检测APC基因大片段缺失的核酸组合物、试剂盒及其应用

摘要

本申请涉及一种检测APC基因大片段缺失的核酸组合物、试剂盒及其应用。上述检测APC基因大片段缺失的核酸组合物、试剂盒及其应用，针对APC基因突变的特点，选择APC基因突变长片段作为检测对象，通过选用特定的定量PCR扩增引物进行定量PCR扩增，并对扩增反应结果进行分析，确定APC基因是否存在缺失的基因片段，进一步结合长片段PCR进行扩增，选用特定的正向引物和反向引物进行长片段PCR扩增缺失基因片段，并对长片段扩增产物进行测序，可以检测APC基因大片段的缺失断点序列信息。

说明书

技术领域

本申请涉及分子生物学检测领域，特别涉及到一种检测APC基因大片段缺失的核酸组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

家族性腺瘤息肉病(familial adenomatous polyposis，FAP)，是一种遗传性癌前病变，主要表现为胃肠道粘膜的大量腺瘤性息肉和一组涉及不同器官的独特肠外病变，如先天性视网膜色素上皮肥大，表皮囊肿和软组织肿瘤等。其主要由抑癌基因APC胚系突变引起，呈常染色体显性遗传，患者约一半会在15岁前出现多发性腺瘤性息肉，95％在35岁前发病。APC基因的致病变异类型多样，包括错义变异、剪切变异、小片段缺失/插入，重排等复杂变异，以及大片段插入/缺失。其中，已经报道的涉及多个外显子的大片段缺失占比6.9％，是APC基因检测的重要内容。

目前基因插入/缺失突变的检测方法主要有：多重连接依赖式探针扩增(MLPA)技术、微阵列比较基因杂交(array-CGH)、单核苷酸多态性(SNP)分型芯片、高通量测序技术、荧光原位杂交(FISH)技术和PCR-Sanger测序等。其中array-CGH、SNP分型芯片、高通量测序技术等主要用于全基因组范围内未知基因插入/缺失突变的检测。这些技术在全基因组范围内检测基因插入/缺失突变的技术先进、准确而高效，但检测成本较高且需要配套昂贵的仪器，针对已临床确诊的患者，高通量检测并非首选的基因检测方法，会给患者带来额外的检测成本，因此，在检测某些特定基因或者特定区域的插入/缺失突变时，它们并不是最佳选择。荧光原位杂交技术目前被广泛应用于染色体非整倍体、染色体畸变的检测，但因操作流程较复杂且成本高，很少用于单个特定基因拷贝数变异的检测。而基因常规的突变检测即普通PCR-Sanger测序，仅能检测错义、剪切、小片段缺失/插入等范围普遍<50bp的变异，不能提示大片段缺失。目前针对已知基因的大片段缺失主要采用多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)，MLPA对全基因范围内的缺失有较好的准确性和敏感度，但MLPA价格昂贵，且只能提示基因区域内是否存在缺失，无法精准确定断点位置，属于定性检测。定性结果可基本满足疾病基因诊断的需求，但用于后续变异携带者的生殖干预则存在一定风险。

综上所述，目前虽然已报道了多种检测基因拷贝数变异的方法，特别是基因缺失突变，但是它们各自都具有一定的局限性。因此，亟需一种能精准定位缺失断点的检测APC基因大片段缺失且成本相对较低的相关技术和产品。

发明内容

基于此，有必要提供一种能精准定位缺失断点序列信息的检测APC基因大片段缺失的核酸组合物及试剂盒。一种检测APC基因大片段缺失的核酸组合物，所述核酸组合物包括：

正向引物序列如SEQ ID No.21、反向引物序列如SEQ ID No.22所示的第一外显子扩增引物对；

正向引物序列如SEQ ID No.23、反向引物序列如SEQ ID No.24所示的内含子扩增引物对；

正向引物序列如SEQ ID No.25、反向引物序列如SEQ ID No.26所示的第二外显子扩增引物对；

正向引物序列如SEQ ID No.31、反向引物序列如SEQ ID No.32所示的第三外显子扩增引物对；

正向引物序列如SEQ ID No.35、反向引物序列如SEQ ID No.36所示的第四外显子扩增引物对；

正向引物序列如SEQ ID No.37、反向引物序列如SEQ ID No.38所示的第一3’UTR扩增引物对；及正向引物序列如SEQ ID No.39、反向引物序列如SEQ ID No.40所示的第二3’UTR扩增引物对。在其中一个实施例中，还包括：

