一种脱脂脱蛋白牦牛骨粉及其制备方法和应用、牦牛骨3D打印线材、牦牛骨纺丝纤维

摘要

本发明属于骨材料技术领域，具体涉及一种脱脂脱蛋白牦牛骨粉及其制备方法和应用、牦牛骨3D打印线材、牦牛骨纺丝纤维。本发明提供的制备方法包括：将牦牛骨进行蒸煮，得到预处理牦牛骨；将所述预处理牦牛骨于过氧化氢溶液中进行浸泡，得到脱蛋白牦牛骨；将所述脱蛋白牦牛骨进行粉碎，得到脱蛋白牦牛骨粉；将所述脱蛋白牦牛骨粉、脂肪酶和磷酸盐溶液混合，进行脂肪酶处理，得到所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉。本发明提供的制备方法选用高原牦牛骨，首先采用蒸煮法改变骨内脂肪的状态，经过过氧化氢溶液浸泡，使骨块松散，去除大量蛋白，再用脂肪酶浸泡、软化，最终达到优异的除脂效果，脱脂率可达97％，降低了所得脱脂脱蛋白牦牛骨粉的免疫原性。

说明书

技术领域

本发明属于骨材料技术领域，具体涉及一种脱脂脱蛋白牦牛骨粉及其制备方法和应用、牦牛骨3D打印线材、牦牛骨纺丝纤维。

背景技术

随着医学科学和外科技术的不断进步，无论是组织局部修复，还是整个器官的移植，移植修复技术成为恢复人体许多受损部位固有功能的潜在选择之一。然而，移植技术遇到了一些限制，如不断增长的需求远远超过供体对可用组织的实际可用性，以及供体组织可能受的污染。因此，需要一种新的技术来减少临床需求和健康组织或器官的可用性之间的差异。组织工程(Tissue Engineering，TE)是一种跨学科的方法，它利用细胞、生物活性因子和生物材料来恢复组织所需的功能。TE是基于医学、生物学、材料科学和工程学的原理，通过将它们整合到生物成分的设计中，以修复、维护和改善组织功能。

目前，在制备异种骨性材料时，通常选用的是将动物骨锻烧制备羟基磷灰石粉或者提取动物骨内的I型胶原蛋白，再与其他生物材料混合，从而达到具有一定生物活性或者在弹性模量上与人体相似的复合材料，这也是目前组织工程支架的主要方向。但是单一的羟基磷灰石、胶原蛋白、纤维素、脂肪酸等基质的应用，所制备的材料不能满足临床所需。而对于骨性材料最大的问题，来源于异种骨的免疫原性，脱脂可以除去哈佛氏管腔中的脂肪组织和基质中的脂蛋白成分，破坏细胞性抗原的完整性，同时还能减少异种骨的腥苦味，促进蛋白质的溶出，进而影响脱脂工序中总蛋白含量的变化。异种骨的气味部分来源于不饱和脂肪酸氧化所产生的物质，而高含量的脂肪会悬浮于细胞周围，从而阻碍蛋白质溶出，因此脱脂的品质将会间接影响异种骨抗原的去除。

对于动物骨脱脂，常用的选择是有机溶剂萃取法，例如采用乙醚、石油醚、氯仿和甲醇等，但容易造成有机溶剂残留，对成品产生影响；超临界流体萃取法，相对应用广泛，但造价昂贵，产能低；酶法脱脂，效率较低。上述方法的脱脂率均不理想，因此制备含脂量低的异种骨材料是目前的攻坚问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脱脂脱蛋白牦牛骨粉及其制备方法和应用、牦牛骨3D打印线材、牦牛骨纺丝纤维。本发明提供的制备方法提高了牦牛骨粉脱脂率，降低了免疫原性。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种脱脂脱蛋白牦牛骨粉的制备方法，包括以下步骤：

