一种适用于育种实践的乳鸽早期无损性别鉴定方法

摘要

本发明涉及乳鸽遗传性别鉴定技术领域，具体涉及一种适用于育种实践的乳鸽早期无损性别鉴定方法，包括步骤S1、采用咽拭子或肛拭子提取乳鸽DNA；步骤S2、利用RAPD引物对乳鸽DNA进行RAPD‑PCR扩增反应，筛选出具有特异性条带的RAPD引物；步骤S3、对筛选出的特异性条带的RAPD引物进行测序，得到该RAPD引物的序列；步骤S4、采用步骤S3的具有特异性条带的RAPD引物，通过RAPD‑PCR结合琼脂糖凝胶电泳对乳鸽进行性别鉴定。本发明首次发现了鸽性染色体新特异序列并将其用于乳鸽性别鉴定的损伤小且准确率高的方法，易于操作，可显著提升鸽育种工作的效率，从而能够在生产上大规模推广使用，具有非常好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及乳鸽遗传性别鉴定技术领域，具体涉及一种适用于育种实践的乳鸽早期无损性别鉴定方法。

背景技术

鸽子是单态鸟，无论在幼鸟还是在成鸟时期，从外观及其行为上进行性别区分是十分困难的。目前，国内外学者在乳鸽性别鉴定方面的应用研究不多，主要是通过外貌体型、性格表现、羽毛外观、腹腔镜检、粪便类固醇检测及核型等方法进行鸽性别鉴定，但这些方法准确率不高，有些鉴定过程繁琐，难以在生产上大规模推广。

鸽子是典型的“一夫一妻”制，出现非雌雄配对时，会彼此打架，影响鸽舍安宁、延迟育种时间、产蛋及受精，不利与生产和后期育种培养。因此，在早期对乳鸽进行性别鉴定有利于减少生产损耗，缩短育种周期，具有较高的经济效益。

随着分子生物学发展，利用分子手段对乳鸽进行性别鉴定，具有准确性高、操作简便、成本低、对动物伤害较小等优点。例如，现有技术中主要的采样方法是利用羽髓上的血细胞进行DNA样品采集。然而，该方法一方面在样品采集时会对乳鸽造成一定的应激，另一方面不同的乳鸽之间可能通过羽毛、粪便等造成DNA交叉污染，影响性别鉴定结果，同样在生产上难以大规模应用。

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术带来了分子生物学的革命，以其为基础的各个DNA多态分析方法也相继出现。其中，随机扩增多态DNA(Randomamplifiedpolymorphic DNA,RAPD)便是这一新技术的产物之一。RAPD即随机引物扩增多态性DNA，是对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术，其基本原理是：采用随机合成的单个引物(一般为10个核苷酸)，对目的基因组DNA进行PCR扩增，然后琼脂糖电泳检测观察是否具有特异条带。

综上，鉴于现有鸽性别鉴定技术中已被发现的鸽性染色体特异序列较少，操作方法较为繁琐，以及在育种实践中乳鸽性别鉴定准确率低且容易造成乳鸽损伤等问题，急需提供一种准确率高、污染概率较小、对乳鸽影响较小的适用于育种实践的乳鸽早期无损性别鉴定方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种准确率高、污染概率较小、对乳鸽影响较小的适用于育种实践的乳鸽早期无损性别鉴定方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

提供一种适用于育种实践的乳鸽早期无损性别鉴定方法，包括以下步骤：

步骤S1、采用咽拭子或肛拭子提取乳鸽DNA；

步骤S2、利用RAPD引物对步骤S1得到的乳鸽DNA进行RAPD-PCR扩增反应，筛选出具有特异性条带的RAPD引物；

步骤S3、对步骤S2筛选出的特异性条带的RAPD引物进行测序，得到该RAPD引物的序列为5'-TCGGCGATAG-3'；

步骤S4、采用步骤S3的具有特异性条带的RAPD引物，通过RAPD-PCR结合琼脂糖凝胶电泳对乳鸽进行性别鉴定。

上述技术方案中，步骤S1中，采用医用消毒棉签在乳鸽的口腔内或肛门内擦拭10～20次以获得咽拭子或肛拭子，通过微量DNA提取法提取乳鸽DNA。

上述技术方案中，步骤S1中，采用咽拭子DNA提取试剂盒进行提取，所述咽拭子DNA提取试剂盒为北京庄盟国际生物基因科技有限公司生产的型号为ZP321-1的试剂盒。

上述技术方案中，步骤S1中，乳鸽DNA的浓度为20ng/μl以上，A260/A280值为1.8～2.0。

上述技术方案中，步骤S2中，选择确定了已知性别的乳鸽DNA为模板DNA；所述RAPD引物的数量为100条，每个所述RAPD引物含有10个碱基，并且所述RAPD引物是单个加入，而不是成对加入。

