一年生辣椒不同果实发育时期的内参基因及其引物和应用

摘要

本发明属于辣椒基因研究的技术领域，具体涉及一年生辣椒不同果实发育时期的内参基因及其引物和应用。针对目前辣椒果实发育内参基因缺乏的现状，依据转录组数据，利用实时荧光定量PCR技术对辣椒果实不同生长发育期、果实部位及组织的基因表达量进行分析的现状，对内参基因进行广泛筛选并使用了多种统计分析方法和综合比较各个内参基因的稳定性，根据基因序列设计相应的实时荧光定量PCR引物，扩增效率高，筛选出一年生辣椒发育过程中稳定适合且稳定的内参基因CT8，并且开发设计了辣椒果实相关基因研究领域的实时荧光定量PCR高效扩增引物，为辣椒果实发育过程中目标基因表达分析、筛选及时空表达验证提供了相对有效的内参基因用于校准。

说明书

技术领域

本发明属于辣椒基因研究的技术领域，具体涉及一年生辣椒不同果实发育时期的内参基因及其引物和应用。

背景技术

实时荧光定量PCR技术因其具有高效、准确率高和重复性良好等优点被广泛应用于基因表达量分析，但合适且稳定的内参基因是准确计算目标基因相对表达量的关键因素。理想状态下，内参基因应该在同一物种、不同组织器官及其不同生长阶段都能稳定表达，其表达量不受内外因素所影响。实际上，任意内参基因的表达量都是相对的，同一物种同一内参基因的表达量常常受内外因素所影响，因此在进行相关研究时应该就不同的实验条件、实验环境和实验目的选择适宜且稳定的内参基因。

辣椒是世界性蔬菜之一，也是我国种植面积最为广泛的蔬菜作物。辣椒不仅是餐厅厨房的佐食和调料，还是化妆品、药品和催泪瓦斯等重要产品的原料，其中一年生辣椒(Capsicum annuum L.)是种植最为广泛的栽培种之一。果实品质对辣椒的商品价值至关重要，对果实发育、营养和风味相关品质性状的基因进行时空表达量分析研究是改善植物果实品质的重要理论基础。

2011年Hongjian Wan等以甜椒PBC631B为材料进行内参基因筛选，研究表明β-TUB和UBI-3在所有处理中表达最稳定，不同组织器官中UBI-3和GAPDH表达稳定，ACT和UBI-1则表现出不稳定不宜做内参基因。2012年Wang Shu Bin等以胞质雄性不育系辣椒CMS 21A作为试验材料。分别采取成熟植株根、茎、叶、花和非生物胁迫及激素处理幼苗，对ACT、ACT1、ACT2、18S rRNA、PPR1、TEF1A、EF1α、UEP、CYC和GAPDH等10候选内参基因进行筛选。分析结果显示成熟植株不同组织适宜内参基因为ACT，非生物胁迫及激素处理组适宜内参基因为EF1α，所有样品中适宜内参基因则为EF1α和UEP。两者选择的同为一年生辣椒成熟植株为材料，ACT在CMS 21A成熟植株组织器官中表达稳定，适宜作为内参基因，在PBC631B成熟辣椒植株中却不适宜作为内参基因使用。因此，如果仍使用缺乏系统验证的ACT作为内参基因将会严重影响辣椒果实发育相关基因表达分析的准确性；另一方面，随着转录组的测序的迅猛发展，基于转录组数据筛选开发出稳定适宜的新内参基因是解决当前困境的良好选择。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一年生辣椒(Capsicum annuum L.)不同果实发育时期的内参基因及其引物和应用，所筛选的内参基因满足对辣椒果实发育过程中相关基因研究的数据支撑。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一年生辣椒(Capsicum annuum L.)不同果实发育时期的内参基因，所述内参基因为EIF，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，其特异性引物如SEQ ID NO.30和SEQID NO.31所示。