将牦牛骨进行蒸煮，得到预处理牦牛骨；

将所述预处理牦牛骨于过氧化氢溶液中进行浸泡，得到脱蛋白牦牛骨；

将所述脱蛋白牦牛骨进行粉碎，得到脱蛋白牦牛骨粉；

将所述脱蛋白牦牛骨粉、脂肪酶和磷酸盐溶液混合，进行脂肪酶处理，得到所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉。

优选地，所述蒸煮的时间为4～16h。

优选地，所述过氧化氢溶液中过氧化氢的质量百分含量为20～30％；

所述浸泡的时间为24～72h，温度为36～37℃。

优选地，所述脱蛋白牦牛骨粉的粒度为80～200目。

优选地，所述磷酸盐溶液的浓度为0.1～0.4mol/L，pH为6.5～7.5；所述脂肪酶的酶活性为15000～20000u/g；

所述骨粉和磷酸盐溶液的用量比为60～120g/L；所述脂肪酶和磷酸盐溶液的用量比为2～6g/L。

优选地，所述脂肪酶处理的时间为12～24h，温度为38～42℃。

本发明还提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的脱脂脱蛋白牦牛骨粉，所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉中脂肪的质量百分含量为0.1～3％。

本发明还提供了上述技术方案所述的脱脂脱蛋白牦牛骨粉在制备骨材料中的应用。

本发明还提供了一种牦牛骨3D打印线材，按照质量百分含量计，包括以下组分：脱脂脱蛋白牦牛骨粉1～20％和第一基体材料80～99％；所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉为上述技术方案所述的脱脂脱蛋白牦牛骨粉；

所述第一基体材料包括聚乳酸、壳聚糖、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物和聚丁二酸-己二酸丁二酯中的一种或多种。

本发明还提供了一种牦牛骨纺丝纤维，按照质量百分含量计，包括以下组分：脱脂脱蛋白牦牛骨粉1～15％和第二基体材料85～99％；所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉为权利要求7所述的脱脂脱蛋白牦牛骨粉；

所述第二基体材料包括聚乳酸和/或聚已内酯。

本发明提供了一种脱脂脱蛋白牦牛骨粉的制备方法，包括以下步骤：将牦牛骨进行蒸煮，得到预处理牦牛骨；将所述预处理牦牛骨于过氧化氢溶液中进行浸泡，得到脱蛋白牦牛骨；将所述脱蛋白牦牛骨进行粉碎，得到脱蛋白牦牛骨粉；将所述脱蛋白牦牛骨粉、脂肪酶和磷酸盐溶液混合，进行脂肪酶处理，得到所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉。本发明提供的制备方法选用高原牦牛骨，首先采用蒸煮法改变骨内脂肪的状态，经过过氧化氢溶液浸泡，使骨块松散，去除大量蛋白，再用脂肪酶浸泡、软化，最终达到优异的除脂效果。根据实施例数据可见，该方法极大程度的提高了脱脂率，脱脂率可达97％，从而降低了所得脱脂脱蛋白牦牛骨粉的免疫原性，减少异种骨易出现的排斥风险，使其具备促进骨细胞生长的能力，可作为优异的生物材料。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为新鲜牦牛骨粉和实施例1～4所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉的扫描电镜图；

图2为新鲜牦牛骨粉和实施例1～4所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉的XRD衍射图谱；

图3为新鲜牦牛骨粉和实施例1～4所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉的傅里叶红外光谱图；

图4为新鲜牦牛骨粉的同步热差分析示意图；

图5为实施例1～4所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉的同步热差分析示意图；

图6为新鲜牦牛骨粉和实施例1～4所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉的质量对比图；

图7为新鲜牦牛骨粉和实施例1～4所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉随温度变化的质量丢失曲线图；

图8为实施例1所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉对MC3T3-E1细胞增值的影响示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种脱脂脱蛋白牦牛骨粉的制备方法，包括以下步骤：

