考诺肽和肉豆蔻醛于容器中，用含乙酸的甲醇溶液分别进行溶解，溶解后将两份溶液进行混合得到第一混合液，第一混合液搅拌均匀后加入3～5倍多肽摩尔当量的氰基硼氢化钠，然后继续搅拌至均匀，得到第二混合液；向第二混合液中加入饱和氯化铵水溶液淬灭氰基硼氢化钠并搅拌均匀，离心后取上清液；

步骤2：以高效液相色谱对上清液进行纯化制备，收集纯化的洗脱液；

步骤3：将收集的洗脱液通过旋转蒸发后冷冻干燥，得到肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽。

优选地，所述步骤1中，所述含乙酸的甲醇中乙酸的质量分数为0.5％～3％。

进一步地，所述步骤1中，所述第一混合液在15℃～35℃下磁力搅拌3～5h；第一混合液中加入4倍多肽摩尔当量的氰基硼氢化钠粉末后继续搅拌2～3h。

进一步地，所述步骤1中，第二混合液中加入约50mM的饱和氯化铵水溶液淬灭氰基硼氢化钠后，磁力搅拌15～30min。

进一步地，所述步骤1中，离心速度为1000～12000rpm，时间为10～20min。

优选地，所述步骤2中，所述高效液相色谱纯化所用流动相中，A相为水+0.1％TFA，B相为乙腈+0.1％TFA。

进一步地，所述步骤2中，检测波长为220nm，色谱柱为YMC-Pack ODS-A色谱柱，柱温为25℃。

进一步地，所述步骤2中，进样量为2～4mL，以35％～80％的B相比例进行梯度洗脱，收集出峰时间在25～45min处的洗脱液。

优选地，所述步骤3中，冷冻干燥条件为-40℃～-80℃。

本发明的有益效果：

(1)制备方法具有操作简单，无需复杂的仪器设备等特点。

(2)制备方法最高总收率可达45％，纯度均达到90％以上。

(3)可为多肽修饰与镇痛药物的研究提供参考。

附图说明

图1肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽K2-MVIIA的液相色谱图

图2肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽K2-MVIIA的质谱图

图3肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽K2-MVIIA的液相色谱图

图4肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽K2-MVIIA的液相色谱图

图5肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽K2-MVIIA的液相色谱图

图6肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽K2-MVIIA、K2+K4-MVIIA、K2+K7-MVIIA、K2+K24-MVIIA的液相色谱图

图7肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽K2+K4-MVIIA、K2+K7-MVIIA、K2+K24-MVIIA的质谱图

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1：肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽K2-MVIIA的制备方法1

本发明利用肉豆蔻醛的醛基与齐考诺肽序列中赖氨基酸K侧链上的伯胺反应形成席夫碱，再进一步用氰基硼氢化钠NaBH

步骤一、按照1:1的摩尔比分别称取3mg的齐考诺肽和0.24mg的肉豆蔻醛样品于透明螺口玻璃瓶中，用含1％乙酸的甲醇溶液进行溶解，两者进行混合涡旋，室温下磁力搅拌3h，加入0.28mg的氰基硼氢化钠搅拌反应2h。使用一次性吸管滴加3-5滴饱和氯化铵水溶液淬灭氰基硼氢化钠，磁力搅拌15min，12000rpm离心15min取上清进行液相分析。

步骤二、使用高效液相色谱进行分析与质谱鉴定，液相分析条件为：a)流动相：A相为纯净水+0.1％TFA，B相为乙腈+0.1％TFA。0.22μm水膜/有机膜过滤后超声除气泡30min；b)色谱柱的选择：C18分析色谱柱型号为ZORBAX SB-C18，4.6×250mm，5μm；c)检测波长：220nm；d)流速:1mL/min；e)柱温：25℃；f)进样量：20μL。以10％～80％的B相梯度洗脱，液相色谱分析结果如图1所示，收集出峰时间在40min处的洗脱液。将收集的洗脱液进行质谱分析，质谱检测条件为ESI离子源，正离子，Scan全扫描检测模式，Fragmentor电压135V，其质谱结果如图2所示。由图2可得图1中40min处的洗脱液经过质谱分析检测到了二价母离子1418.164、三价母离子945.779、四价母离子709.586、五价母离子567.870、六价母离子473.393，经计算与SEQ ID NO.1所示K2-MVIIA肽的相对分子质量2833.33Da相一致。

