SESN2和chi-miR-130b-3p在调节由玉米赤霉烯酮诱导的颗粒细胞凋亡中的应用

摘要

本发明公开了SESN2和chi‑miR‑130b‑3p在调节由玉米赤霉烯酮诱导的颗粒细胞凋亡中的应用。本研究发现SESN2和chi‑miR‑130b‑3p参与调控了ZEA在山羊GCs中引起的氧化应激损伤以及细胞凋亡过程。并且过表达SESN2或抑制chi‑miR‑130b‑3p的表达可以减轻ZEA对山羊GCs造成的细胞损伤。因此，SESN2和chi‑miR‑130b‑3p可以作为减轻ZEA毒性的潜在治疗靶点，在实际生产过程中减弱ZEA对生殖细胞的损伤作用，提高雌性动物的繁殖能力。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及SESN2和chi-miR-130b-3p在调节由玉米赤霉烯酮诱导的颗粒细胞凋亡中的应用。

背景技术

真菌毒素是真菌产生的有毒次级代谢产物，它们会污染生长中的作物或储存的粮食。玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)作为一种分布广泛、强效的霉菌毒素，给畜牧业和食品加工业带来了不小的麻烦。除类雌激素作用外(Poor,et al.,2015)，ZEA还会引起细胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的积累(Feng et al.,2022)，导致氧化应激和细胞凋亡(Zhu etal.,2022)。

颗粒细胞(granulosa cells，GCs)对卵母细胞的成熟和卵泡的发育都至关重要。在卵泡发育的早期，GCs会与卵母细胞形成间隙连接(Hasegawa,et al.,2007)，用于信息交流和物质交换，为卵母细胞提供合适的微环境(Zhou,et al.,2019)。随着卵泡的发育，GCs开始分化为MGCs和CCs(Fan,et al.,2009)。MGCs分泌类固醇激素和生长调节因子，促进整个卵泡的生长发育(Yamochi et al.,2021)。CCs与卵母细胞形成COCs，cAMP和氨基酸等营养物质通过间隙连接从GCs转运到卵母细胞(Regassa,et al.,2011)。因此，一旦GCs因外界压力条件而受损，整个雌性生殖系统将受到不利影响。

Sestrins(SESNs)是一个进化上高度保守的应激诱导蛋白家族(Kumar,et al.,2020)，它由Sesterin 1-3组成，在应激条件下上调(Lee,et al.,2013)。作为各种应激诱导的代谢调节因子，SESN2可以通过激活分解代谢反应、停止合成代谢活动和启动细胞修复机制来帮助细胞维持细胞稳态(Pasha,et al.,2017)。KEAP1/NRF2是一种经典的受SESN2调节的信号通路，可降低细胞内ROS水平(Tu et al.,2019)。通常，NRF2与KEAP1在细胞质中结合，形成复合物，此时NRF2维持一种相对较低的表达水平(Yamamoto et al.,2018)。然而，在氧化应激条件下，NRF2会转移到细胞核中并与抗氧化反应元件(AREs)结合，从而通过激活一系列下游氧化还原酶(包括SOD、CAT、HO-1和GPX)的转录来发挥抗氧化功能(Yang,etal.,2019)。但SESN2对GCs中因为ZEA暴露所造成的损伤具体应对机制尚未得到彻底的研究。

miRNA是一种小的非编码RNA序列，大小从18到25个核苷酸不等，在转录后基因表达调控中发挥着关键作用。随着高通量测序技术的快速发展，miRNA的功能越来越多地被人们所熟知。据研究报道，已经有几种miRNA被证实能够调节SESN2的表达，包括miR-182-5p(Zhang,et al.,2022)、miR-138-5p(An,et al.,2021)和miR-199a-5p(Yang,et al.,2022)等。由于ZEA已被证明可导致ROS积累并上调GCs中SESN2的表达水平(Qin,et al.,2015)，因此本研究想了解miRNA是否也参与了这一过程。

发明内容

本发明的目的在于提供SESN2或/和chi-miR-130b-3p在调节GCs凋亡中的应用。

本发明的另一目的在于SESN2或/和chi-miR-130b-3p在调节GCs中ROS的积累和氧化应激损伤。

本发明的又一目的在于提供一种减轻ZEA对GCs造成的细胞损伤的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