将牦牛骨进行蒸煮，得到预处理牦牛骨；

将所述预处理牦牛骨于过氧化氢溶液中进行浸泡，得到脱蛋白牦牛骨；

将所述脱蛋白牦牛骨进行粉碎，得到脱蛋白牦牛骨粉；

将所述脱蛋白牦牛骨粉、脂肪酶和磷酸盐溶液混合，进行脂肪酶处理，得到所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉。

在本发明中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。

本发明将牦牛骨进行蒸煮，得到预处理牦牛骨。

在本发明中，所述牦牛骨优选为牦牛头骨、牦牛脊骨、牦牛肋骨和牦牛腿骨中的一种或多种，更优选为牦牛头骨、牦牛脊骨和牦牛肋骨中的一种或多种，最优选为牦牛头骨。

本发明采用牦牛骨作为原料的原因在于，牦牛是生存在高原环境中的特殊生物，长期低氧、低压、高寒的生态环境，食用高海拔植物，牦牛骨中含有丰富的羟基磷灰石和胶原蛋白，以及更易于人体接受的钙磷比例，因此可作为一种具备修复能力的生物材料，具备极高的生物价值。

在本发明中，进行所述蒸煮前还优选包括将所述牦牛骨进行清洗；本发明对所述清洗的过程没有任何特殊的要求，采用本领域技术人员熟知的过程即可。

在本发明中，所述蒸煮优选为常压蒸煮；所述蒸煮的时间优选为4～16h，更优选为6～14h，最优选为8h；温度优选为95～100℃，更优选为98～100℃；溶剂优选为水；料液质量比优选为1:1～3，更优选为1:2～3，最优选为1:2。

在本发明中，所述蒸煮的作用为初步去除牦牛骨所含油脂及表皮组织，改变骨内脂肪的状态。

得到所述预处理牦牛骨后，本发明优选将所述预处理牦牛骨于过氧化氢溶液中进行浸泡，得到脱蛋白牦牛骨。

在本发明中，进行所述浸泡前还优选包括将所述预处理牦牛骨进行切割；所述切割所得牦牛骨块的体积优选为9～30cm

在本发明中，所述过氧化氢溶液中过氧化氢的质量百分含量优选为20～30％，更优选为25～30％，最优选为30％。

在本发明中，所述浸泡的时间优选为24～72h，更优选为30～60h，最优选为40～50h；温度优选为36～37℃，更优选为37℃；所述浸泡优选在恒温水浴锅中进行；本发明对所述浸泡的料液比没有任何特殊的限定，使预处理牦牛骨能够完全浸没即可；所述浸泡过程中还包括更换浸泡液；所述更换浸泡液的时间间隔优选为12～24h，更优选为15～20h；所述更换浸泡液的过程中还包括对所述预处理牦牛骨进行清洗；本发明对所述清洗的过程没有任何特殊的要求，采用本领域技术人员熟知的过程即可。

在本发明中，进行所述浸泡后还优选包括依次进行的清洗和干燥；本发明对所述清洗和干燥的过程没有任何特殊的要求，采用本领域技术人员熟知的过程即可。

得到所述脱蛋白牦牛骨后，本发明将所述脱蛋白牦牛骨进行粉碎，得到脱蛋白牦牛骨粉。

在本发明中，所述脱蛋白牦牛骨粉的粒度优选为80～200目，更优选为100～180目，最优选为120～160目。

在本发明中，所述粉碎优选采用万能高速粉碎机进行；进行所述粉碎后还优选包括过筛；本发明对所述粉碎和过筛的过程没有任何特殊的要求，采用本领域技术人员熟知的过程使所述脱蛋白牦牛骨粉的粒度达到上述限定范围即可。

得到所述脱蛋白牦牛骨粉后，本发明将所述脱蛋白牦牛骨粉、脂肪酶和磷酸盐溶液混合，进行脂肪酶处理，得到所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉。