步骤三、使用制备型高效液相色谱进行纯化，使用YMC-Pack ODS-A色谱柱，进样量为2mL，以35％～80％的B相比例进行梯度洗脱，收集出峰时间在25～30min处的洗脱液，经-80℃冷冻干燥得到粉末样品，液相分析其纯度大于90％。

实施例2：肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽K2-MVIIA的制备方法2

按照1:0.5的摩尔比分别称取3mg的齐考诺肽和0.12mg肉豆蔻醛样品于透明螺口玻璃瓶中，具体操作步骤同实施例1中步骤一和步骤二，液相色谱分析检测结果如图3所示。

实施例3：肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽K2-MVIIA的制备方法3

按照1:3的摩尔比分别称取3mg的齐考诺肽和0.72mg肉豆蔻醛样品于透明螺口玻璃瓶中，具体操作步骤同实施例1中步骤一和步骤二，液相色谱分析检测结果如图4所示。

实施例4：肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽K2-MVIIA的制备方法4

按照1:10的摩尔比分别称取3mg的齐考诺肽和2.4mg肉豆蔻醛样品于透明螺口玻璃瓶中，具体操作步骤同实施例1中步骤一和步骤二，液相色谱分析检测结果如图5所示。

本发明做了一系列对比实施例即实施例1-实施例4，通过高效液相色谱分析可知，在与实施例1相同的制备操作下，实施例2结果所示齐考诺肽会有少量剩余，并且K2-MVIIA肽的峰强度偏低。实施例3结果所示齐考诺肽已反应完全，K2-MVIIA肽的峰强度检测值也偏低。实施例4结果所示当肉豆蔻醛继续增加至肽与醛的摩尔比为1:10时，反应体系会变粘稠并且疏水性增强，导致无法检出信号峰。由此可知实施例1中肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽K2-MVIIA的制备方法1可以较好的得到K2-MVIIA肽，并且该制备方法简便快速，K2-MVIIA肽的最大回收率可达45％。

实施例5：肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽K2-MVIIA、K2+K4-MVIIA、K2+K7-MVIIA、K2+K24-MVIIA的制备方法

步骤一、按照1:2的摩尔比分别称取80mg的齐考诺肽和6.4mg肉豆蔻醛样品于透明螺口玻璃瓶中，用含1％乙酸的甲醇溶液进行溶解，两者进行混合涡旋，室温下磁力搅拌3h，加入7.47mg的氰基硼氢化钠搅拌反应5h。使用一次性吸管滴加5滴饱和氯化铵水溶液淬灭氰基硼氢化钠，磁力搅拌15min，12000rpm离心15min取上清进行分析。

步骤二、使用高效液相色谱进行分析与质谱鉴定。液相分析条件同实施例1，液相色谱分析结果如图6所示。由图6可知，按照1:2摩尔比的齐考诺肽与肉豆蔻醛发生修饰反应后我们可以收集到4个主要的洗脱峰，峰保留时间分别为40min、47min、51min、53min。根据峰保留时间进行定性分析，我们可以确定40min峰保留时间处对应的多肽应为K2-MVIIA。将收集到的47min、51min、53min洗脱峰处的洗脱液进行ESI-MS质谱检测，质谱检测条件同实施例1，质谱结果如图7所示。经计算出峰时间在的47min、51min、53min处的洗脱液所对应的相对分子质量与SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.4所示双位点修饰肽的理论相对分子质量3031.94Da相一致。

步骤三、使用制备型高效液相色谱进行纯化，步骤同上。将收集的洗脱液通过旋转蒸发除去乙腈，剩余洗脱液在-80℃条件下冷冻干燥，得到多肽粉末样品。可以同时得到一类肉豆蔻醛修饰的齐考诺肽，包括一个单位点和三个双位点的修饰肽，并且经分析型高效液相色谱检测各修饰肽纯度可达95.64％、92.64％、91.32％、91.63％。该制备方法操作简单，无需复杂的仪器设备，可为多肽修饰与镇痛药物的研究提供参考。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。