SESN2或/和chi-miR-130b-3p在以下(1)或(2)或(3)中的应用，

(1)调节GCs凋亡；

(2)调节GCs中ROS的积累和氧化应激损伤；

(3)减轻ZEA对GCs造成的细胞损伤。

优选的，过表达所述的SESN2或/和干扰所述的chi-miR-130b-3p减弱GCs凋亡；抑制所述的SESN2或/和过表达所述的chi-miR-130b-3p加重GCs凋亡。进一步优选的，所述的GCs凋亡为由ZEA诱导的GCs凋亡。

优选的，过表达所述的SESN2或/和干扰所述的chi-miR-130b-3p能够减轻GCs中ROS的积累和氧化应激损伤；抑制所述的SESN2或/和过表达所述的chi-miR-130b-3p加重GCs中ROS的积累和氧化应激损伤。进一步优选的，所述的GCs中ROS的积累和氧化应激损伤为由ZEA诱导的GCs中ROS的积累和氧化应激损伤。进一步优选的，所述的SESN2或/和chi-miR-130b-3p通过KEAP1/NRF2信号通路影响由ZEA诱导的GCs中ROS的积累和氧化应激损伤。

优选的，过表达所述的SESN2或/和干扰所述的chi-miR-130b-3p能够减轻ZEA对GCs造成的细胞损伤。

一种调节由ZEA诱导的GCs凋亡的方法，过表达所述的SESN2或/和干扰所述的chi-miR-130b-3p减弱由ZEA诱导的GCs凋亡；抑制所述的SESN2或/和过表达所述的chi-miR-130b-3p加重由ZEA诱导的GCs凋亡。

一种调节由ZEA诱导的GCs中ROS的积累和氧化应激损伤的方法，过表达所述的SESN2或/和干扰所述的chi-miR-130b-3p能够减轻由ZEA诱导的GCs中ROS的积累和氧化应激损伤；抑制所述的SESN2或/和过表达所述的chi-miR-130b-3p加重由ZEA诱导的GCs中ROS的积累和氧化应激损伤。

一种减轻ZEA对GCs造成的细胞损伤的方法，过表达SESN2或/和干扰chi-miR-130b-3p减轻ZEA对GCs造成的细胞损伤。

本发明的有益效果：

随着集约化养殖的规模不断扩大，牛、羊等常规放牧饲养的家畜种类也逐渐转为大规模棚舍集中饲养。因此，ZEA中毒事件的发生也愈发频繁。ZEA不仅会扰乱雌性动物的生殖周期，更会损伤颗粒细胞以及卵母细胞在内的生殖细胞，极大的影响雌性动物繁殖能力。本研究发现SESN2和chi-miR-130b-3p参与调控了ZEA在山羊GCs中引起的氧化应激损伤以及细胞凋亡过程。并且过表达SESN2或抑制chi-miR-130b-3p的表达可以减轻ZEA对山羊GCs造成的细胞损伤。因此，SESN2和chi-miR-130b-3p可以作为减轻ZEA毒性的潜在治疗靶点，在实际生产过程中减弱ZEA对生殖细胞的损伤作用，提高雌性动物的繁殖能力。

附图说明

图1为与SESN2存在潜在互作关系miRNAs的筛选；

其中：(A)chi-miR-17-5p、chi-miR-20b以及chi-miR-130b-3p对SESN2在mRNA水平表达量的影响。(B)chi-miR-17-5p、chi-miR-20b以及chi-miR-130b-3p对SESN2在蛋白水平表达量的影响。

图2为SESN2和chi-miR-130b-3p表达量的检测以及互作关系预测；

其中：(A)阴性对照组和ZEA处理组中NR4A1,CHAC1,TRIB3,PPP1R15A和POLR2E的FPKM值。(B)阴性对照组和ZEA处理组中NR4A1,CHAC1,TRIB3,PPP1R15A和POLR2E mRNA水平表达量。(C)SESN2在差异基因火山图中的定位。