在本发明中，所述磷酸盐溶液的浓度优选为0.1～0.4mol/L，更优选为0.2～0.3mol/L，最优选为0.2mol/L；pH优选为6.5～7.5，更优选为7～7.5，最优选为7.5；所述脂肪酶的酶活性优选为15000～20000u/g，更优选为18000～20000u/g，最优选为20000u/g；所述骨粉和磷酸盐溶液的用量比优选为60～120g/L，更优选为80～100g/L，最优选为90g/L；所述脂肪酶和磷酸盐溶液的用量比优选为2～6g/L，更优选为3～5g/L，最优选为4g/L。

在本发明中，所述混合优选为先将蛋白牦牛骨粉和磷酸盐溶液混合，再加入脂肪酶；所述脂肪酶处理的时间优选为12～24h，更优选为18～24h，最优选为24h；温度优选为38～42℃，更优选为39～41℃，最优选为40℃；所述脂肪酶处理优选在气浴恒温振荡器中进行，所述气浴恒温振荡器的转速优选为100～140rpm，更优选为110～130rpm，最优选为120rpm。

在本发明中，进行所述脂肪酶处理后还优选包括依次进行的清洗和干燥；所述清洗优选采用真空负压抽吸装置进行；所述清洗的溶剂为超纯水；本发明对所述清洗的过程没有任何特殊的要求，采用本领域技术人员熟知的过程至超纯水液体清亮即可；所述干燥优选采用热风干燥箱进行；本发明对所述干燥的过程没有任何特殊的要求，采用本领域技术人员熟知的过程使所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉充分干燥即可。

本发明提供的制备方法选用高原牦牛骨，首先采用蒸煮法改变骨内脂肪的状态，经过过氧化氢溶液浸泡，使骨块松散，去除大量蛋白，再用脂肪酶浸泡、软化，最终达到优异的除脂效果。根据实施例数据可见，该方法极大程度的提高了脱脂率，脱脂率可达97％，从而降低了所得脱脂脱蛋白牦牛骨粉的免疫原性，减少异种骨易出现的排斥风险，使其具备促进骨细胞生长的能力，可作为优异的生物材料。同时，所得牦牛骨粉羟基磷灰石纯度高。

本发明还提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的脱脂脱蛋白牦牛骨粉，所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉中脂肪的质量百分含量为0.1～3％，优选为0.1～2％，更优选为0.1～1％，最优选为0.1～0.5％。

本发明还提供了上述技术方案所述的脱脂脱蛋白牦牛骨粉在制备骨材料中的应用。

本发明对所述应用的过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程进行即可。

本发明提供的脱脂脱蛋白牦牛骨粉应用于制备骨骼生物替代材料，制备为牦牛骨3D打印线材或和牦牛骨纺丝纤维，能够作为修复材料解决临床骨缺损的难点问题。

本发明还提供了一种牦牛骨3D打印线材，按照质量百分含量计，包括以下组分：脱脂脱蛋白牦牛骨粉1～20％和第一基体材料80～99％；所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉为上述技术方案所述的脱脂脱蛋白牦牛骨粉；

所述第一基体材料包括聚乳酸、壳聚糖、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物和聚丁二酸-己二酸丁二酯中的一种或多种。

按照质量百分含量计，所述牦牛骨3D打印线材包括脱脂脱蛋白牦牛骨粉1～20％，优选为5～20％，更优选为5～15％。

按照质量百分含量计，所述牦牛骨3D打印线材包括第一基体材料80～99％，优选为80～95％，更优选为85～95％；所述第一基体材料包括聚乳酸、壳聚糖、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物和聚丁二酸-己二酸丁二酯中的一种或多种，优选为聚乳酸、壳聚糖和聚丁二酸-己二酸丁二酯中的一种或多种，更优选为聚乳糖和/或壳聚糖；当所述第一基体材料为上述具体选择中的两种以上时，本发明对所述第一基体材料的配比没有任何特殊的限定。

