一种缓解孤独症胃肠道的益生菌组合物及其制备方法和用途

摘要

本发明提供了一种缓解孤独症胃肠道的益生菌组合物及其制备方法和用途，所述益生菌组合物，包括益生菌和益生元及营养素；所述益生菌包括青春双歧杆菌，凝乳芽孢杆菌，短双歧杆菌，乳双歧杆菌，瑞士乳杆菌，嗜酸乳杆菌，德氏乳杆菌，副干酪乳杆菌，植物乳杆菌，嗜热链球菌中的一种或多种；所述益生元包括低聚果糖，乳糖醇，水苏糖；所述的营养素包括维生素D3，菊粉和蔓越莓粉。所述益生菌组合物中益生菌的总活菌≥

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种缓解孤独症胃肠道的益生菌组合物及其制备方法和用途。

背景技术

孤独症，又称孤独性谱系障碍（Autism Spectrum Disorder, ASD），是严重影响儿童健康的神经发育障碍的广泛发育障碍疾病，其核心症状表现为社会交往障碍、兴趣狭隘和重复刻板行为，该病以男性多见，起病于儿童期，已被列为儿童精神疾病首位， 致残率高，影响终生。

通过研究检测孤独症谱系患者的基因和表型，发现患者孤独症饮食单一，微生物组多样性减少；研究人员将孤独症患者的肠道菌群移植给小鼠会产生相似的孤独症症状（Needham BD et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxietybehaviorin mice. Nature. 2022, 602(7898):647-653）；孤独症患者通过益生菌辅助干预后症状可以得到有效缓解（Santocchi E et al., Effects of ProbioticSupplementation on Gastrointestinal, Sensory andCore Symptoms in AutismSpectrum Disorders: A Randomized Controlled Trial. Front Psychiatry. 2020,11:550593.）。通过早发现、早诊断、早干预，可避免因诊治延误而造成患儿不可逆的损伤，是诊治、干预方面非常重要的工作，目前的诊断主要靠行为量表，缺乏客观指标，无有效治疗药物和方法, 通过粪便宏基因组学研究发现，饮食特征、粪便稠度和年龄与直接关联，儿童孤独症患者通过使用益生菌辅助干预后患儿胃肠道症状明显缓解，为此，本发明提供一种益生菌组合物用于缓解儿童孤独症临床症状，改善胃肠道功能。

发明内容

基于此，本发明公开了一种缓解孤独症胃肠道的益生菌组合物及其制备方法，优化了益生菌组合物的配方和制备方法，提高了益生菌总活菌数含量，同时加入了益生元和营养素，达到使用缓解儿童孤独症临床症状，改善胃肠道功能。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

一种缓解孤独症胃肠道的益生菌组合物的用途，其特征在于：应用于缓解儿童孤独症临床症状，改善胃肠道功能的产品。

具体的，所述产品包括保健食品等，其总活菌数≥600×10

一种缓解孤独症胃肠道的益生菌组合物，其特征在于：所述益生菌组合物包括多种益生菌和益生元及营养素。

具体的，所述益生菌包括青春双歧杆菌，凝乳芽孢杆菌，短双歧杆菌，乳双歧杆菌，瑞士乳杆菌，嗜酸乳杆菌，德氏乳杆菌，副干酪乳杆菌，植物乳杆菌，嗜热链球菌中的一种或多种。

具体的，所述青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）活菌数≥25×10

所述凝乳芽孢杆菌（Bacillus Coagulans）活菌数≥50×108CFU/g；

所述短双歧杆菌（Bifidobacterium breve ）活菌数≥50×10

所述乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）活菌数≥50×10

所述瑞士乳杆菌（L. helveticus）活菌数≥75×10

所述嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus ）活菌数≥75×10

所述德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）活菌数≥100×10

所述副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei ）活菌数≥75×10

所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum ）活菌数≥75×10

所述嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus ）活菌数≥25×10

具体的，所述益生元包括0.4g/g低聚果糖，0.3g/g乳糖醇，0.3g/g水苏糖。

具体的，所述营养素包括0.015µg/g维生素D3，0.014g/g菊粉，0.025g/g蔓越莓粉。

具体的，一种缓解孤独症胃肠道的益生菌组合物的制备方法，包括以下步骤：

S1、菌种划线培养：将上述益生菌菌粉分别用无菌水稀释后，于MC培养基上分区划线，划线结束后，置于装有培养基的平皿中，平皿倒置，放入培养箱中37℃恒温静置培养48～72h；

S2、一级纯化培养：挑取平皿上溶钙圈较大的单菌落分别接种至装有培养基的试管中，放入培养箱中37℃恒温静置培养36～50h；

S3、二级纯化培养：将一级纯化培养后的菌悬液分别接种至装有培养基的三角瓶中，放入培养箱中37℃恒温静置培养36～54h；

S4、菌种保存：将二级纯化培养后的菌悬液分别在12000rpm转速下离心8分钟后得到菌泥，将菌泥溶解于装有MRS液体培养基与50％甘油溶液的混合溶液中，放入-70～-80℃低温冰箱内冻存备用；