(D)阴性对照组和ZEA处理组中SESN2在mRNA水平表达量。(E)阴性对照组和ZEA处理组中SESN2在蛋白水平表达量。(F)SESN2与miRNAs靶向关系预测。(G)阴性对照组和ZEA处理组中chi-miR-130b-3p的FPKM值。(H)阴性对照组和ZEA处理组中chi-miR-130b-3p mRNA水平表达量。

图3为SESN2和chi-miR-130b-3p靶向关系的验证；

其中：(A)野生型以及突变型SESN2过表达质粒序列的构建。(B)chi-miR-130b-3p模拟物效率验证。(C)chi-miR-130b-3p干扰物效率验证。(D)chi-miR-130b-3p模拟物与野生型以及突变型SESN2过表达质粒共转染后双荧光素酶报告结果。(E)阴性对照组和chi-miR-130b-3p模拟物处理组中SESN2在蛋白水平表达量。(F)阴性对照组和chi-miR-130b-3p干扰物处理组中SESN2在蛋白水平表达量。

图4为SESN2的干扰和过表达效率验证；

其中：(A)三条不同位点的干扰序列SESN2在mRNA水平表达的影响。(B)

SESN2干扰序列对SESN2在蛋白水平表达量的影响。(C)SESN2过表达质粒对SESN2在mRNA水平表达的影响。(D)SESN2过表达质粒对SESN2在蛋白水平表达的影响。

图5为SESN2和chi-miR-130b-3p对ZEA引起的GCs凋亡的影响；

其中：(A-D)ZEA和SESN2/chi-miR-130b-3p的过表达/干扰联合处理对GCs细胞活力以及细胞凋亡流式结果的影响。(E-H)ZEA和SESN2/chi-miR-130b-3p的过表达/干扰联合处理对BAX、BCL-2、PCNA等凋亡相关基因在蛋白水平表达量的影响。

图6为SESN2和chi-miR-130b-3p对ZEA引起的GCs氧化应激的影响；

其中：(A-D)ZEA和SESN2/chi-miR-130b-3p的过表达/干扰联合处理对GCs内ROS积累水平的影响。(E-H)ZEA和SESN2/chi-miR-130b-3p的过表达/干扰联合处理对CAT和SOD2等凋亡相关基因在蛋白水平表达量的影响。(I-L)ZEA和SESN2/chi-miR-130b-3p的过表达/干扰联合处理对MDA、CAT、SOD等氧化应激指标的影响。

图7为SESN2和chi-miR-130b-3p对KEAP1/NRF2信号通路的影响；

其中：(A-D)ZEA和SESN2/chi-miR-130b-3p的过表达/干扰联合处理对KEAP1/NRF2信号通路相关蛋白表达量的影响，包括KEAP1、NRF2和HO-1。

图8为SESN2和chi-miR-130b-3p对KEAP1/NRF2信号通路作用模式图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

1.材料与方法

1.1试验材料

本研究所有操作均严格执行南京农业大学《实验动物管理条例》(SYXK2011-0036)。本研究所用山羊卵巢GCs收集于江苏省海门市海门山羊研究院，GCs样品收集后存于液氮(-196℃)中用于后续试验。

1.2试验方法

1.2.1GCs的培养

GCs在6孔培养板中培养，6孔板补充有由DMEM/F12 glutaMAX(Gibco，ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)、10％胎牛血清(FBS)和100U/mL青霉素/链霉素(P/S)组成的完全培养基。所有细胞在37℃，5％ CO

1.2.2过表达载体构建以及基因干扰序列设计

将SESN2的编码结构域序列(CDS)(XM_018056884.1)克隆到pEX过表达载体中(Tsingke，Nanjing，China)。所有微型干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)的阴性对照(si-NC)、SESN2的siRNAs(si-SESN2(740)、si-SESN2(1322)、si-SESN2(1661))、模拟物的阴性对照(mimics-NC)、chi-miR-130b-3p的模拟物(mimics-chi-miR-130db-3p)、抑制剂的阴性对照(inhibitor-NC)和chi-miR-130b-3p抑制剂(inhibitor-chi-miR-130b-3p)均由GenePharma(Shanghai，China)设计和合成，siRNA及chi-miR-130db-3p相关序列见下表1，SESN2过表达序列见下表2。

表1siRNA和chi-miR-130b-3p相关序列Table 1Sequences of siRNA andchi-miR-130b-3p mimics/inhibitor used in this study

