一种烟丝中游离型和结合型氨基酸的高效液相色谱串联质谱检测方法

摘要

本发明公开了烟丝中游离型和结合型氨基酸的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括：(1)总氨基酸含量的测定：将烟叶置于顶空瓶中，强酸酸化，高温加热后取出，冷却至室温后加入强碱中和，得总氨基酸的滤液；(2)游离氨基酸含量的测定：将烟叶置于顶空瓶，加入水溶液超声处理，得游离氨基酸的滤液；取总氨基酸的滤液或游离氨基酸滤液，加入内标溶液和衍生化试剂，恒温水浴，冷却至室温，加入有机试剂萃取，取下层溶液，LC‑MS/MS进样分析。本方法通过质谱检测器，检测灵敏度高，分析时间短，进样量少，具有对20种氨基酸衍生化产物和内标物衍生化产物特征离子分离和鉴定进行等优点，能定量测定烟丝中游离型氨基酸和结合型氨基酸的浓度。

说明书

技术领域

本发明涉及烟草技术领域，特别涉及一种烟丝中游离型和结合型氨基酸的高效液相色谱串联质谱检测方法。

背景技术

烟气中吡啶类、吲哚类化学成分主要来源于烟草中的氨基酸，因此，氨基酸的种类和含量也是决定烟草品质的一个重要方面。虽然，游离氨基酸对烟气成分的影响有少量文献报道，但烟草中绝大部分的氨基酸是以蛋白的形式存在的。因此，烟草中各种结合型氨基酸的相对量对烟气的成分和烟草品质有非常重要的影响。

通过对已发表论文整理分析发现，以往烟丝游离型和结合型氨基酸的检测具有前处理复杂、灵敏度低、分析时间长等缺点。因此有必要开发一种烟丝中游离型和结合型氨基酸的高效液相色谱串联质谱检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种烟丝中游离型和结合型氨基酸的高效液相色谱串联质谱检测方法，该方法通过简单有效的前处理方法处理烟丝样品，并在较短的测定时间内准确的检测烟丝样品中的游离型氨基酸和总的氨基酸，从而折算出结合型氨基酸的含量。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种烟丝中游离型和结合型氨基酸的高效液相色谱串联质谱检测方法，所述方法是通过柱前衍生化方法测定烟草中游离氨基酸含量和总氨基酸含量，从而折算出结合型氨基酸的含量，具体包括以下步骤：

(1)总氨基酸含量的测定：将烟叶置于顶空瓶中，加入强酸酸化，高温加热后取出，冷却至室温后加入强碱进行中和处理，得总氨基酸的滤液；

(2)游离氨基酸含量的测定：将烟叶置于顶空瓶中，加入水溶液超声处理，得游离氨基酸的滤液；

取总氨基酸的滤液或游离氨基酸滤液，加入内标溶液和衍生化试剂，恒温水浴后，取出冷却至室温，加入有机试剂萃取后，取下层溶液，LC-MS/MS进样分析；其中，液相色谱的条件为：

色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18，流动相：流动相A：水(含0.1％甲酸+10mM甲酸铵+1mM乙酸铵)，流动相B：乙腈，梯度洗脱：0.00-0.35min：B＝10％；0.50-1.50min：B从10％升至90％；1.50-3.00min：B＝90％；3.00-3.10min：B从90％降至10％；3.10-3.50min：B＝10％；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：10μL；质谱参数为电喷雾离子源，负离子模式，离子源参数如下：Capillary：2.50kV、Source Temp:150℃、Desolvation Temp：500℃、Desolvation(L/hr)：800L/Hr、Cone(L/hr)：50L/Hr，各氨基酸衍生化产物采用多反应监测方式进行检测。

优选地，步骤(1)中，所述强酸为12mol/L盐酸，所述酸化处理为：取烟叶置于顶空瓶中，加入12mol/L的盐酸并用纯氮气排尽顶空瓶中空气后迅速封瓶。

优选地，步骤(1)中，所述高温加热为110℃加热10h，所述强碱为6mol/L氢氧化钠，所述中和处理为：加入氢氧化钠，使滤液最终pH＝7.0。

优选地，步骤(2)中，所述超声处理为50赫兹，超声10min。

优选地，步骤(2)中，

所述内标溶液的配制方法为：将2-氨基丁酸粉末溶解在甲醇中作为内标储备液后，用1mol/L NaOH稀释内标储备液，使2-氨基丁酸的氢氧化纳浓度为0.1mg/mL；

所述衍生化试剂的配制方法为：吸取0.5mg/mL的异硫氰酸苯酯0.96mL置40mL胖管中，加入39.04mL乙腈溶解稀释，摇匀，即得0.2mol/L的异硫氰酸苯酯乙腈溶液。

