一种枯草芽孢杆菌FF02及其在肠道调节与尿酸、胆固醇代谢的应用

摘要

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌FF02及其在肠道调节与尿酸、胆固醇代谢的应用。本发明所提供的枯草芽孢杆菌具体为枯草芽孢杆菌FF02(Bacillus subtilis FF02)，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.25463。本发明的枯草芽孢杆菌FF02(Bacillus subtilis FF02)CGMCC No.25463具有良好的降尿酸、降胆固醇功能，同时能够抑制肠道中有害细菌的生长，调节肠道菌群，促进肠道中嘌呤和尿酸的分解代谢，调控尿酸、胆固醇代谢。同时，本发明的枯草芽孢杆菌可制成菌剂用于预防或治疗高尿酸血症、痛风或高胆固醇血症，是一种绿色、安全的益生菌菌剂。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌FF02及其在肠道调节与尿酸、胆固醇代谢的应用。

背景技术

随着愈来愈丰盛的饮食使得人们对高蛋白、高脂肪的摄入不断增加，从而提高了许多疾病发生的几率，如：高尿酸血症。长期的高尿酸会引起痛风、高血压、心血管疾病及糖尿病等相关代谢障碍及疾病。痛风已成为我国仅次于糖尿病的第二大代谢性疾病，严重威胁着人们的健康。市场上常用的治疗高尿酸血症的方法主要是服用合成药物，包括别嘌呤醇、非布司他等，但这类药物长期服用会损伤肠胃、肾脏，引起红斑、光过敏等诸多不良影响，这些药物的副作用越发引起人们的担忧。

长期高脂肪的摄入还会导致高胆固醇血症，高胆固醇血症患者通常没有明显的症状，多数情况下是在检查其它疾病或体检时才被发现，也有一些患者是在中风或心脏病发作的危险阶段才被发现。高胆固醇血症可以引起一些严重危害人体健康的疾病，主要有以下几种典型的疾病：(1)动脉粥样硬化：胆固醇的异常升高是动脉粥样硬化最主要的危险因素之一。(2)冠状动脉疾病：动脉粥样硬化是引起冠状动脉疾病的主要诱因之一，该疾病的特点是胆固醇的积累和在动脉壁形成的纤维斑块使作用于心肌供血的动脉缩小,进而限制血液的流动使满足心脏供血的氧气严重不足。(3)心肌梗死：心肌梗死是指当血液和氧气供应在一个或多个心脏动脉中部分或完全受阻，导致心脏细胞损伤或死亡的一种疾病。研究表明大约四分之一的心肌梗死患者中是高胆固醇血症患者。(4)缺血性中风：通常是由于动脉被血块或动脉粥样硬化斑块堵住，使大脑中的小血管中脱落引发的疾病。目前为止，药物治疗仍旧是治疗高胆固醇血症的主要方式。治疗过量胆固醇的药物主要为存在五种类型，他汀类、胆汁酸螯合剂、贝特类药物、烟酸和抑制胆固醇吸收的药物，其中他汀类药物是使用最为广泛和最为有效的。他汀类药物的副作用主要表现为胃肠道的不舒服、肌肉疼痛和晕眩。当同时服用两种或以上他丁类药物时，上述症状会更加严重。也有报道表明他汀类药物还会溶解横纹肌、提高血清转氨酶的含量、诱发原发性心肌病。还有临床试验表明，长期使用他汀类药物还极易诱发II型糖尿病。因此急需开发一种新的替代药物治疗的降胆固醇的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌FF02及其在肠道调节与尿酸、胆固醇代谢的应用。我们从山楂酵素中筛选得到的枯草芽孢杆菌FF02具有良好的降尿酸、降胆固醇功能，同时能够抑制肠道中有害细菌的生长，调节肠道菌群。

为了实现本发明的上述目的，采用了以下技术方案：

一种枯草芽孢杆菌FF02，该枯草芽孢杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称：CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCC No.25463。