表2SESN2过表达序列Table 2Overexpression sequence of SESN2 used inthis study

1.2.3GCs处理及转染

将GCs接种到6孔板中进行转染。当GCs密度达到60-70％时，根据转染试剂说明书方案，将与Lipofectamine 3000试剂(Invitrogen，Waltham，CA，USA)混合的SESN2干扰序列/过表达质粒(南京擎科公司构建合成，NJ0049585-1)或chi-miR-130b-3p的模拟物/抑制剂添加到6孔板中。ZEA粉末(Selleck，Shanghai，China)溶解到200mM二甲基亚砜(DMSO)(Invitrogen，Shanghain，China)中作为浓缩储备溶液，后续试验时用DMEM/F12稀释到处理浓度(200μM)。在收获RNA和蛋白质细胞样品之前12小时，将ZEA添加到完整培养基中。转染后24小时收集细胞进行RNA提取，转染后48小时收集细胞用于蛋白质提取。

1.2.4CCK-8测定细胞活力

将GCs接种在96孔培养板中，培养基含有规定浓度的ZEA(0、50、100和200μmol/L)，并在二甲基亚砜(di-methyl sulfoxide，DMSO)中稀释。用ZEA处理8小时后，将10μL细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)试剂添加到每个孔中，并在37℃，5％ CO

1.2.5流式细胞仪分析GCs凋亡

细胞凋亡分析样品：收集6孔板中所有细胞，包括悬浮在完全培养基中的细胞，并将其储存在DPBS中。样品在2小时内送往南京良维生物科技有限公司进行流式分析。

1.2.6双荧光素酶报告载体试验

将293T细胞接种在24孔板中，将Lipofectamine 3000和100nM的mimics-NC或mimics-chi-miR-130b-3p和0.5ng SESN2 3’UTR的野生型(WT)或突变型(MUT)过表达质粒转染，详细序列见下表3。转染48小时后收集细胞样品，根据试剂盒说明书，使用双萤光素酶报告基因测定系统(Vazyme，Nanjing，China)测定样品荧光强度。

表3SESN2-3’UTR载体序列Table 3The sequences of SESN2-3’UTR vector

1.2.7ROS水平检测

在转染和ZEA处理后，根据说明书使用ROS测定试剂盒(S0033S，Beyotime，Nanjing，China)评估GCs的ROS水平。使用Image J软件(Wayne Rasband，MD，USA)分析ROS的荧光强度。

1.2.8ELISA检测氧化应激相关指标

在转染48小时和ZEA处理12小时后，收集细胞上清液，并根据说明书方案，使用ELISA测定法(Amresco，Shanghai，China)测定包括MDA、SOD和CAT在内的细胞氧化应激相关指数。

1.2.9总RNA的提取及反转录

(1)总RNA的提取

1)收集6孔板中GCs，置于2mL的离心管内，加入1mL Trizol试剂匀浆，室温下放置5min；

2)向1)中加入0.2mL氯仿，上下混匀离心管10s后室温中放置6min，12000g离心15min；

3)取上清液加等体积的异丙醇，上下混匀，室温静置10min；12000g离心10min；

4)吸走上清液体，留白色沉淀物，加入1mL 75％的乙醇，上下轻轻颠倒洗涤离心管壁。4℃，12000g离心5min；

5)重复步骤4)；

6)弃上清，静置10min，晾干EP管中残余酒精。加入10～50μL(视RNA沉淀量估算)无RNA酶水溶解RNA沉淀。

(2)RNA质检

紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度,260/280比值须在1.8-2.0之间，可以进行后续试验。

(3)合成cDNA

用诺唯赞的反转录试剂盒反转录RNA成cDNA，反应体系见表4和表5。其中1*表示在反应体系中根据RNA的浓度来确定加入RNA的体积，保证总RNA的量保持一致(1μg)。

表4去除基因组DNA反应体系

Table 4 The reaction of removing genomic DNA

程序：42℃，2min；4℃保存。

表5反转录反应体系

Table 5 The reverse transcription reaction

程序：37℃15min，85℃5s，4℃恒温。

1.2.10实时荧光定量

使用诺唯赞的荧光定量试剂盒，按说明书操作，反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火30s，共40个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后以GAPDH为内参基因，使用2