本发明还提供了上述内参基因CT8或其特异性引物在制备一年生辣椒不同果实发育时期检测试剂盒的应用。

本发明还提供了一年生辣椒不同果实发育时期的内参基因的筛选方法，包括如下步骤：

1)果实预处理：获取不同生长发育时期的一年生辣椒果实，研磨成粉末；

2)提取RNA：提取不同生长发育时期的辣椒果实粉末的RNA；

3)合成cDNA第一链；

4)筛选候选内参基因，设计引物；

所述候选内参基因包括GAPDH、UBI-3、UBI-1、ACT、EIF、β-TUB、α-TUB、CT1、CT2、CT3、CT4、CT5、CT6、CT7、CT8、CT9、CT10、CT11和CT12；

所述候选内参基因的核酸序列可根据NCBI基因库获得，引物序列分别如SEQ IDNO.2～SEQ ID NO.39所示；

5)PCR扩增cDNA；

6)PCR扩增候选内参基因，使用软件计算引物扩增效率和斜率R2；

7)筛选内参基因：使用NormFinder、ΔCt、BestKeeper和geNorm四个软件分析候选内参基因稳定性，根据所获得的结果进行综合排序和评价，筛选出一年生辣椒果实发育的最适内参基因CT8。

本发明的有益效果如下：

本发明的用于筛选一年生辣椒(Capsicum annuum L.)不同果实发育时期的内参基因的方法，针对目前辣椒果实发育内参基因缺乏的现状，依据转录组数据，利用实时荧光定量PCR技术对辣椒果实不同生长发育期、果实部位及组织的基因表达量进行分析的现状，筛选出19个候选内参基因，对内参基因进行广泛筛选并使用了多种统计分析方法和综合比较各个内参基因的稳定性，根据基因序列设计了相应的实时荧光定量PCR引物，经过验证，所设计的引物特异性良好，扩增效率高，筛选出一年生辣椒发育过程中稳定适合且稳定的内参基因CT8，并且开发设计了辣椒果实相关基因研究领域的实时荧光定量PCR高效扩增引物，为辣椒果实发育过程中目标基因表达分析、筛选及时空表达验证提供了相对有效的内参基因用于校准。解决了辣椒果实发育研究领域中缺乏合适的、稳定的内参基因的问题；

针对辣椒果实作为重要商品产出，在辣椒不同发育期设计采样点，使用本发明所筛选的内参基因即可对目标基因进行校准，不仅大大节省了因内参基因选择导致的时间损失还能保证结果的准确可靠，本发明所筛选的内参基因还可以为其它茄科作物果实发育方面研究提供参考。

附图说明

图1为本发明所筛选的19个引物以辣椒果实cDNA为模板进行普通PCR扩增得到的电泳凝胶图；

图2为一年生辣椒的16个候选内参基因进行实时荧光定量PCR的Cq值分布图；

图3为本发明所筛选的16个候选内参基因的溶解曲线图。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。

实施例

筛选辣椒果实发育内参基因的实时荧光定量PCR方法

1)材料采集与前处理：将辣椒种子温水浸种后清水浸泡12h后置于28℃培养箱催芽，种子露白后播种于装有育苗基质的秧盘中。辣椒幼苗长到5-6叶时移栽于大田露地栽培，按常规田间栽培进行日后的管理；

选取坐果后的一年生辣椒果实分别挂牌，在挂牌时间为0天、7天、14天、21天、28天、35天的6个时间点对整个辣椒果实进行取样，每个时间点进行三次生物学重复采样，即选取得到一年生辣椒的6个不同生长发育时期的果实样品；

将采集到的6个不同生长发育时期的果实样品迅速放入液氮冷冻后带回实验室液氮下研磨成粉末状，贮藏于-80℃冰箱，用于后续实验；

2)提取RNA：取6个不同生长发育时期的一年生辣椒果实粉末，使用TrizolReagent(北京全式金生物技术股份有限公司)试剂盒提取一年生辣椒果实总RNA，提取条件与试剂盒说明书一致；