S5、冻存菌种复苏：分别取出菌泥冻存管，立即放入水浴锅中在37℃恒温下进行菌种复苏，直至冻存管内液体全部融化；

S6、菌种一级培养：将复苏好的菌泥混合液1～3ml分别接种至装有基础培养基的三角瓶中，将三角瓶密封，放入恒温箱中37℃恒温静置培养16～24h；

S7、菌种二级培养：将一级培养结束的菌悬液接种至装有基础培养基的三角瓶中，将三角瓶密封，放入恒温箱中37℃恒温静置培养16～24h；

S8、菌种三级培养：将二级培养结束的菌悬液接种至装有培养基的发酵罐中，搅拌，将发酵罐密封，放入恒温箱中37℃恒温静置培养8～14h；

S9、菌种四级发酵：将三级培养结束的菌悬液接种至装有培养基的发酵罐中，搅拌，将发酵罐密封，放入恒温箱中37℃恒温静置培养，在发酵开始5h后，通过流加食品级NaOH溶液来维持菌液的恒pH为5.5±0.1，培养周期8～10h，当菌液OD600值停止增长或呈负增长时，立即停止发酵；

S10、发酵液离心：四级发酵结束后，当发酵罐内发酵液温度低于18℃时，将发酵液分别在12000rpm转速下离心8分钟，并收集菌泥；

S11、冷冻干燥：将菌泥放入冻干机内，持续冻干55～72小时成冻干粉分别收集保存；

S12、按照本发明要求重量分别加入益生元低聚果糖，乳糖醇，水苏糖以及补充剂维生素D3，菊粉和蔓越莓粉；

S13、按实际需求添加不同的菌粉到益生元和营养剂中混合，搅拌均匀得益生菌组合物成品。

具体的，所述培养基成分的重量百分比组成为双歧因子1.5%、葡萄糖1.2%、蛋白胨0.5-2%、酵母膏 0.5-2%、柠檬酸二铵0.1-0.2%、磷酸氢二钾0.1-0.2%、无水乙酸钠0.1-1%、硫酸镁0.05-0.1%、吐温-80 0.0001%、其余为水，115℃灭菌15分钟，并以氢氧化钠溶液控制培养酸度使发酵液pH值为5.5~6.5。

具体的，所述MRS液体培养基成分为蛋白胨10-15g，牛肉膏10-15g，酵母粉5-10g，K

基于上述技术方案，本发明可以产生如下技术效果：

1、本发明公开的一种缓解孤独症胃肠道的益生菌组合物，有益于缓解儿童孤独症临床症状，改善胃肠道功能。

2、本发明公开的一种缓解孤独症胃肠道的益生菌组合物，优化了益生菌配方，添加了益生元及营养素，益生菌总活菌含量高，达到600×10

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明，实施例是用于说明本发明，而不是用于限制本发明的范围。本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改和改变，以使其使用各种用途和条件。下述实施例中所使用的实验原料如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

一种缓解孤独症胃肠道的益生菌组合物的用途，应用于缓解儿童孤独症临床症状，改善胃肠道功能的产品。具体的，所述产品包括保健食品等，其总活菌数≥600×10

一种缓解孤独症胃肠道的益生菌组合物，所述益生菌组合物包括多种益生菌和益生元及营养素。所述益生菌包括青春双歧杆菌，凝乳芽孢杆菌，短双歧杆菌，乳双歧杆菌，瑞士乳杆菌，嗜酸乳杆菌，德氏乳杆菌，副干酪乳杆菌，植物乳杆菌，嗜热链球菌中的一种或多种。

具体的，所述青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）活菌数≥25×10

所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum ）活菌数≥75×10

具体的，所述益生元包括0.4g/g低聚果糖，0.3g/g乳糖醇，0.3g/g水苏糖。

具体的，所述营养素包括0.015µg/g维生素D3，0.014g/g菊粉，0.025g/g蔓越莓粉。

一种缓解孤独症胃肠道的益生菌组合物的制备方法，包括以下步骤：

S1、菌种划线培养：将上述益生菌菌粉分别用无菌水稀释后，于MC培养基上分区划线，划线结束后，置于装有培养基的平皿中，平皿倒置，放入培养箱中37℃恒温静置培养48～72h；

S2、一级纯化培养：挑取平皿上溶钙圈较大的单菌落分别接种至装有培养基的试管中，放入培养箱中37℃恒温静置培养36～50h；

S3、二级纯化培养：将一级纯化培养后的菌悬液分别接种至装有培养基的三角瓶中，放入培养箱中37℃恒温静置培养36～54h；

S4、菌种保存：将二级纯化培养后的菌悬液分别在12000rpm转速下离心8分钟后得到菌泥，将菌泥溶解于装有MRS液体培养基与50％甘油溶液的混合溶液中，放入-70～-80℃低温冰箱内冻存备用；