表6荧光定量PCR的引物序列信息

Table 6 Sequences used for qRT-PCR

1.2.11蛋白样品的收集与变性

(1)蛋白裂解液:蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂(100:2:1，v:v:v)混合后裂解样品；

(2)冰上静置10min后于高速离心机内4℃，12000g离心10min，收取上清液即为细胞蛋白原液；

(3)按照BCA试剂盒的说明书测定蛋白浓度；

(4)根据提取的蛋白浓度，加入适量的蛋白原液、超纯水、4×的蛋白上样缓冲液和10×的还原剂，使得变性体系中的蛋白浓度一致；

(5)70℃变性10min，保存于-20℃中。

1.2.12蛋白质免疫印迹

(1)上样：预制胶拔掉梳子，每个胶孔中加入10μL变性蛋白样品，两边各预留一孔加入蛋白Marker；

(2)电泳：电压200V，40min；

(3)转膜：半干转25V恒压13min；

(4)封闭：将转膜后的PVDF膜用5％(v/v)的脱脂奶粉封闭2h；

(5)一抗孵育：将封闭后的PVDF膜用一抗孵育，4℃过夜；

(6)二抗孵育：将一抗孵育后的PVDF膜洗3次；随后室温下孵育二抗1h；随后再洗6次；

(7)ECL显影：将PVDF膜浸泡在ECL发光液中30s，在凝胶成像仪中曝光拍照；

(8)光密度分析：采用Image J软件对各条带进行灰度分析。

所涉及的一抗和二抗的抗体信息见表7。

表7抗体信息表

1.3统计方法

使用SPSS 24.0软件(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)对数据进行分析。两组之间数据使用t检验，三组或三组以上的数据使用单因素方差分析(one-way ANOVA)来比较样本之间差异的显著性。每个实验至少重复三次。数据表示为“平均值±标准误差(SEM)”。p

<0.05(*)和p<0.01(**)分别表示显著差异和极显著差异。

2.结果与分析

2.1靶向SENS2的miRNA筛选

利用测序结果本研究挑选了最有可能和SENS2之间存在互作关系的三个miRNA进行了试验验证。三条miRNA分别为chi-miR-17-5p、chi-miR-20b以及chi-miR-130b-3p(序列见表8)。本研究分别在mRNA以及蛋白水平进行了检测，定量结果显示只有chi-miR-130b-3p能在mRNA水平极显著降低SESN2的表达量(p<0.01)(图1A),WB结果表明同样只有chi-miR-130b-3p能够在蛋白水平极显著降低SESN2的表达(p<0.01)(图1B)，因此后续双荧光报告载体试验以及miRNA功能验证均选择chi-miR-130b-3p作为研究对象。

表8三种miRNAs序列

2.2ZEA改变了GCs SESN2和chi-miR-130b-3p的表达

为了探索ZEA对GCs产生细胞毒性作用的确切机制，并寻找减轻ZEA毒性的潜在治疗靶点，本研究对ZEA处理前后的GCs进行了全转录组测序。为了验证测序结果的准确性，随机选择了五个基因来检测它们的表达趋势。qRT-PCR结果显示，所选5个基因的表达趋势与测序结果完全一致，证明测序结果是可靠的(图2A，B)。根据测序结果，本研究发现在ZEA处理后，459个mRNA上调，而3,620个mRNA下调。ZEA组SESN2的表达水平极显著上调(p<0.01)(图2C-E)，表明ZEA可能干扰GCs的细胞内稳态。对miRNA的测序结果分析还表明，几种miRNA可能参与SESN2表达的调节(图2F)。根据miRNA和mRNA相互作用的预测结果，本研究发现chi-miR-130b-3p最有可能与SESN2结合。因此，本研究检测了chi-miR-130b-3p的表达水平，结果发现，在ZEA组中，chi-miR-30b-3p表达水平极显著降低(p<0.01)(图2G，H)。在ZEA组中，chi-miR-130b-3p表达的减少和SESN2表达的增加的趋势初步与chi-miR-30b-3p和SESN2之间可能存在相互作用的预测一致。