在本发明中，所述牦牛骨3D打印线材的制备方法优选采用熔融沉积成型技术或光聚合固化技术。

在本发明中，所述牦牛骨3D打印线材的制备方法优选包括以下步骤：

将所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉和第一基体材料混合，得到混合材料；

将所述混合材料进行造粒，得到混合材料颗粒；

将所述混合材料颗粒进行熔融沉积，得到所述牦牛骨3D打印线材。

本发明将所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉和第一基体材料混合，得到混合材料。

在本发明中，进行所述混合前还优选包括将所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉进行粉碎；所述粉碎采用的设备优选为球磨机；本发明对所述粉碎的过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程使材料充分粉碎即可。

本发明对所述混合的过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程使材料混合均匀即可。

得到所述混合材料后，本发明将所述混合材料进行造粒，得到混合材料颗粒。

在本发明中，所述造粒的设备优选为双螺杆造粒机；所述造粒的各段温度依次优选为168℃、169℃、172℃、175℃、173℃和170℃；进行所述造粒前还优选包括预热；本发明对所述造粒的过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程即可。

在本发明中，进行所述造粒后还优选包括干燥；所述干燥的设备优选为烘箱；所述干燥的时间优选为6～8h，更优选为7～8h；温度优选为60～90℃，更优选为70～90℃，最优选为70～80℃。

得到所述混合材料颗粒后，本发明将所述混合材料颗粒进行熔融沉积，得到所述牦牛骨3D打印线材。

在本发明中，所述熔融沉积的设备优选为3D打印耗材单螺杆生产线；本发明对所述熔融沉积的过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程即可。

在本发明中，所述牦牛骨3D打印线材的线径优选为1.75mm。

本发明还提供了一种牦牛骨纺丝纤维，按照质量百分含量计，包括以下组分：脱脂脱蛋白牦牛骨粉1～15％和第二基体材料85～99％；所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉为权利要求7所述的脱脂脱蛋白牦牛骨粉；

所述第二基体材料包括聚乳酸和/或聚已内酯。

按照质量百分含量计，所述牦牛骨纺丝纤维包括脱脂脱蛋白牦牛骨粉1～15％，优选为5～15％，更优选为5～10％。

按照质量百分含量计，所述牦牛骨纺丝纤维包括第二基体材料85～99％，优选为85～95％，更优选为90～95％；所述第二基体材料包括聚乳酸和/或聚已内酯，优选为聚乳酸；当所述第二基体材料为上述具体选择中的两种时，本发明对所述第二基体材料的配比没有任何特殊的限定。

在本发明中，所述牦牛骨纺丝纤维的制备方法包括以下步骤：

将所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉和第二基体材料溶液进行混合，得到混合溶液；

将所述混合溶液进行静电纺丝，得到所述牦牛骨纺丝纤维。

本发明将所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉和第二基体材料溶液进行混合，得到混合溶液。

在本发明中，进行所述混合前还优选包括将所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉进行粉碎；所述粉碎采用的设备优选为球磨机；本发明对所述粉碎的过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程使材料充分粉碎即可。

在本发明中，所述第二基体材料溶液的浓度优选为30～70g/L，更优选为40～60g/L，最优选为50g/L；所述第二基体材料溶液的溶剂优选为二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺；所述二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺的体积比优选为1～5:1，更优选为2～4:1，最优选为3:1；所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉和第二基体材料溶液中的第二基体材料的质量比优选为(1～15)：(85～99)，更优选为(5～15)：(85～95)，最优选为(5～10)：(90～95)。

在本发明中，所述混合优选为超声振荡；所述超声振荡的设备优选为超声波清洗机；所述混合的时间优选为1～5h，更优选为1～3h，最优选为2h。

得到所述混合溶液后，本发明将所述混合溶液进行静电纺丝，得到所述牦牛骨纺丝纤维。

在本发明中，所述静电纺丝的接收距离优选为15～25cm，更优选为18～22cm，最优选为20cm；纺丝电压优选为15～25kV，更优选为17～22kV，最优选为19kV；喷丝速度优选为0.2～0.6mL/h，更优选为0.3～0.5mL/h，最优选为0.4mL/h；本发明对所述静电纺丝的过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程即可。