上述的枯草芽孢杆菌的培养物。

上述的枯草芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的培养物在制备菌剂中的应用。

进一步地，上述枯草芽孢杆菌或其培养物用于调节肠道菌群和/或预防或治疗高尿酸血症、痛风和/或高胆固醇血症。

进一步地，上述枯草芽孢杆菌总活菌数不低于10

一种菌剂，所述菌剂包括上述枯草芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的培养物。

进一步地，上述枯草芽孢杆菌总活菌数不低于10

术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物(培养容器内的所有物质，发酵产物)的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明所提供的枯草芽孢杆菌FF02能够显著降低降尿酸、胆固醇水平，显著缓解高尿酸血症、高胆固醇血症，使血尿酸水平基本恢复正常水平，显著减缓高尿酸引发的炎症反应，提高免疫力，缓解高尿酸血症、高胆固醇血症带来的不良影响，同时，还可使肠道微生物菌群中典型益生菌的丰度提高，改善肠道菌群结构，是一种安全、有效的益生菌。

保藏说明

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所保藏日期：2022年08月1日

菌种名称：枯草芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus subtilis

菌株编号：FF02

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.25463

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1为本发明枯草芽孢杆菌FF02菌株系统发育进化树。

图2为山楂酵素样品处理后涂布于尿酸平板37℃培养后菌落生长情况图。

图3为分离出的枯草芽孢杆菌FF02菌株于尿酸平板37℃培养后菌落生长情况图。

图4为枯草芽孢杆菌FF02菌株24h内的生长和尿酸代谢曲线。

图5为枯草芽孢杆菌FF02菌株24h内的生长和胆固醇代谢曲线。

图6为枯草芽孢杆菌FF02菌株4h内胆固醇代谢曲线。

图7为小鼠血清尿酸指标图。

图8为枯草芽孢杆菌FF02影响下小鼠肠道菌群微生物多样性分析结果图。

图9为小鼠代谢差异火山图。

图10为小鼠免疫水平变化图。

图11为小鼠组织切片结果图。

(A)为对照组肝脏；(B)为FF02益生菌组肝脏；(C)为对照组肾；(D)为FF02益生菌组肾；(E)为对照组大肠；(F)为FF02益生菌组大肠；(G)为对照组小肠；(H)为FF02益生菌组小肠。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1降尿酸益生菌的筛选及鉴定

(一)实验材料

样品

本专利的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)筛选自山楂酵素样品，为降尿酸芽孢杆菌属，保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC No.25463。

培养基

尿酸固体培养基：取硫酸镁0.5g/L，氯化钠0.1g/L，三水合磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L,尿酸2g/L，琼脂20g/L，再利用10mol/L NaOH溶液调节pH到7；121℃高温高压蒸汽灭菌20min，倒板，存于4℃冰箱。

MRS培养基：取蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母膏4g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸三氨2g/L，三水合乙酸钠5g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，四水合硫酸锰0.05g/L，吐温80 1g/L，再利用10mol/L NaOH溶液调节pH到6.2；121℃高温高压蒸汽灭菌20min，倒板，存于4℃冰箱中备用。

LB培养基：取酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，去离子水1000mL，若需固体培养基则再加入20g/L琼脂，再利用10mol/L NaOH溶液调节pH到7；121℃高温高压蒸汽灭菌20min，4℃冰箱中备用。

MRS-CHOL培养基：取胆固醇1.0g，吐温20g，牛胆盐3.0g水浴加热使胆固醇溶解，加入MRS培养基。

(二)菌种筛选

取3g样品于50mL塑料离心管中，加入20mL无菌水后，置于震荡仪上充分震荡。震荡完成后，使用高速冷冻离心机，于4℃，8000r/min离心5分钟后，取100μL涂布于尿酸固体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养24h。将长出的单菌落划线于MRS平板，37℃培养，进行多次分离纯化直至长出形态一致的单菌落，命名为FF02。

(三)菌种鉴定

16S rDNA基因序列系统进化分析

16S rDNA基因PCR扩增

以基因组DNA为模板PCR扩增16S rDNA基因，扩增引物采用27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')(SEQ ID NO:2)和1492R(5'-TACGACTTAACCCCAATCGC-3')(SEQID NO:3)(均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)。PCR反应体系(20μL)：引物各1μL，Prime STAR酶10μL，DNA模板8μL，ddH