正向引物序列如SEQ ID No.1、反向引物序列如SEQ ID No.2所示的5’UTR扩增引物对；

正向引物序列如SEQ ID No.3、反向引物序列如SEQ ID No.4所示的第五外显子扩增引物对；

正向引物序列如SEQ ID No.5、反向引物序列如SEQ ID No.6所示的第六外显子扩增引物对；

正向引物序列如SEQ ID No.7、反向引物序列如SEQ ID No.8所示的第七外显子扩增引物对；

正向引物序列如SEQ ID No.9、反向引物序列如SEQ ID No.10所示的第八外显子扩增引物对；

正向引物序列如SEQ ID No.11、反向引物序列如SEQ ID No.12所示的第九外显子扩增引物对；

正向引物序列如SEQ ID No.13、反向引物序列如SEQ ID No.14所示的第十外显子扩增引物对；

正向引物序列如SEQ ID No.15、反向引物序列如SEQ ID No.16所示的第十一外显子扩增引物对；

正向引物序列如SEQ ID No.17、反向引物序列如SEQ ID No.18所示的第十二外显子扩增引物对；

正向引物序列如SEQ ID No.19、反向引物序列如SEQ ID No.20所示的第十三外显子扩增引物对；

正向引物序列如SEQ ID No.27、反向引物序列如SEQ ID No.28所示的第十四外显子扩增引物对；

正向引物序列如SEQ ID No.29、反向引物序列如SEQ ID No.30所示的第十五外显子扩增引物对；

正向引物序列如SEQ ID No.33、反向引物序列如SEQ ID No.34所示的第十六外显子扩增引物对；及正向引物序列如SEQ ID No.41、反向引物序列如SEQ ID No.42所示的第三3’UTR扩增引物对。

在其中一个实施例中，各扩增引物对进行扩增得到的片段长度为120bp～300bp。

本申请还提供一种上述的核酸组合物在制备家族性腺瘤息肉病的诊断产品中应用。

在其中一个实施例中，所述诊断产品为试剂盒。

本申请还提供一种用于诊断家族性腺瘤息肉病的试剂盒，包含上述的核酸组合物。

在其中一个实施例中，所述试剂盒用于执行以下方法中的任意一种：

实时荧光定量PCR和长片段PCR。

在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、PCR扩增试剂、测序试剂及电泳检测试剂中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述PCR扩增试剂包括实时荧光定量PCR扩增试剂和长片段PCR扩增试剂中的至少一种。

本申请还提供一种非疾病的诊断和治疗目的的APC基因大片段缺失的检测方法，包括如下步骤：

获取健康对照样本及待测样本；

以获取的所述健康对照样本及待测样本为模板，分别对APC基因相应片段进行实时荧光定量PCR扩增反应，其中，所述实时荧光定量PCR扩增反应所用的引物对包括上述的核酸组合物；

分析实时荧光定量PCR扩增反应结果，确定APC基因是否存在缺失的基因片段；

从上述的核酸组合物中找到APC基因缺失的基因片段的外部引物对，进行长片段PCR扩增反应，将所述长片段PCR扩增得到的产物进行测序检测，其中，所述APC基因缺失的基因片段的外部引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物位于缺失的基因片段的5’断裂点的上游，所述反向引物位于缺失的基因片段的3’断裂点的下游。

上述检测APC基因大片段缺失的核酸组合物选择APC基因长片段作为检测对象，选用特定的检测引物对进行扩增，包括正向引物序列如SEQ ID No.21、反向引物序列如SEQID No.22所示的第一外显子扩增引物对；正向引物序列如SEQ IDNo.23、反向引物序列如SEQ ID No.24所示的内含子扩增引物对；正向引物序列如SEQ ID No.25、反向引物序列如SEQ IDNo.26所示的第二外显子扩增引物对；正向引物序列如SEQ ID No.31、反向引物序列如SEQ ID No.32所示的第三外显子扩增引物对；正向引物序列如SEQ ID No.35、反向引物序列如SEQ ID No.36所示的第四外显子扩增引物对；正向引物序列如SEQ ID No.37、反向引物序列如SEQ ID No.38所示的第一3’UTR扩增引物对及正向引物序列如SEQ ID No.39、反向引物序列如SEQ ID No.40所示的第二3’UTR扩增引物对，上述检测引物对可以与检测样本中的APC基因靶核酸序列更灵敏特异结合。

本申请成功建立APC基因大片段缺失的检测方法，通过选用特定的定量PCR扩增引物进行定量PCR扩增，并对扩增反应结果进行分析，确定APC基因是否存在缺失的基因片段，进一步结合长片段PCR进行扩增，选用特定的正向引物和反向引物进行长片段PCR扩增缺失基因片段，并对长片段扩增产物进行测序，可以检测APC基因大片段的缺失断点序列信息。其中，在长片段PCR扩增阶段的正向引物和反向引物可根据预测缺失的基因片段，对定量PCR引物进行重新组合应用，方便灵活；整个实验操作简单，且能精准显示APC基因大片段的缺失断点序列信息。为临床APC基因缺失突变的基因诊断及后期生殖干预的应用提供了技术支撑。