使用凝胶电泳检测提取RNA的完整性，以1％琼脂糖凝胶，TBE缓冲液，120V电压下电泳15min，在凝胶成像系统下观察RNA条带的完整性；

使用NanoDrop-2000c检测RNA浓度及纯度，纯净RNA的OD值260/280在1.8～2.2之间，然后将RNA浓度定量至100ng/μL；

3)cDNA第一链合成：准确吸取1μg的RNA样品使用PrimeScript○RRT reagent Kitwith g DNA Eraser(Perfect Real Time)逆转录试剂盒进行反转录，得到cDNA第一链；

4)收集辣椒果实相关的转录组数据，初步挑选出辣椒候选内参基因19个，分别为GAPDH、UBI-3、UBI-1、ACT、EIF、β-TUB、α-TUB、CT1、CT2、CT3、CT4、CT5、CT6、CT7、CT8、CT9、CT10、CT11和CT12，所对应的核酸序列可根据NCBI基因库获得，编号如表1所示，作为候选内参基因；

其中GAPDH、UBI-3、UBI-1、ACT、EIF、β-TUB、α-TUB的引物根据现有文献获得，其它以候选内参基因序列为模板使用软件Primier5.0设计引物，随后使用NCBI数据库中的Primer-BLAST设计特异引物；

5)以一年生辣椒果实RNA逆转录获得的cDNA，使用所设计的引物进行PCR扩增。测候选内参基因的引物特异性所使用普通PCR聚合酶购自北京康润诚业生物科技有限公司(GenStar)，反应体系为10μL体系，聚合酶5μL，无菌水4μL，上下游引物各0.25μL，cDNA模板0.5μL；扩增程序为94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环，随后72℃终延伸10min；扩增完成后1％琼脂糖凝胶电泳检测引物特异性，于TBE缓冲液，120V电压下电泳20min，在凝胶成像系统下观察特异条带长度，确认扩增是否是目的条带。结果如图1所示，琼脂糖凝胶电泳结果显示CT1没有扩增，CT2有非特异扩增，因此剔除这两个候选基因，而CT9和CT10虽然有非特异扩增，但是非特异片段长度接近500bp，在荧光定量中不会造成影响，因此可以保留进行下一步实验。

6)qRT-PCR：使用反转录获得的cDNA为模板，对候选内参基因进行实时荧光定量PCR扩增，获得对应的Cq值，结果如图2所示，结果显示一年生辣椒果实不同发育期16个候选内参基因的Ct值在23.28(UBI-3)至36.30(CT6)之间，其中α-TUB、EIF、β-TUB和UBI-3等四个基因的Ct值明显低于其它基因，说明这几个基因在辣椒果实发育期表达丰度高，而CT6的Ct值明显高于其它基因，表明该基因为在所有候选内参基因中表达水平最低。

实时荧光定量PCR试剂盒为SYBRRPremix Ex Taq

7)引物扩增效率及R

表1辣椒果实发育候选内参基因及扩增引物

将表1结合图1、图2结果显示，经验证，所设计的引物特异性良好，扩增效率高，表明所筛选的内参基因在辣椒发育过程中表现稳定，以及所设计的相关基因的实时荧光定量PCR高效扩增引物，为辣椒果实发育过程中目标基因表达分析、筛选及时空表达验证提供了相对有效的内参基因用于校准。

8)使用NormFinder、ΔCt、BestKeeper和geNorm四个软件分析候选内参基因稳定性；

9)使用在线工具RefFinder对上述4个软件获得的结果进行综合排序和评价，筛选出辣椒果实发育的最适内参基因；

基因相对表达量的计算方法使用2

结果如下所示：

表2一年生辣椒中候选基因稳定性及排序

根据表2结果可见，本发明所筛选的候选内参基因稳定性均表现良好，其中基因CT8应用于作为筛选一年生辣椒不同时期果实发育的内参基因。