(四)序列比对与系统进化分析

将上述无杂带样品送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将得到的测序结果的序列拼接，在NCBI数据库(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行比对，根据细菌16S rRNA基因序列相似性，利用MEGA 7.0软件进行系统进化分析。枯草芽孢杆菌FF02的16S rDNA序列如下：

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菌株FF02的测序结果与NCBI数据库中已知标准菌株比对表明，该菌株与枯草芽孢杆菌的同源性最高，达100％，FF02菌株系统发育进化树见图1。(五)全基因组测序与功能分析

用50mL MRS液体培养基以37℃、200rpm隔夜培养FF02菌株至OD600nm＝1.0，以8000rpm离心10min，去除上清液，将菌体送广东美格基因科技有限公司(美格基因)进行基因组测序及分析。

实施例2体外实验的功效验证

(一)平板对峙实验

山楂酵素样品涂布于尿酸平板培养后的图片，如图2。由图2可知，酵素样品中存在可降解尿酸的菌株。

从图中可以看到有明显的白色菌落，同时部分菌落旁还形成了尿酸降解圈。将上述平板中的菌落分别挑取到新的尿酸平板上，划线分离纯化得到单菌落。图3为FF02菌株在尿酸平板上的生长情况。结果显示，分离出来的单株菌也存在尿酸降解能力，部分菌株的菌落旁还存在降解圈。

(二)生长代谢曲线与尿酸代谢曲线

1.菌株的活化

从冰箱中找到保存的甘油管，用接种环划线到MRS平板上，置于37℃恒温培养36h至有单菌落生成；挑取单菌落接种到7mL液体MRS培养基中，置于37℃摇床培养20h至平台期。

2.接种

取高压蒸汽灭菌后的50mL离心管，每根离心管中加入14.25mL LB液体培养基，600μl 20mmol/l的尿酸标准样品，150μl隔夜培养的菌液，置于37℃摇床培养，每株菌做3个平行组。

3.菌体浓度的测定

从接种为0h开始，每隔2h取200μl菌液于96孔板中，置于酶标仪测定OD

4.尿酸含量的测定

从接种为0h开始，每隔2h取100μl菌液，采用尿酸含量检测试剂盒测定菌液中的尿酸含量。测定到24h时结束，结果如图4所示，经过24h的培养，FF02菌株前0到4h处于快速生长期，尿酸含量先升后降，4h时降低了接近500μmol/L；4到20h属于减速期，尿酸含量回升到600μmol/L，后又稍微下降；20到24h处于稳定期，尿酸含量在此阶段下降很快，从20h的600μmol/L降至250μmol/L左右，总体降解比例达到了69％。

(三)胆固醇降解试验

1.胆固醇降解菌株24h生长和代谢曲线分析

取筛选出的菌的单菌落及实验室现有的菌株接种到15ml液体MRS培养基中，置于37℃摇床培养12h，将培养基全部倒入100ml MRS液体培养基中，于37℃摇床培养12h。

向灭菌后的50ml离心管中定量加入14.85ml MRS-CHOL液体培养基，150μl隔夜培养的菌液，置于37℃摇床培养。

从接种为0h开始，每隔2h取200μl菌液于96孔板中，置于酶标仪测定OD

从接种为0h开始，每隔2h取10μl菌液，使用邻苯二甲醛法测定菌液中的胆固醇含量。测定到24h时结束。

菌株24h内的生长和胆固醇代谢曲线如图5所示，菌FF02在0h～2h时处于迟缓期，此时菌生长较慢，胆固醇降解速率最大；2h～8h时菌进入生长期，生长速率平滑上升；8h后菌生长速率慢慢下降，胆固醇降解速率从4h开始随时间下降。

2.胆固醇降解菌株大剂量接种4h生长和代谢曲线分析

取筛选出的菌的单菌落及实验室现有的菌株接种到15ml液体MRS培养基中，置于37℃摇床培养12h，将培养基全部倒入100ml MRS液体培养基中，于37℃摇床培养12h。