附图说明

图1为实施例1中病例家系图；

图2为实施例1中先证者与正常对照APC基因第一外显子、第二外显子、第三外显子、第四外显子、第一3’UTR及第二3’UTR片段定量PCR扩增曲线；

图3为实施例1中先证者相对于健康人APC基因目标区域的拷贝数；

图4为实施例1中长片段PCR扩增产物电泳图；

图5为实施例1中先证者(IV-5)、父亲(III-3)、姐姐(IV-4)长片段PCR扩增产物测序结果图；

图6为实施例2中长片段PCR扩增产物电泳图。

具体实施方式

为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本申请的具体实施方式做详细的说明，并给出了本申请的较佳实施例。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本文所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

如本文中所使用的，术语“基因大片段缺失”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，目标核酸分子(例如基因组核酸分子)中多个连续碱基(通常至少100bp，例如至少200bp，至少300bp，至少400bp，至少500bp，至少600bp，至少700bp，至少800bp，至少900bp，至少1000bp，至少2000bp，至少3000bp，至少4000bp，至少5000bp，至少6000bp，至少7000bp，至少8000bp，至少9000bp，乃至更多碱基)的缺失。在本申请某些实施方案中，核苷酸片段缺失是指至少1000个连续碱基的缺失。在某些实施例方案中，核苷酸缺失片段大于20kb。本领域已知，核苷酸片段缺失导致核酸分子的断裂和重新连接，这将在该重新连接的位点(即断点(breakpoint))处产生新的碱基序列。因此，在本文中，当用于描述核苷酸片段缺失时，术语“断点(breakpoint)”是指，与野生型核酸分子相比，缺失型核酸分子中出现核苷酸片段缺失的位置。这意味着在断点的一侧，缺失型核酸分子与野生型核酸分子的序列相同，在断点的另一侧，与野生型核酸分子的序列相比，缺失型核酸分子缺失了一段核苷酸片段。

如本文中所使用的，术语“上游”用于描述两条核酸序列(或两个核酸分子)的相对位置关系，并且具有本领域技术人员通常理解的含义。例如，表述“一条核酸序列位于另一条核酸序列的上游”意指，当以5'至3'方向排列时，与后者相比，前者位于更靠前的位置(即，更接近5'端的位置)。如本文中所使用的，术语“下游”具有与“上游”相反的含义。

如本文中所使用的，术语“PCR反应”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指使用核酸聚合酶和引物来扩增靶核酸的反应(聚合酶链式反应)。

实时荧光定量PCR是指在PCR体系中加入荧光基团，使PCR产物和荧光相关，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。

在长片段PCR中，利用两个与正常序列相邻的引物，能够选择性地扩增出含有缺失部分的基因片段。对于突变类型为缺失的情况，由于引物位于突变部分的两侧，正常的DNA序列样本，负责扩增缺失序列的引物距离过远，而无法生成相应的扩增产物。而对于缺失序列的样本，由于某一区段的缺失，使得引物间的距离缩短，从而提高了PCR扩增的效率，可以扩增出特定长度的片段。

Ct值为反应管内的荧光信号到达所设定的域值时的循环数，即对数扩增峰出现的时间。

如本文中所使用的，术语“扩增曲线”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，描述PCR动态进程的曲线，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光信号强度为纵坐标。理论上PCR过程中反应产物是以指数增长的，但随着PCR循环数的增加，DNA聚合酶失活、dNTP和引物枯竭、反应副产物阻碍反应等原因，致使PCR的扩增效率降低，产物生成的速度逐渐减缓，因此扩增曲线是一条“S形”曲线。

本申请一实施方式提供一种检测APC基因大片段缺失的核酸组合物，核酸组合物包括：正向引物序列如SEQ ID No.21、反向引物序列如SEQ ID No.22所示的第一外显子扩增引物对；正向引物序列如SEQ ID No.23、反向引物序列如SEQ ID No.24所示的内含子扩增引物对；正向引物序列如SEQ ID No.25、反向引物序列如SEQ ID No.26所示的第二外显子扩增引物对；正向引物序列如SEQ ID No.31、反向引物序列如SEQ ID No.32所示的第三外显子扩增引物对；正向引物序列如SEQ ID No.35、反向引物序列如SEQ ID No.36所示的第四外显子扩增引物对；正向引物序列如SEQ ID No.37、反向引物序列如SEQ ID No.38所示的第一3’UTR扩增引物对；及正向引物序列如SEQ ID No.39、反向引物序列如SEQ IDNo.40所示的第二3’UTR扩增引物对。