优选地，步骤(2)中，

所述内标溶液的加入量：每200μL烟草滤液加入10μL 2-氨基丁酸的氢氧化纳浓度(0.1mg/mL)；

所述衍生化试剂的加入量：每200μL烟草滤液加入200μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液(0.2mol/L)。

优选地，步骤(2)中，所述恒温水浴的处理方式为：50℃水浴中反应45min。

优选地，步骤(2)中，所述有机试剂萃取为：每200μL烟草滤液加入正己烷500μL，涡旋震荡1min，室温14500rpm离心10min。

优选地，步骤(2)中，流动相A的水中包括：0.1％甲酸、10mM甲酸铵以及1mM乙酸铵。

优选地，各氨基酸衍生化产物采用多反应监测方式进行检测：各氨基酸衍生化产物和内标衍生化产物检测参数质荷比(m/z)信息见下表：

本发明上述技术方案，具有如下有益效果：

(1)本发明建立了同时测定20种氨基酸衍生化后的LC-MS/MS方法，实现了烟丝中20种氨基酸同时灵敏快速的检测。与传统的HPLC方法相比，极大的缩短了20种氨基酸同时检测的分析时间；一个样品的测定时间从原先的30多分钟缩减到3.5分钟。同时，该方法优化了烟丝样品的前处理步骤，在有毒试剂用量、前处理时间和温度上都体现了显著的优势；

(2)本发明方法对烟丝样本的需求样量少，只需0.1g样本即可完成检测；

(3)20种氨基酸衍生化产物在0.5-15μg/mL浓度范围内呈线性，且线性良好。

附图说明

被结合在说明书中并构成说明书的一部分的附图示出了本发明的实施例，并且连同其说明一起用于解释本发明的原理。

图1为PITC-Gly色谱图。

图2为PITC-Ala色谱图。

图3为PITC-Ser色谱图。

图4为PITC-Pro色谱图。

图5为PITC-Cys色谱图。

图6为PITC-Val色谱图。

图7为PITC-Thr色谱图。

图8为PITC-Ile色谱图。

图9为PITC-Leu色谱图。

图10为PITC-Asn色谱图。

图11为PITC-ASp色谱图。

图12为PITC-Gln色谱图。

图13为PITC-Lys色谱图。

图14为PITC-Glu色谱图。

图15为PITC-Met色谱图。

图16为PITC-His色谱图。

图17为PITC-Phe色谱图。

图18为PITC-Arg色谱图。

图19为PITC-Tyr色谱图。

图20为PITC-Try色谱图。

图21为PITC-2-ABA色谱图。

图22为PITC-Gly和PITC-Ala线性图。

图23为PITC-Ser和PITC-Pro线性图。

图24为PITC-Val和PITC-Thr线性图。

图25为PITC-Cys和PITC-Ile线性图。

图26为PITC-Leu和PITC-Asn线性图。

图27为PITC-Asp和PITC-Gln线性图。

图28为PITC-Lys和PITC-Glu线性图。

图29为PITC-Met和PITC-His线性图。

图30为PITC-Phe和PITC-Arg线性图。

图31为PITC-Tyr和PITC-Try线性图。

具体实施方式

现在来详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。

本申请公开了烟丝中游离型和结合型氨基酸的高效液相色谱串联质谱检测方法，通过质谱检测器，检测灵敏度高，分析时间短，进样量少，具有对20种氨基酸衍生化产物和内标物衍生化产物特征离子分离和鉴定进行等优点，实现定量测定烟丝中游离型氨基酸和结合型氨基酸的浓度。

实施例1

(一)氨基酸工作液的配制：

分别称取10mg的甲硫氨酸、组氨酸、酪氨酸、半胱氨酸，亮氨酸、谷氨酸、天冬酰胺一水合物、天冬氨酸用1mL(1M Hcl)溶解，得10mg/mL的储备液。称取10mg的色氨酸，用1mL(1M NaOH)溶解，得10mg/mL的储备液。分别称取10mg的异亮氨酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸，用1mL水溶解，得10mg/mL的储备液。

精密移取20种氨基酸储备液各2μL于1.5mL塑料管中，加入958μL水，涡旋混匀1min，得20μg/mL混合储备液。将混合储备液用水稀释成浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、12、15μg/mL的20种氨基酸混合标曲工作液。

(二)内标溶液的配制：

取2-氨基丁酸20mg，加约4mL甲醇溶解，得5mg/mL 2-氨基丁酸。取5mg/mL 2-氨基丁酸溶液20μL，加980μLNaOH(1M)，摇匀，得0.1mg/mL2-氨基丁酸。