活化完成后，使用酶标仪测定菌液的OD

向含有菌体的离心管中加入15ml MRS-CHOL液体培养基，置于37℃摇床培养。

从接种为0h开始，每隔1h取200μl菌液于96孔板中，置于酶标仪测定OD

从接种为0h开始，每隔1h取10μl菌液，使用邻苯二甲醛法测定菌液的胆固醇含量。测定到4h时结束。

菌株4h内胆固醇代谢曲线如图6所示，高密度接种后菌株FF02后在4h时胆固醇代谢量有所提高。

实施例3小鼠动物实验

(一)小鼠养殖及分组

选用48只SPF级ICR雄性小鼠(体重大约在16-20g)，每笼6只，两笼为一组，编号为A、B、C、D组，分别对应对照组、模型组、益生菌组、治疗组，具体处理如下：

表1小鼠养殖分组及处理表

每天12:00-14:00，将隔夜培养的菌液(此时已培养12-14h，根据经验值在对数生长期末期或平台期前期)测OD

养殖15天后对每组小鼠体长及肢端情况进行测量和拍照记录，取各组小鼠眼球血、肾、肝、小肠、大肠，每组一只小鼠组织固定于4％多聚甲醛固定液中，常温固定一天以上。

(二)小鼠血清尿酸含量变化

将小鼠眼球血于4℃、3000rpm离心15分钟，吸取上清为血清。用尿酸含量检测试剂盒(Solarbio)测定不同处理组小鼠血清中尿酸浓度，对比不同组间小鼠血清中尿酸浓度差异，结果如图7所示。由图7可知，高尿酸模型组尿酸含量显著高于对照组的正常水平，而FF02益生菌组尿酸水平与对照组相近，处于正常水平；FF02治疗组与高尿酸模型组对比，尿酸含量显著下降，且低于正常水平，说明FF02菌株具有明显降低小鼠血清中尿酸浓度的功效。

实施例4小鼠肠道菌群结构的影响

刮取小鼠小肠黏膜层样品以及小鼠粪便浸出液，液氮研磨后用CTAB法提取样品中的总DNA，将其送测序公司执行高通量测序，并将测序结果与数据库进行比对，进行序列分析和物种注释，珊瑚共生菌多样性组成根据OTU注释结果得到，并分析各组样品中菌群在纲、科、属等分类水平上的分布，获得小鼠肠道共生菌群中各菌种的丰度变化。

根据16S rDNA高通量测序获得的微生物多样性分析结果，FF02在肠道微生物中并未检出，说明益生菌可能不容易在小鼠肠道定殖。

组间差异显著性分析结果(图8)来看，E组(FF02益生菌组)中丰度与A组相差不大，说明FF02对小鼠没有产生不良影响。B组(高尿酸模型组)与A组(对照组)相比，Lactobacillus丰度显著下降，Ligilactobacillus丰度显著提高，这可能是对高尿酸血症中尿酸代谢变化的原因之一。F组(FF02治疗组)的Candidatus arthromitus显著提高，可能是起到治疗作用的关键菌株之一。说明枯草芽孢杆菌FF02的作用下，小鼠肠道微生物菌群中典型益生菌的丰度提高，肠道菌群结构得以改善。

实施例5小鼠代谢组分析

(一)两组间代谢差异火山图

如图9A所示，B(模型)比A(空白)的代谢产物中，上调的居多，说明高尿酸模型中尿酸的添加显著提高宿主的代谢水平，其中，尿酸含量没有显著差异。上调最大的产物为：4-O-(Indole-3-acetyl)-D-glucopyranose(4-O-吲哚-3-乙酰基-D-吡喃葡萄糖)、lactucin(莴苣苦素)，下调较多的是Ascorbyl stearate(抗坏血酸硬脂酸酯)、3’-Methyloxindole(3'-甲基氧吲哚)

如图9B所示，F(治疗)比E(益生菌)的代谢产物中，上调的居多，上调最多的是Oleuropein(橄榄苦苷，脂类)，此外上调较多的还有Gardenin B(栀子素B)，Cirsilineol(西西林醇)，All-tans-18-Hydroxyretinoic acid，下调最多的是Equol(雌马酚)，下调较多的还有Deferitazole(去铁唑)，Coumarinate(顺式-2-羟基肉桂酸酯；2-香豆酸酯)，8-Deoxylactucin(8-脱氧肌苷)，Calanolide A(卡拉诺利德A)说明治疗组比益生菌组的代谢水平更高，可能是病症会在一定程度上激发某些代谢机制。