具体地，如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列为：5'-CATCATTGCTCTTCAAATAAC-3'；如SEQ ID No.22所示的核苷酸序列为：5'-ACCAGTAATTGTCTATGTCA-3'；如SEQ ID No.23所示的核苷酸序列为：5'-GGCATTTCATGCTAATGGTGACT-3'；如SEQ ID No.24所示的核苷酸序列为：5'-TCTACAATTTTCTTGGTGCCTGT-3'；如SEQ ID No.25所示的核苷酸序列为：5'-ACGATATGCTGGAATGGCTTTG-3'；如SEQ ID No.26所示的核苷酸序列为：5'-TAAGCGAATGTGAAGCACAGGT-3'；SEQ ID No.31所示的核苷酸序列为：5'-GGAATCAACCCTCAAAAGCGTA-3'；如SEQ ID No.32所示的核苷酸序列为：5'-TCAAGCTGGACACATTCCGTA-3'；如SEQ ID No.35所示的核苷酸序列为：5'-AAGACATACCAGACAGAGGGGC-3'；如SEQ ID No.36所示的核苷酸序列为：5'-AGGGGGCTCAGTCTCTTTGATAG-3'；如SEQ ID No.37所示的核苷酸序列为：5'-GTGGAATTTTTGTAGGCAACACTTG-3'；如SEQ ID No.38所示的核苷酸序列为：5'-TAAACTGGGAATATTTGGCCTGCT-3'；如SEQ ID No.39所示的核苷酸序列为：5'-AGTGACCAGAGACTTGTATAGCAC-3'；如SEQ ID No.40所示的核苷酸序列为：5'-TCCACTAGGTGGCTTCCTCTTA-3。

在其中一些实施例中，上述核酸组合物还包括：正向引物序列如SEQ ID No.1、反向引物序列如SEQ ID No.2所示的5’UTR扩增引物对；正向引物序列如SEQ ID No.3、反向引物序列如SEQ ID No.4所示的第五外显子扩增引物对；正向引物序列如SEQ ID No.5、反向引物序列如SEQ ID No.6所示的第六外显子扩增引物对；正向引物序列如SEQ ID No.7、反向引物序列如SEQ ID No.8所示的第七外显子扩增引物对；正向引物序列如SEQ ID No.9、反向引物序列如SEQ ID No.10所示的第八外显子扩增引物对；正向引物序列如SEQ IDNo.11、反向引物序列如SEQ ID No.12所示的第九外显子扩增引物对；正向引物序列如SEQID No.13、反向引物序列如SEQ ID No.14所示的第十外显子扩增引物对；正向引物序列如SEQ ID No.15、反向引物序列如SEQ ID No.16所示的第十一外显子扩增引物对；正向引物序列如SEQ ID No.17、反向引物序列如SEQ IDNo.18所示的第十二外显子扩增引物对；正向引物序列如SEQ ID No.19、反向引物序列如SEQ ID No.20所示的第十三外显子扩增引物对；正向引物序列如SEQ ID No.27、反向引物序列如SEQ ID No.28所示的第十四外显子扩增引物对；正向引物序列如SEQ ID No.29、反向引物序列如SEQ ID No.30所示的第十五外显子扩增引物对；正向引物序列如SEQ ID No.33、反向引物序列如SEQ ID No.34所示的第十六外显子扩增引物对；及正向引物序列如SEQ ID No.41、反向引物序列如SEQ IDNo.42所示的第三3’UTR扩增引物对。