在本发明中，进行所述静电纺丝后还包括将所述牦牛骨纺丝纤维进行干燥；所述干燥的设备优选为冷冻干燥箱；所述干燥的时间优选为4～16h，更优选为6～12h，最优选为8h。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的脱脂脱蛋白牦牛骨粉及其制备方法和应用、牦牛骨3D打印线材、牦牛骨纺丝纤维进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)首先选取高海拔地区新鲜牦牛头骨，清洗干净，通过常温常压的蒸煮方法，初步去除牦牛骨所含油脂及表皮组织。

(2)将蒸煮后的牦牛骨切割成约3cm×3cm×3cm的不规则骨块，将其完全浸泡于含有30％的过氧化氢溶液密封瓶中，放置于37℃的恒温水浴锅中水浴48h，每24h更换一次浸泡液，每次更换时将骨块上的残渣用纯水冲洗干净。待48h后将骨块冲洗干净后，晾干进一步挥发过氧化氢，备用。

(3)用万能高速粉碎机将骨块打磨成粉，过筛为80～200目脱蛋白骨粉；选取酶活性为20000u/g的脂肪酶，配置PH＝7.5、0.2mol/L的磷酸盐溶液。将骨粉与磷酸盐缓冲溶液以90g/L浓度混合，再以4g/L浓度加入脂肪酶，将密封瓶中放置气浴恒温振荡器中，维持温度40℃，转速120转/分钟，浸泡24h。

(4)将混合液倒入真空负压抽吸装置，用超纯水反复冲洗至液体清亮。将骨粉放置热风干燥箱中烘干，得到脱脂脱蛋白牦牛骨粉，放置于4℃贮藏。

实施例2～4

按照实施例1所述技术方案制备脱脂脱蛋白牦牛骨粉，区别仅在于，原料分别选用牦牛脊骨、牦牛腿骨和牦牛肋骨。实施例1～4所用新鲜牦牛骨、所得脱蛋白牦牛骨粉和脱脂脱蛋白牦牛骨粉的蛋白质和脂肪含量如表1所示，实施例1～4所用新鲜牦牛骨和所得脱脂脱蛋白牦牛骨粉的羟脯氨酸、胶原蛋白、钙和磷含量如表2所示。

表1新鲜牦牛骨、脱蛋白牦牛骨粉和脱脂脱蛋白牦牛骨粉的蛋白质和脂肪含量

由表1可见，牦牛头骨、牦牛脊骨和牦牛肋骨的脱脂率在97％左右，而牦牛腿骨的脱脂率在92％作用。

表2新鲜牦牛骨和脱脂脱蛋白牦牛骨粉的羟脯氨酸、胶原蛋白、钙和磷含量

由表1和表2可见，这四种骨中，牦牛头骨骨粉中蛋白质含量远远低于其他三种骨。其中，羟脯氨酸含量可反应出胶原蛋白的含量，通过计算对比发现，牦牛头骨胶原蛋白流失量最高可达87％，从而可见牦牛头骨中免疫原性最低。

实施例3

将实施例1所得脱脂脱蛋白牦牛骨粉与聚乳酸按照5:95的质量比进行混合。开启双螺杆造粒机，预热约30min，设置各段温度依次为168℃、169℃、172℃、175℃、173℃和170℃。将混合材料加入，调节切粒速度，使其配合熔体的挤出速度，均匀切粒，然后在60℃的烘箱中干燥6h，得到成型的复合材料。将成型的复合材料放入3D打印耗材单螺杆生产线中，按照线径1.75mm的标准制备牦牛骨3D打印线材。