如图9C所示，E(益生菌)比A(空白)的代谢产物调整不太明显，差异相对较小，上调的稍多，说明益生菌对宿主代谢水平提高有一定促进作用。其中上调最多的成分是Galactosyl 4-hydroxyproline(半乳糖基4-羟脯氨酸)，下调最多的是Hebevinoside XIV,此外，上调较多的还有Oxamyl(草氨酰)、Docosapentaenoic acid(二十二碳五烯酸，DPA)、Lactosamine(乳糖胺)和Alpha-D-Xylopyranosyl-(1->6)-beta-D-glucopyranosyl-(1->4)-D-glucose和Indole-3-acetic-acid-O-glucuronide(吲哚-3-乙酸-O-葡糖苷酸)，下调较多的还有D-Tartaric Acid(D-酒石酸)、Velpatasvir(维帕他韦)

如图9D所示，F(治疗)比B(模型)的代谢产物下调稍微偏多，Docosapentaenoicacid(22n-6)(二十二碳五烯酸(22n-6)，DPA)还有上调较多的有：Rhodinyl acetate(醋酸罗丹宁酯，属于脂肪酸醇),Chloroethyl nitrosourea(氯乙基亚硝基脲，属于羧酸及其衍生物)，Withanolide B(安奈洛德B),Methyl 8-[3-(2-hydroxyoctyl)oxiran-2-yl]octanoate(8-[3-(2-羟基辛基)环氧乙烷-2-基]辛酸甲酯,属于脂肪醇)，下调较多的有Sorbitan oleate(脱水山梨糖醇油酸酯，属于脂肪酸酯)

如图9E所示，F(治疗组)和A(空白)对比，上调的居多，上调最多的是Lysylthreonine(赖氨酸)，此外还有上调较明显的有：Oleuropein(橄榄苦苷)、7-Methylxanthosine(7-甲基黄嘌呤)；下调最多的是O-Acetotoluidide(邻乙酰甲苯胺)，此外Citiolone(西替隆)下调也较多。

E组数据稳定性最好，A、F组较差。A组肠道尿酸含量最高，E、F组的肠道尿酸含量均低于B组，F组最低，说明A组尿酸吸收进入血液的最少，从肠道排出来的尿酸最多；B组肠道尿酸含量低而血清尿酸含量很高，说明B组尿酸排泄可能受到一定阻碍；E组和F组从肠道排出的尿酸含量比B组少，而从血清数据看E、F组总血清含量很低，猜测FF02有较强的转换尿酸为其他产物的能力，使小鼠血清和肠道的尿酸含量都很低。11-羟基十七烷酰肉碱(属于脂肪酸酯)在B组肠道含量显著减少，A、E相近、F略低但仍高于B组

(二)小鼠免疫指标

取新鲜冷冻小鼠肝、肾组织分别称重，每份样本中加入1mL无菌的新配制的PBS缓冲液，用MY-10手持式研磨仪(上海净信，中国)在冰上均匀研碎各种组织。2500rpm低速离心10min收集上清液。用检测试剂盒测定小鼠血清、肾脏、肝脏中IL-1β含量以及血清中肌酐(CRE)含量测定。

由图10可知，高尿酸引发小鼠炎症，引起分泌型免疫球蛋白sIgA和细胞因子IL-1β显著升高；而使用枯草芽孢杆菌FF02后,基本不会对小鼠本身产生太大影响，而治疗组相应指标显著下降，说明枯草芽孢杆菌FF02能显著减缓高尿酸引发的炎症反应，提高免疫力。

(三)组织切片影响

将解剖的小鼠肝、肾组织用PBS缓冲液冲洗干净表面，取肝脏0.8cm×0.8cm，肾脏取一半，使用4％的多聚甲醛溶液常温固定一天以上，将固定后的样本送至兰州大学医学院制作生理切片，并且使用HE染色。切片制作完成后，在显微镜(OLYMPUS BX53，日本)下观察不同组小鼠肝脏、肾脏的受损情况以及尿酸在肾小管处的积累情况，再加标尺拍照记录。结果如图11所示，由图9可知，对照组和益生菌组的组织差异不大，未出现严重的炎症反应和细胞破坏，说明枯草芽孢杆菌FF02不会对小鼠产生有害影响。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。