具体地，如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为：5'-AATCCATCTGTGAGAAGGCAAATG-3'；如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为：5'-TGCTTGTTTTTAAAGAAAGGGGTAA-3'；如SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列为：5'-GTCCAAGGGTAGCCAAGGATG-3'；如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列为：5'-CATATTAGATGCCTCAGTTTCCAGT-3'；如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列为：5'-AAATACAGAATCATGTCTTGAA-3'；如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列为：5'-ACACCTAAAGATGACAATTTGAG-3'；如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列为：5'-CCGTTCTTATGGAAGCCGGG-3'；如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列为：5'-ACTGGAGTACACAAGGCAATGTT-3'；如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列为：5'-TGCTCTTCTGCAGTCTTTATTAGC-3'；如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列为：5'-TGCCAAGTTACTTACATTTTCAGTT-3'；如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列为：5'-CTTTTTTGCTTTTACTGATTAAC-3'；如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列为：5'-TGTAATTCATTTTATTCCTAATAGCTC-3'；如SEQ ID No.13所示的核苷酸序列为：5'-GGTAGCCATAGTATGATTATTTC-3'；如SEQ ID No.14所示的核苷酸序列为：5'-TACCTATTTTTATACCCACAAAC-3'；如SEQ ID No.15所示的核苷酸序列为：5'-AAGAAAGCCTACACCATTTTTG-3'；如SEQ ID No.16所示的核苷酸序列为：5'-CCATCTTGCTTCATACTTTTCTG-3'；如SEQ ID No.17所示的核苷酸序列为：5'-ACCTATAGTCTAAATTATACCATC-3'；如SEQ ID No.18所示的核苷酸序列为：5'-AAAGTAGTCATGGCATTAGTG-3'；如SEQ ID No.19所示的核苷酸序列为：5'-AAGGATGATATGTCGCGAACTTTG-3'；如SEQ ID No.20所示的核苷酸序列为：5'-TGGCCCGAGCCTCTTTACTG-3'；如SEQ ID No.27所示的核苷酸序列为：5'-GCTTGGCTTCAAGTTGTCTTT-3'；如SEQ ID No.28所示的核苷酸序列为：5'-CAGAGTGAGACCCTGCCTC-3'；如SEQ IDNo.29所示的核苷酸序列为：5'-GCAACTAGTATGATTTTATGTATAAA-3'；如SEQ ID No.30所示的核苷酸序列为：5'-GCCAAACATGAAATTCATATTATAG-3'；如SEQ ID No.33所示的核苷酸序列为：5'-ACTGGCAACATGACTGTCCTTTC-3'；如SEQ ID No.34所示的核苷酸序列为：5'-GCAAACCTCGCTTTGAAGAAG-3”；如SEQ ID No.41所示的核苷酸序列为：5'-AAAGAATATGAGGTAGCCCACAGGA-3'；如SEQ ID No.42所示的核苷酸序列为：5'-TCCAGCATTTAGGGGTAGCATC-3'。

可理解，上述引物都是独立分开的，即使是扩增上述特定基因片段的引物对，也都是分装的，可根据实际需要扩增的片段进行引物对的重新组合。

在其中一些实施例中，各扩增引物对进行扩增得到的片段长度为120bp～300bp。

本申请还提供一种上述核酸组合物在制备家族性腺瘤息肉病的诊断产品中应用。

在其中一些实施例中，上述诊断产品为试剂盒。

本申请还提供一种用于诊断家族性腺瘤息肉病的试剂盒，包含上述的核酸组合物。

在其中一个实施例中，上述试剂盒用于执行以下方法中的任意一种：实时荧光定量PCR和长片段PCR。

在其中一个实施例中，上述试剂盒还包括核酸提取试剂、PCR扩增试剂、测序试剂及电泳检测试剂中的至少一种，具体地，PCR扩增试剂包括实时荧光定量PCR扩增试剂和长片段PCR扩增试剂中的至少一种。

可理解，上述试剂盒，可精准定位APC基因大片段缺失的缺失断点序列信息。

本申请还提供一种非疾病的诊断和治疗目的的APC基因大片段缺失的检测方法，包括以下步骤S10、步骤S20、步骤S30、步骤S40、步骤S50、步骤S60及步骤S70。

步骤S10：提取健康对照样本及待测样本的核酸，获取健康对照样本及待测样本；

在其中一个实施例中，步骤S10中，待测样本选自外周血、产前诊断相关样本中的一种或多种。

进一步地，步骤S10中，待测样本选自患者的外周血。

在其中一个实施例中，上述待测样本为基因组DNA。

在其中一个实施例中，上述提取健康对照样本及待测样本包括使用磁珠法全血DNA提取、盐析法全血DNA提取或膜法全血DNA提取。

在一个具体的示例中，通过磁珠法提取核酸，获得待测样本中的基因组DNA。

步骤S20：以获取的健康对照样本及待测样本为模板，分别对APC基因相应片段进行定量PCR扩增反应，其中，定量PCR扩增反应所用的引物对包括上述核酸组合物。

在其中一些实施例中，步骤S20中，定量PCR扩增反应的反应体系包括：10μL的定量PCR反应液、2.5μL的正向引物对、2.5μL的反向引物对及0.5μL～5μL的核酸样本。

在一具体示例中，上述定量PCR反应液为2×SYBR Green QPCR Mix。

在其中一些实施例中，步骤S20中，定量PCR扩增反应的程序设置为：94℃～96℃预变性8min～12min；94℃～96℃变性8s～15s，58℃～65℃退火8s～15s，70℃～74℃延伸8s～15s，并收集荧光信号，循环40次～45次。

在一个具体示例中，定量PCR扩增反应的程序设置为：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸10s，并收集荧光信号，循环45次。