上述技术方案中，所述模板DNA为3只不同雄鸽的DNA和3只不同雌鸽的DNA

上述技术方案中，步骤S2的RAPD-PCR反应体系中含有：2×Taq PCR StarMix(Dye)10μL，RAPD引物2μL，模板DNA 1μL，去离子水7μL，总体积为20μL；。

上述技术方案中，步骤S2的RAPD-PCR反应条件为：94℃预变形5min，94℃变形1min，36℃退火1min，72℃延伸2min，共45个循环；72℃延伸5min，然后于4℃保存。

本发明的一种适用于育种实践的乳鸽早期无损性别鉴定方法，包括步骤S1、采用咽拭子或肛拭子提取乳鸽DNA；步骤S2、利用RAPD引物对步骤S1得到的乳鸽DNA进行RAPD-PCR扩增反应，筛选出具有特异性条带的RAPD引物；步骤S3、对步骤S2筛选出的特异性条带的RAPD引物进行测序，得到该RAPD引物的序列(5'-TCGGCGATAG-3')；步骤S4、采用步骤S3的具有特异性条带的RAPD引物，通过RAPD-PCR结合琼脂糖凝胶电泳对乳鸽进行性别鉴定。该方法中采用咽拭子或肛拭子采样时可在鸽棚进行，对鸽近乎无伤，并通过一段10bp的RAPD引物进行RAPD-PCR与琼脂糖凝胶电泳即可鉴定出雌鸽的特异性条带，具有准确率高，污染概率小的优点。与现有技术相比，本发明首次发现了鸽性染色体新特异序列并将其用于乳鸽性别鉴定的损伤小且准确率高的方法，易于操作，可显著提升鸽育种工作的效率，从而能够在生产上大规模推广使用，具有非常好的应用前景。

附图说明

图1是咽拭子采样图片。

图2是肛拭子采样图片。

图3为RAPD-A1-4引物筛选结果，其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图4为RAPD-A5-8引物筛选结果，其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图5是RAPD-A9-12引物筛选结果，其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物；在A12引物筛选中出现了特异性条带。

图6是RAPD-A13-16引物筛选结果，其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图7是RAPD-A17-20引物筛选结果，其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图8是RAPD-B1-4引物筛选结果，其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图9是RAPD-B5-8引物筛选结果，其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图10是RAPD-B9-12引物筛选结果，其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图11是RAPD-B13-16引物筛选结果，其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图12是RAPD-B17-20引物筛选结果，其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图13是RAPD-C1-4引物筛选结果，其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图14是RAPD-C5-8引物筛选结果，其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图15是RAPD-C9-12引物筛选结果，其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图16是C13-16引物筛选结果，其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图17是RAPD-C17-20引物筛选结果，其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图18是RAPD-D1-4引物筛选结果，其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图19是RAPD-D5-8引物筛选结果,其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图20是RAPD-D9-12引物筛选结果,其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图21是RAPD-D13-16引物筛选结果,其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图22是RAPD-D17-19引物筛选结果,其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图23是RAPD-D20-E1-3引物筛选结果,其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图24是RAPD-E4-7引物筛选结果，其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图25是RAPD-E8-11引物筛选结果,其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图26是RAPD-E12-E15引物筛选结果,其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图27是RAPD-E16-20引物筛选结果,其每块胶样品顺序从左到右依次为：分子量标准品DL2000，RAPD引物，每个引物均有6个条带，左侧3个为雄鸽DNA扩增出的产物，右侧3个为雌鸽DNA扩增出的产物。

图28是RAPD-A12引物出现的雌性特异条带测序结果。

图29是RAPD-A12引物出现的雌性特异条带测序结果比对图。

具体实施方式

结合以下实施例对本发明作进一步描述。

本实施例的一种适用于育种实践的乳鸽早期无损性别鉴定方法，包括以下步骤：

步骤S1、采用咽拭子或肛拭子提取乳鸽DNA：

本实施例中，采用北京庄盟国际生物基因科技有限公司型号ZP321-1的咽拭子DNA提取试剂盒提取乳鸽DNA，该试剂盒的主要成分包括：裂解液ML、结合液CB、抑制物去除液IR、Acryl Carrier、蛋白酶K、漂洗液W2、洗脱缓冲液TE、吸附柱、收集管(容量2mL)，具体操作如下：