2.3chi-miR-130b-3p靶向SESN2 mRNA的3’UTR区域

为了证实chi-miR-130b-3p确实能够对SENS2的表达起到调节作用，本研究进行了双荧光素酶报告测定。测序结果表明chi-miR-130b-3p可以与SESN2 mRNA的3’UTR区域结合。根据这一结果，本研究设计了靶向chi-miRNA-130b-3p和SESN2结合序列的双荧光素酶报告载体，包括野生型(WT)和突变型(MUT)(图3A)。首先本研究通过qRT-PCR结果确定了针对chi-miR-130b-3p设计的模拟序列和干扰序列的有效性(图3B，C)。此后，本研究用chi-miR-130b-3p的模拟序列和SESN2的WT/MUT质粒共同在293T细胞中转染。双荧光素酶报告分析结果显示，chi-miR-130b-3p的模拟序列可显著降低WT-SESN2的荧光强度(p<0.05)，而MUT-SESN2的荧光强度没有改变(图3D)。此外，chi-miR-130b-3p的模拟序列可显著降低GCs中SESN2的蛋白表达(p<0.05)(图3E)，而chi-miR-30b-3p干扰序列可显著增加GCs中SESN2蛋白的表达(p<0.05)。综上所述，这些结果表明chi-miR-130b-3p可以与SESN2 mRNA的3’UTR结合，下调SESN2的表达。

2.4SESN2干扰序列以及过表达质粒效率验证

为了保证后续针对SESN2功能验证研究的准确性，本研究对于SESN2的干扰以及过表达效率进行了验证。针对SESN2的CDS序列本研究设计了3条干扰序列，位点分别处于SESN2 CDS序列的740bp、1332bp、1661bp。荧光定量结果显示位于1332bp和1661bp处的干扰序列均能极显著降低SESN2在mRNA水平的表达量(p<0.01)(图4A)，但是1332bp位点处的干扰序列效果更好。在此基础上本研究进行了蛋白水平的验证，WB结果显示位于1332bp处的干扰序列也能在蛋白水平极显著降低SENS2的表达量(p<0.01)(图4B)，因此后续试验本研究将位于SESN2 CDS序列1332bp处的干扰序列定为si-SESN2处理组。同样的本研究也验证了SESN2的过表达效率，定量结果显示过表达质粒能在mRNA水平上极显著上升(p<0.01)(图4C)；蛋白水平上增加约2倍(p<0.01)(图4D)。综上所述，针对SESN2构建的干扰序列以及过表达质粒效果均显著，可以用于开展后续试验验证。

2.5SESN2/chi-miR-130b-3p对ZEA引起的GCs凋亡的影响

基于大量已有的研究报道称SESN2对于细胞抵抗外界因素刺激具有正向的调节作用(Li et al.,2021,Park et al.,2022,Wu et al.,2021)，本研究尝试研究SESN2是否也可以减轻ZEA在GCs中诱导的细胞毒性损伤。此外，鉴于chi-miR-130b-3p作为SESN2的上游调节因子，本研究猜测chi-miR-130b-3p的表达也可能与ZEA诱导的GCs损伤过程有关。CCK-8结果显示，ZEA会显著降低GC的细胞活力(p<0.01)(图5A-D)。SESN2的过表达和chi-miR-130b-3p的干扰都有恢复受损细胞活力的趋势(图5A，B)。值得注意的是，SESN2的过表达对这一过程有非常显著的影响(p<0.01)(图5A)。相反，SESN2的抑制或chi-miR-130b-3p的过表达会加剧ZEA对GCs细胞活力的损伤，尽管这种影响并不显著(图5C，D)。为了进一步探讨SESN2和chi-miR-130b-3p对ZEA诱导的GCs凋亡的影响，本研究进行了流式分析以检测细胞凋亡水平。结果表明，SESN2的过表达(p<0.05)(图5E)或chi-miR-130b-3p的干扰(p<0.05)可减弱ZEA诱导的GCs凋亡。然而，SESN2(p<0.01)的抑制(图5G)和chi-miR-130b-3p的过表达(p<0.01)(图5H)会加重GCs的凋亡。为了验证这些表型数据，本研究检测了与细胞活力和凋亡相关的几个基因的表达水平，包括BAX、BCL-2和PCNA。与CCK-8和流式细胞检测结果一致，在ZEA处理的基础上，BAX的表达随着SESN2的过表达(p<0.05)(图5I)或chi-miR-130b-3p的干扰(p<0.05)下调(图5J)，而SESN2的干扰或chi-miR-130b-3p的过表达会进一步使BAX的表达量上升。BCL-2和PCNA的趋势则刚好与BAX的趋势相反。总之，这些结果表明SESN2能够在一定程度上恢复ZEA对GC造成的损伤，而chi-miR-130b-3p则发挥相反的作用。