步骤S30：分析实时荧光定量PCR扩增反应结果，确定APC基因是否存在缺失的基因片段。

在其中一个实施例中，步骤S30中，分析实时荧光定量PCR扩增反应结果，确定APC基因缺失的基因片段的步骤包括步骤S31～步骤S34。

步骤S31：分别获取健康对照样本利用上述核酸组合物扩增的Ct值及相应荧光基团通道扩增曲线及内标引物扩增的Ct值，待测样本利用上述核酸组合物扩增的Ct值及相应荧光基团通道扩增曲线及内标引物扩增的Ct值。

步骤S32：根据Ct值计算健康对照样本和待测样本相应APC基因片段的拷贝数。

具体地，利用△△CT法分析各目的基因的拷贝数，公式为：待测样本的目的基因拷贝数＝2

步骤S33：比对健康对照样本和待测样本相应APC基因片段的拷贝数，得到比对结果。

进一步地，比对结果包括待测样本相应APC基因片段的拷贝数与健康对照样本相应APC基因片段的拷贝数的比值。

步骤S34：根据比对结果，确定APC基因是否存在缺失的基因片段。

进一步地，若比值接近于1，则为双拷贝，结果表现为不存在缺失；若比值接近于0.5，则为单拷贝，结果表现为存在缺失。

步骤S40：从上述核酸组合物中找到APC基因缺失的基因片段的外部引物对进行长片段PCR扩增反应。

在其中一些实施例中，上述APC基因缺失的基因片段的外部引物对包括正向引物和反向引物，正向引物位于缺失的基因片段的5’断裂点的上游，反向引物位于缺失的基因片段的3’断裂点的下游。

在其中一些实施例中，步骤S40中，上述外部引物对相应的正向引物选自SEQ IDNo.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQ IDNo.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ ID No.31、SEQ ID No.33、SEQ ID No.35、SEQ IDNo.37、SEQ ID No.39或SEQ ID No.41。

在一具体的示例中，上述长片段PCR扩增反应的正向引物为SEQ ID No.23。

在其中一些实施例中，反向引物选自SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ IDNo.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.34、SEQ ID No.36、SEQ ID No.38、SEQ ID No.40或SEQID No.42。

在一具体的示例中，上述长片段PCR扩增反应的反向引物为SEQ ID No.42。

在其中一些实施例中，长片段PCR扩增反应的体系包括4μL的dNTPs、5μL的PCR缓冲液、1μL的正向引物对、1μL的反向引物对、1μL的DNA聚合酶及0.5μL～5μL的核酸样本。

在其中一些实施例中，长片段PCR扩增反应的程序设置为：94℃～96℃预变性3min～5min；94℃～96℃变性35s～45s，58℃～65℃退火35s～45s，70℃～74℃延伸110s～130s，循环30次～40次，以70℃～74℃保存8min～10min，再以2℃～5℃保存3min～7min。

在一个具体示例中，长片段PCR扩增反应的程序设置为：95℃预变性3min；94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸120s，循环35次，以72℃保存10min，再以4℃保存5min。

步骤S50：对长片段PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

在其中一个实施例中，步骤S50中，配置1％～2％(W/V)浓度的琼脂糖凝胶，分别取3μL～5μL PCR扩增产物和DL2000DNA Marker(擎科生物)点入胶孔中，120V电泳20min～40min，成像拍照。

在其中一个实施例中，步骤S50中，通过琼脂糖凝胶电泳确定PCR扩增产物的条带大小无误。

步骤S60：将长片段PCR扩增得到的产物进行测序检测。

在其中一个实施例中，步骤S60中，测序方法为Sanger测序。

在其中一个实施例中，步骤S60中，使用与长片段PCR扩增引物相同的引物对进行测序。

步骤S70：分析APC基因大片段缺失的情况。

在其中一个实施例中，步骤S70中，将步骤S60测序得到的序列与健康对照样本APC的基因的DNA序列进行比对，确定APC基因大片段缺失的断点序列。

上述检测APC基因大片段缺失的核酸组合物及试剂盒，针对APC基因突变的特点，选择APC基因突变长片段作为检测对象，通过选用特定的定量PCR扩增引物进行定量PCR扩增，并对扩增反应结果进行分析，确定APC基因是否存在缺失的基因片段，进一步结合长片段PCR进行扩增，选用特定的正向引物和反向引物进行长片段PCR扩增缺失基因片段，并对长片段扩增产物进行测序，可以检测APC基因大片段的缺失断点序列信息。其中，在长片段PCR扩增阶段的引物可根据预测缺失的基因片段，对定量PCR引物进行重新组合应用，方便灵活；整个实验操作简单，且能精准显示APC基因大片段的缺失断点序列信息。为临床APC基因缺失突变的基因诊断及后期生殖干预的应用提供了技术支撑。