(三)其他溶液的配制：

(1)氢氧化钠溶液(6mol/L)的配制：精密称取氢氧化钠8g置于50mL烧杯中，加入约33.3mL水溶解，并搅拌均匀。(2)氢氧化钠(1mol/L)的配制：取6mol/L 333μL，加入1667μL加入水稀释，摇匀。(3)异硫氰酸苯酯乙腈溶液(0.2mol/L)的配制：吸取异硫氰酸苯酯约0.96mL置40mL胖管中，加入乙腈溶解稀释至刻度，密塞，摇匀。

(四)水相配制：

加0.1mL的甲酸、1mL甲酸铵(10M)和0.1mL乙酸铵溶液(10M)到998.8mL的蒸馏水中，配制为终浓度为0.1％甲酸-10mM甲酸铵-1mM乙酸铵溶液作为水相。

(五)质谱参数：

液相条件：流动相：流动相A：水(含0.1％甲酸+10mM甲酸铵+1mM乙酸铵)，流动相B：乙腈，梯度洗脱：0.00-0.35min：B＝10％；0.50-1.50min：B从10％升至90％；1.50-3.00min：B＝90％；3.00-3.10min：B从90％降至10％；3.10-3.50min：B＝10％；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：10μL。

质谱仪型号：Waters TQS Micro质谱仪。质谱仪参数设定为：电喷雾离子源(ESI)；离子模式：负离子模式；监测模式：多反应监测(MRM)。设定原参数分比为：Capillary：2.50kV、Source Temp:150℃、Desolvation Temp：500℃、Desolvation(L/hr)：800L/Hr、Cone(L/hr)：50L/Hr；20种氨基酸衍生化产物和内标衍生化产物采用MRM方式检测，各氨基酸衍生化产物和内标衍生化产物检测参数质荷比信息见表1。

表1氨基酸衍生化产物检测参数质荷比(m/z)

(六)样品的定量检测：

(1)烟丝中游离氨基酸的样品定量检测：精密称取烟叶0.1g，加入5.5mL水，超声10min，过0.45μm滤膜。取200μL上述液体，加入2-氨基丁酸溶液10μL(浓度为0.1mg/mL，用1MNaOH溶解)，混合均匀。加入200μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液(0.2mol/L)，混匀，于50℃水浴中反应45min，然后取出冷却至室温。精密加入正己烷500μL，涡旋震荡1min，室温离心10min(14500rpm)。取下层溶液，LC/MS分析。

(2)烟丝中总氨基酸的样品定量检测：精密称取烟叶0.1g，置于10mL顶空瓶中，加入浓盐酸2mL，用纯氮气排尽顶空瓶中空气后迅速封瓶。在110℃条件下加热10h取出，冷却至室温，加入3.5mL的6mol/L的NaOH溶液，过0.45μm滤膜，取20μL上述液体，加180μL水稀释(稀释10倍)，加入2-氨基丁酸溶液10μL(浓度为0.1mg/mL，用1M NaOH溶解)，混合均匀。加入200μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液(0.2mol/L)，混匀，于50℃水浴中反应45min，然后取出冷却至室温。精密加入正己烷500μL，涡旋震荡1min，室温离心10min(14500rpm)。取下层溶液，LC/MS分析。

(3)氨基酸标准曲线的制备方法：精密移取200μL浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、12、15μg/mL的20种氨基酸混合工作溶液，每份样品加入2-氨基丁酸溶液10μL(浓度为0.1mg/mL，用1M NaOH溶解)，混合均匀。加入200μL异硫氰酸苯酯乙腈溶液(0.2mol/L)，混匀，于50℃水浴中反应45min，然后取出冷却至室温。精密加入正己烷500μL，涡旋震荡1min，室温离心10min(14500rpm)。取下层溶液，LC/MS分析。所得结果以待测物浓度为横坐标，待测物峰面积为纵坐标，用加权(W＝1/X)最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线。

氨基酸衍生化产物的线性范围为0.1 -15μg/mL。氨基酸衍生化产物的线性回归方程见表2；氨基酸衍生化产物的典型色谱图见图1～图20，内标衍生化产物的典型色谱图见图21，氨基酸衍生化产物标准曲线图见图22～图31。

表2 20种氨基酸衍生化产物的分析方法线性回归方程

(4)结合型氨基酸的计算：氨基酸和衍生化试剂是1：1反应的，因此氨基酸衍生化产物的量＝氨基酸的量，进而结合型氨基酸＝总氨基酸-游离型氨基酸。

本实施例方法能够准确定量0.1-15μg/mL浓度，且高浓度样品按照实施6(1)、(2)稀释10倍、100倍后测定范围0.1-15μg/mL浓度范围内仍可准确定量，稀释后实测浓度乘以10、100为样品最终浓度。

虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。