1)准备好干净的剪刀与镊子；

2)取样：将医用消毒棉签伸进乳鸽口腔(手不要碰到棉签部位)，紧靠脸颊内侧来回刮拭，并不时地旋转棉棒，以充分接触口腔粘膜(见图1)；

3)将采集的样品放入已经加入400μl裂解液ML的2mL离心管中，可在取样后将棉签部分取下放入上述离心管中；

4)加入10μL的蛋白酶K溶液，立刻涡旋振荡充分混匀，56℃放置15～30min，每10min涡旋混匀10S；

5)加入400μL结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀；如果拭子上细胞数量少，导致提取的基因组DNA产量过低，可以在400μL结合液CB中加入4～8μL的Acryl Carrier；

6)冷却后加400μL无水乙醇，立刻涡旋振荡充分混匀；简短离心以除去管盖内壁的液滴，收集所有的液体到管底；如果周围环境高于25℃，乙醇则需要冰上预冷后再加入；

7)将上一步混合物和棉签加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，13000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液；总液量超过800μL，需分两次过柱；棉签的棉花货采样刷可能还吸附一些液体，如果要提高产量，可以用干净镊子夹挤出残余液体后弃棉花，减少棉花上液体残留；

8)加入500μL抑制物去除液IR，12000rpm离心30S，弃废液；

9)加入500μL漂洗液W2(使用漂洗液W2前，先加入60mL无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃掉废液；

10)加入500μL漂洗液W2，12000rpm离心30s，弃掉废液；

11)将吸附柱放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；

12)取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加40～80μL洗脱缓冲液TE，洗脱缓冲液事先在65～70℃水浴中预热效果更好，室温放置1min，12000rpm离心1min；将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置1min，12000rpm离心1min；洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于40μL，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量；

13)用紫外分光光度计检测DNA浓度及A260/A280比值，浓度在20ng/μL以上，A260/A280在1.8-2.0之间为合格DNA；DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。

步骤S2、利用100个RAPD引物对步骤S1得到的乳鸽DNA进行RAPD-PCR扩增反应，筛选出具有特异性条带的RAPD引物：

RAPD-PCR反应体系如表1所示，选择确定了已知性别的乳鸽DNA为模板DNA，即模板DNA为3只不同雄鸽的DNA和3只不同雌鸽的DNA；

RAPD引物数量为100条，分为A、B、C、D、E五组，每组20条，每个RAPD引物含有10个碱基；该RAPD引物是单个加入，而不是成对(正、反向引物)加入。100个RAPD引物的序列如表2所示。

加入RAPD引物2μL、模板DNA1μL、2×Taq PCR StarMix(Dye)(购自北京康润诚业生物科技有限公司，货号A012-01)10μl、ddH

表1.RAPD-PCR反应体系

表2.RAPD引物(A、B、C、D、E五组RAPD引物)序列

琼脂糖凝胶电泳操作：取10μLRAPD-PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，电压120V，时间30min，出现雌性特异条带的即为寻找目的序列，结果如图3～图28所示。其中出现的特异性条带见图5，结果显示，A12引物出现了雌性特异条带。

步骤S3、对步骤S2筛选出的特异性条带的RAPD引物(A12引物)进行T载体连接克隆测序：

测序得到该RAPD引物的序列为5'-TCGGCGATAG-3'。如图29所示，经测序结果对比，发现与斑鸠W染色体上一段未被用于性别鉴定的序列匹配度为99％，原因可能为斑鸠与鸽子共属鸠鸽科，加上鸽子W染色体目前测序结果较少，故出现该述情况。该RAPD引物的序列为新的未用于性别鉴定的序列。

步骤S4、采用步骤S3的具有特异性条带的RAPD引物，通过RAPD-PCR结合琼脂糖凝胶电泳对乳鸽进行性别鉴定。

与现有技术相比，本发明首次发现了鸽性染色体新特异序列并将其用于乳鸽性别鉴定的损伤小且准确率高的方法，易于操作，可显著提升鸽育种工作的效率，从而能够在生产上大规模推广使用，具有非常好的应用前景。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。