下面结合具体实施例对本申请作进一步说明，但不应将其理解为对本申请保护范围的限制。

实施例1

1、病例信息

(1)如图1所示，先证者(IV-5)，17岁因便血行肠镜检查，见结肠内大量(>100枚)息肉，诊断为FAP，行结肠切除并回肠直肠吻合术，术后病理检查结果为“腺瘤”。先证者姐姐(IV-4)，16岁诊断为FAP，19岁行结肠切除术治疗。先证者父亲(III-3)，42岁因便血、腹痛行肠镜检查，发现结肠布满“葡萄样”大小息肉，诊断为FAP，行全直肠结肠切除术并回肠袋-肛管吻合术治疗。先证者姑姑(III-2)，20～30岁间有便血，因结肠癌去世。先证者爷爷(II-2)，25岁时因便血行肠镜检查，发现肠内大量息肉，行结肠切除术，同年因大出血去世。先证者曾祖父(I-1)，年轻时有便血症状，30岁前去世。

(2)经充分知情同意，签署知情同意书，先证者(IV-5)及其父亲(III-3)、姐姐(IV-4)以及健康亲属先证者母亲(III-4)、奶奶(II-1)各抽取2mL EDTA-K2抗凝外周血，提取基因组DNA。

(3)先证者首先利用常规PCR-Sanger测序，检测APC基因编码区点突变，结果为阴性，未检出可能与疾病相关的致病变异。但检出多个高频SNP位点，且从4号外显子以后，均为纯合基因型(表1)。因此怀疑11～15号外显子可能存在缺失。

表1

2、定量PCR扩增

(1)抽取受检者EDTA-K2抗凝外周血2mL，参考QIAamp DNA Mini Kit试剂盒方案，抽提gDNA样本，检测gDNA浓度，将样本浓度稀释至5ng/uL。

(2)在步骤(1)的基础上，根据APC基因的15个外显子、部分内含子以及5’UTR及3’UTR区，设计特异性扩增引物，引物信息如表2所示。根据表3所示配制待测样品的定量PCR反应体系，定量PCR反应液为2×SYBR Green QPCR Mix；DNA模板为家族性腺瘤息肉病患者或其家属的外周血gDNA。

表2引物信息

表3定量PCR反应体系

定量PCR实验设置一组健康人样本作为正常对照，设置一组去离子水样本作为阴性对照，同时加入内参ALB基因(SEQ ID No.43：5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3'；SEQ IDNo.44：5'-ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3')。

将上述配制好的定量PCR反应体系按照如下程序进行扩增：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸10s，并收集荧光信号，循环45次。

结果判断：内参ALB基因扩增正常(CT值≤32)，各目的基因片段CT值＜36，阴性对照无信号，结果有效。利用△△CT法分析各外显子拷贝数，公式为：被检样本的基因拷贝数＝2

结果分析：先证者与正常对照Q-PCR的扩增曲线如图2所示，第一外显子与第二3’UTR：先证者扩增曲线与正常对照重叠。第二外显子、第三外显子、第四外显子及第一3’UTR:先证者扩增曲线较正常对照延后一个循环起峰。检测目的基因Ct值如表4所示，检测目的基因相对于正常对照的拷贝数如图3所示，先证者的APC基因第一外显子与第二3’UTR区域拷贝数正常，为双拷贝，无缺失。而第二外显子、第三外显子、第四外显子及第一3’UTR的拷贝数仅为正常对照的一半，为单拷贝，此基因片段存在缺失。

表4

3、长片段PCR

根据图3及表4所示的结果，选择连续缺失片段两侧最接近的正向引物和反向引物进行长片段PCR扩增，正向引物为表2所列内含子的正向引物，反向引物为表2所列第二3’UTR的反向引物。根据表5所示配制待测样品的长片段PCR反应体系。

表5长片段PCR扩增反应体系

将上述配制好的长片段PCR反应体系按照如下程序进行扩增：95℃预变性3min；94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸120s，循环35次，以72℃保存10min，再以4℃保存5min。

3.1、琼脂糖凝胶电泳

(1)配制1.5％琼脂糖凝胶：称取1.5g琼脂糖(TSJ001，擎科生物)于锥形瓶中，加入100mL的1×TAE缓冲液(TSG001，擎科生物)，微波炉大火加热3min溶解，冷却到35℃左右，加4μL核酸染料(TSJ003，擎科生物)混合均匀，倒入安装好的制胶模具中，室温冷却成型。