2.6SESN2/chi-miR-130b-3p对ZEA引起的GCs内氧化应激损伤的影响

SESN2自最初被发现以来，其抗氧化能力就一直被人们所熟知(Wang et al.,2021)。同时有研究表明ZEA可以通过引起GCs中ROS的积累来引起氧化应激损伤(Zheng etal.,2019)。基于这两方面研究的结果，本研究想探索SESN2和chi-miR-130b-3p是否会对ZEA诱导的GCs中ROS的积累和氧化应激损伤过程产生影响。首先本研究分别测定了不同处理组的GCs内ROS水平。本研究观察到ZEA暴露导致GCs中ROS水平显著增加(p<0.01)(图6A-D)，而SESN2的过表达(p<0.05)(图6A)和chi-miR-130b-3p的干扰(p<0.01)(图6B)会减轻GCs内ROS的积累，而SESN2的干扰(p<0.01)(图6C)或chi-miR-130b-3p的过表达(p<0.01)(图6D)会加剧GCs内ROS的积累。然后，本研究通过WB检测了SOD2和CAT的表达水平，结果表明ZEA抑制了CAT和SOD2的表达(图6E-H)。然而，这种损伤可以通过SESN2的过表达(p<0.05)(图6E)或chi-miR-130b-3p的干扰(p<0.05)来逆转(图6F)，而SESN2(p<0.01)的抑制(图6G)和chi-miR-30b-3p的过表达(p<0.01)会加重ZEA对上述抗氧化酶表达的抑制(图6H)。此外，本研究分别使用MDA、SOD和CAT的ELISA试剂盒评估了ZEA处理的GCs的氧化应激水平和抗氧化酶活性。与本研究预期的结果一致，SOD和CAT的活性和WB结果相吻合(图6I-L)，ZEA增加的MDA浓度可以通过SESN2的过表达(p<0.05)(图6I)或chi-miR-130b-3p的干扰(p<0.01)来减轻(图6J)，但SESN2的抑制(p<0.01)(图6K)和chi-miR-130b-3p的过表达(p<0.01)增强了GCs内MDA的积累水平(图6L)。上述证据表明，SESN2和chi-miR-130b-3p参与了ZEA在GCs中引起的ROS积累和氧化应激损伤过程。

2.7SESN2/chi-miR-130b-3p对KEP1/NRF2信号通路的影响

SESN2由于其抗氧化能力被人们所熟知，之前的研究已经证实SESN2会参与调节KEAP1/NRF2信号通路来发挥其抗氧化功能(Fan,et al.,2020)。鉴于本研究关于SESN2和chi-miR-130b-3p对GCs中ROS积累和氧化应激损伤的研究结果，本研究试图探索SESN2和chi-miR-130b-3p是否通过调节KEAP1/NRF2这一信号通路来对ZEA诱导的GCs中ROS积累和氧化应激损伤产生影响。为此，本研究采用WB分析来评估KEAP1、NRF2和血红素加氧酶1(haeme oxygenase 1,HO-1)蛋白的表达水平。在ZEA处理的基础上，结果如图7所示，KEAP1的表达随着SESN2的过表达(图7A)或chi-miR-130b-3p的干扰而降低(p<0.05)(图7B)，但随着SESN2(p<0.05)的抑制(图7C)或chi-miR-130b-3p的过表达(图7D)而升高，而NRF2和HO-1的表达呈与KEAP1相反的趋势(图7A-D)。上述结果可以证实SESN2和chi-miR-130b-3p能够通过KEAP1/NRF2信号通路影响ZEA在GCs中引起的ROS积累和氧化应激损伤，具体调节作用如图8所示。