实施例4～6

按照实施例3所述技术方案制备牦牛骨3D打印线材，区别仅在于，所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉和聚乳酸的质量比分别为10:90、15:85和20:80。

实施例7

将二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺按照3:1的体积比混合，配制浓度为50g/L的聚乳酸溶液采用磁力搅拌器搅拌24h。添加实施例1所得脱脂脱蛋白牦牛骨粉，骨粉与聚乳酸的质量比为5∶95，采用超声波清洗机超声振荡2h后制得溶解均匀的纺丝溶液。取5mL溶液置于注射器中，将高压直流电源正极连接到注射器针头上，另一极阴极连接在接收板上的铝箔上。设置接收距离为20cm，纺丝电压为19kV，喷丝速度为0.4mL/h，温度为室温。纺丝收集在接收板上，采用冷冻干燥箱干燥8h后取出，即制得牦牛骨纺丝纤维。

实施例8～9

按照实施例3所述技术方案制备牦牛骨纺丝纤维，区别仅在于，所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉和聚乳酸的质量比分别为10:90和15:85。

测试例1

通过扫描电镜观察骨粉的微观结构，新鲜牦牛骨粉和实施例1～4所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉的扫描电镜图见图1，其中A～D为新鲜腿骨骨粉、新鲜脊骨骨粉、新鲜头骨骨粉和新鲜肋骨骨粉，a～d为实施例提供的脱脂脱蛋白腿骨骨粉、脱脂脱蛋白脊骨骨粉、脱脂脱蛋白头骨骨粉和脱脂脱蛋白肋骨骨粉。

由图1可见，新鲜牦牛骨粉表现出光滑、圆润、相互黏附的现象，未显现出多孔的结构，脱脂脱蛋白牦牛骨粉表现出干燥，多孔，多裂隙、疏松的现象，说明脱脂脱蛋白骨粉微观结构表象有利于细胞及组织的生长和攀附，从而可以促进组织支架的形成。

测试例2

将实施例1～4所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉进行X射线衍射分析，得到的XRD衍射图谱见图2，其中紫色峰为羟基磷灰石标准卡。

由图2可见，通过蒸煮、过氧化氢脱蛋白、脂肪酶脱脂，基本上消除了脂肪和大量蛋白质，保留了羟基磷灰石特征衍射峰，在2θ＝30°附近有1个小而宽的峰，反映的是胶原螺旋的1个旋转高度内所对应的轴向周期，即典型的三股螺旋结构，是判断I型胶原构象完整性的重要依据。

测试例3

采用傅里叶红外光谱仪测定新鲜牦牛骨粉和实施例1～4所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉的傅里叶红外光谱图，结果见图3。

由图3可见，蓝色代表是新鲜牦牛骨粉，红色代表是脱脂脱蛋白牦牛骨粉，本发明提供的制备方法能够有效的脱掉大量脂肪和蛋白质，在2900cm

测试例4

采用同步热差分析仪对实施例1～4所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉进行同步热差分析，新鲜牦牛骨粉和实施例1～4所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉的同步热差分析示意图见图4和图5，图4中e～h为新鲜腿骨骨粉、新鲜肋骨骨粉、新鲜脊骨骨粉和新鲜头骨骨粉，图5中E～H为实施例提供的脱脂脱蛋白腿骨骨粉、脱脂脱蛋白肋骨骨粉、脱脂脱蛋白脊骨骨粉和脱脂脱蛋白头骨骨粉；新鲜牦牛骨粉和实施例1～4所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉的质量对比图见图6；新鲜牦牛骨粉和实施例1～4所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉的随温度变化的质量丢失曲线图见图7，图7中左图为新鲜牦牛骨粉，右图为实施例1～4所述脱脂脱蛋白牦牛骨粉。