(2)分别取3μL PCR扩增产物和DL2000 DNA Marker(TSJ011-100，擎科生物)点入胶孔中，120V电泳30min，成像拍照。

扩增产物利用1.5％的琼脂糖凝胶，120V，30分钟电泳，结果如图4，可见家族内的患者：先证者(IV-5)、父亲(III-3)、姐姐(IV-4)在3000bp处均可见特异性扩增条带，而家族内未见相关症状的成员先证者母亲(III-4)、奶奶(II-1)以及正常对照均无扩增产物。

3.2、测序分析

将特异性条带切胶纯化后，利用与长片段PCR扩增用相同的引物对送往擎科生物科技有限公司(北京，中国)进行Sanger测序。

结果显示先证者(IV-5)、父亲(III-3)、姐姐(IV-4)的APC基因范围内存在chr5:112,160,628～chr5:112,183,669共23040bp的杂合缺失。缺失片段包括外显子11、12、13、14、15。且断点连接处有T碱基插入，如图5所示。测序结果确定了家族内APC基因存在大片段缺失，且明确了断点序列，同时完成了家系分析，证明这一大片段缺失在家族内存在基因型-表型共分离，符合致病特点。

实施例2

测定APC基因大片段缺失的检测试剂盒的灵敏度

1、将正常对照与先证者的DNA样本分别梯度稀释成8ng/uL、4ng/uL、2ng/uL、1ng/uL、0.5ng/uL、0.25ng/uL、0.125ng/uL。利用实施例1中第一外显子扩增引物对、第二外显子扩增引物对、第三外显子扩增引物对、第四外显子扩增引物对、第一3’UTR扩增引物对及第二3’UTR扩增引物对对各梯度下的正常对照与先证者的DNA样本进行定量PCR检测，定量PCR反应的体系如表3所示。

定量PCR实验设置一组健康人样本作为正常对照，设置一组去离子水样本作为阴性对照，同时加入内参ALB基因(SEQ ID No.43：5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3'；SEQ IDNo.44：5'-ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3')。将上述配制好的定量PCR反应体系按照如下程序进行扩增：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸10s，并收集荧光信号，循环45次。

表6不同稀释浓度样本Q-PCR检测结果

结果分析：所得结果如表6，可见将样本浓度降低至0.25ng/uL时，依然能分辨出患者第二外显子、第三外显子、第四外显子及第一3’UTR拷贝数减半，第一外显子、第二3’UTR的拷贝数正常。但浓度降低至0.125ng/uL时，患者第二外显子、第三外显子、第四外显子引物对无法获得有效数据，而第一外显子、第一3’UTR、第二3’UTR的Ct值已不能准确判断是否存在异常，无法分辨。说明本申请设计的引物用于Q-PCR拷贝数检测时，灵敏度最高可用于检测0.25ng/uL的样本量。

2、长片段PCR

(1)将正常对照与患者的DNA样本分别梯度稀释成8ng/uL、4ng/uL、2ng/uL、1ng/uL、0.5ng/uL、0.25ng/uL、0.125ng/uL、0.063ng/uL、0.031ng/uL、0.016ng/uL、0.008ng/uL。取本申请的Intron 10F为上游引物，表1所列UTR3-2 R为下游引物，组成长片段PCR引物对。根据表5所示配制待测样品的长片段PCR反应体系。将上述配制好的长片段PCR反应体系按照如下程序进行扩增：95℃预变性3min；94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸120s，循环35次，以72℃保存10min，再以4℃保存5min。

(2)琼脂糖凝胶电泳

扩增产物利用1.5％的琼脂糖凝胶，120V，20分钟电泳。

结果如图6，图6为先证者IV-5DNA样本稀释至8ng/uL、4ng/uL、2ng/uL、1ng/uL、0.5ng/uL、0.25ng/uL、0.125ng/uL、0.063ng/uL、0.031ng/uL、0.016ng/uL、0.008ng/uL时，Intron 10F/UTR3-2R引物对扩增结果。可见患者样本最低稀释至0.125ng/uL时，仍可扩增出缺失的产物片段，而正常样本在8ng/uL时无产物检出。说明本项目设计的引物用于精准扩增缺失片段的扩增时，灵敏度和特异性均较好。

综上，本申请提出的以gDNA为基础的定量PCR结合长片段PCR技术，实现了APC基因全范围内的缺失检测。整个方案实验操作简单，检测成本低，灵敏度高，且能精准显示缺失断点序列信息，为临床APC基因缺失突变的基因诊断及后期生殖干预的应用提供了技术支撑。因此，在患者发病前通过基因检测精准预测发病风险，及时进行健康管理，可有效降低患者的医疗负担和癌变风险。同时，针对育龄期APC基因突变携带者，及时提供单基因病植入前遗传学检测(Preimplantation Genetic Testing for Monogenic，PGT-M)及产前诊断等生殖干预，还能有效阻断FAP在家族内的传递，降低疾病发生率。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。