由图4～5可见，DSC曲线中吸收峰与热收缩温度有关，牦牛骨在100℃左右出现明显的吸热峰，牦牛骨胶原的热收缩温度出现在90℃左右，与I型胶原蛋白相比，牦牛骨中胶原蛋白的变性范围增大，热收缩温度升高，其原因主要为牛骨中羟基磷灰石与胶原蛋白形成氢键，结合力增大，牦牛骨结晶度较高；在500～1000℃中DSC出现一个明显的缓慢的放热峰，在此期间出现碳酸钙、磷酸钙、羟基磷灰石等无机物质。在TG曲线中随着温度的升高，骨粉中物质逐渐分解，第一部分是发生在250℃之前有明显的质量损失，其质量损失主要是易于挥发物质，主要是不同形态的水分，而且在DSC中表现出一个缓慢的吸热峰；第二部分是发生在250～500℃，在此温度区间内降解速率最快，质量损失最高，主要是来自于胶原蛋白、脂类等有机物质的分解；第三部分是发生在500～1000℃中，降解速率变缓，表示有机物在随着温度的升高可能发生碳化，以及多种物质的重组；1000℃之后质量不再变化，出现大量的无机物。

由图6～7可见，不同部位的牦牛骨粉失重率不同，其中脱脂脱蛋白牦牛头骨粉的失重率最低。

测试例5

进行细胞毒性实验：参照《GB/T 16886.5-2017》中溶剂浸提法，采用实施例1所得脱脂脱蛋白牦牛骨粉制备浸提液，测定不同含量脱脂脱蛋白骨粉浸提液对MC3T3-E1细胞的毒性，判断所制备的脱脂脱蛋白骨粉的细胞毒性大小。

不同浓度的脱脂脱蛋白骨粉材料的细胞毒性实验分组。不同浓度的脱脂脱蛋白骨粉材料的细胞毒性实验均分为8组。第1组为空白对照组(MEMɑ完全培养基)；第2组为脱脂脱蛋白骨粉浸提液含量为100％(100mg/ml)；第3组为脱脂脱蛋白骨粉浸提液含量为75％(75mg/ml)；第4组为脱脂脱蛋白骨粉浸提液含量为50％(50mg/ml)；第5组为脱脂脱蛋白骨粉浸提液含量为25％(25mg/ml)；第6组为脱脂脱蛋白骨粉浸提液含量为12.5％(12.5mg/ml)；第7组为脱脂脱蛋白骨粉浸提液含量为6.25％(6.25mg/ml)；第8组为脱脂脱蛋白骨粉浸提液含量为3.125％(3.125mg/ml)；分别在浸提液给药24h后采用CCK-8法检测细胞毒性情况。根据RGR公式计算细胞的存活率，判断出脱脂脱蛋白骨粉的细胞毒性分级，不同浓度的脱脂脱蛋白骨粉对细胞生长的影响不同。脱脂脱蛋白骨粉浓度的不同使得细胞的生长状态不一致，从小到大浓度下，出现最低值和最高值。在一定浓度下脱脂脱蛋白牦牛骨粉属于无毒性等级。实验结果见表3和图8，图7中**代表P＜0.01，****代表P＜0.0001，ns代表没有统计学意义。

表3脱脂脱蛋白牦牛骨粉浓度对MC3T3细胞活性的影响数据图

由表1可见，与空白对照组(RGR＝100％)相比，100mg/ml浸提液组的RGR值为13.18％，在1～24％之间，毒性等级为4级；在3.125mg/ml、6.25mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml和75mg/ml浸提液浓度下的RGR值分别为、101.83％、103.98％、106.23％、105.86％、108.23％和101.67％，毒性等级为0级。由图8可见，牦牛脱脂骨粉在3.125-75mg区间内未抑制对MC3T3细胞活性。在100mg浓度下对MC3T3细胞活性具有明显的抑制作用。在此基础上，依据不同部位骨粉的基础结构可见脱脂脱蛋白牦牛头骨粉对细胞生长的毒性最小。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。