S5、冻存菌种复苏：分别取出菌泥冻存管，立即放入水浴锅中在37℃恒温下进行菌种复苏，直至冻存管内液体全部融化；

S6、菌种一级培养：将复苏好的菌泥混合液1～3ml分别接种至装有基础培养基的三角瓶中，将三角瓶密封，放入恒温箱中37℃恒温静置培养16～24h；

S7、菌种二级培养：将一级培养结束的菌悬液分别接种至装有基础培养基的三角瓶中，将三角瓶密封，放入恒温箱中37℃恒温静置培养16～24h；

S8、菌种三级培养：将二级培养结束的菌悬液分别接种至装有培养基的发酵罐中，搅拌，将发酵罐密封，放入恒温箱中37℃恒温静置培养8～14h；

S9、菌种四级发酵：将三级培养结束的菌悬液分别接种至装有培养基的发酵罐中，搅拌，将发酵罐密封，放入恒温箱中37℃恒温静置培养，在发酵开始5h后，通过流加食品级NaOH溶液来维持菌液的恒pH为5.5±0.1，培养周期8～10h，当菌液OD600值停止增长或呈负增长时，立即停止发酵；

S10、发酵液离心：四级发酵结束后，当发酵罐内发酵液温度低于18℃时，将发酵液分别在12000rpm转速下离心8分钟，并收集菌泥；

S11、冷冻干燥：将菌泥分别放入冻干机内，持续冻干55～72小时成冻干粉分别收集保存；

S12、按照本发明要求重量分别制备益生元低聚果糖，乳糖醇，水苏糖以及补充剂维生素D3，菊粉和蔓越莓粉。

S13、按实际需求添加不同的菌粉到益生元和营养剂中混合，搅拌均匀得益生菌组合物成品。

具体的，所述培养基成分的重量百分比组成为双歧因子1.5%、葡萄糖1.2%、蛋白胨0.5-2%、酵母膏 0.5-2%、柠檬酸二铵0.1-0.2%、磷酸氢二钾0.1-0.2%、无水乙酸钠0.1-1%、硫酸镁0.05-0.1%、吐温-80 0.0001%、其余为水，115℃灭菌15分钟，并以氢氧化钠溶液控制培养酸度使发酵液pH值为5.5~6.5。

具体的，所述MRS液体培养基成分为蛋白胨10-15g，牛肉膏10-15g，酵母粉5-10g，K

实施例1：

本实施例采用益生菌组合物对儿童孤独症患者作用测试。

孤独症儿童的确诊是通过儿童孤独症量表（CARS）进行筛查，Aberant 行为量表（ABC）可用于评估ASD小孩的行为问题，30名孤独症儿童作为实验组，25名非孤独症儿童作为对照组。

研究分为四组，采用随机，双盲，安慰剂对照试验。30名孤独症儿童（2-9岁）中接受了益生菌干预。其中男孩22名和女孩8名。25名对照组儿童为正常儿童（2-11岁）。30个ASD孤独症小孩根据胃肠道问题分为两组：有胃肠道症状组（15人）和无胃肠道症状组（15人）。对照组（3-12岁）25个小孩，分为两组，有胃肠道症状组（13人）和无胃肠道症状组（12人）每个小孩的父母均填写知情同意书。参与者排除了是否前6个月服用抗生素，或者前3个月服用益生菌，或者有严重的胃肠道症状的。孤独症组均使用本发明的益生菌组合剂，活菌数1200亿CFU每袋，每袋2克，一天1次，连续服用2个月。对照组服用安慰剂。在服用前、服用中、服用后分别取血样和粪便。结果显示，治疗8周后孤独症胃肠道症状组开始持续改善，在治疗结束时，有胃肠道症状的益生菌服用组胃肠道症状组减少约80%，包括便秘、腹泻、消化不良和腹痛的症状得到显著改善，对照组无明显改善。

实施例2：

本实施例益生菌组合物对ASD患者4种行为ATEC评分的影响

孤独症受试者45名包括对照组包括39名男孩和6名女孩。ASD患者的评分使用孤独症治疗评估量表（Autism Treatment Evaluation Checklist, ATEC），主要观察语言，社会交流，认知和行为4个方面，评分值越高，症状越轻。使用本专利的益生菌组合剂，每袋2克，含活菌1200亿CFU，每袋2克，第一个月每日口服2次，每次一袋，后3个月每日一袋，持续4个月。其中粪便及血液标本在服用前，服用一个月，2个月，4个月收集，粪便由父母收集，保存在4度，并在4小时内送到实验室，其中每个标本的200毫克等分样品在-80℃冷冻备用。孤独症患者根据胃肠指数（GI）分为两组：低GI组（20人，6GSI小于3）和高GI组（25人，6GSI大于3），低GI组的给益生菌组和对照组比较有明显差异，益生菌组总短链脂肪酸（SCFA）水平明显降低，结果显示服用4个月后，ATEC评分两组差异非常明显，如表1所示，低GI组的ATEC评分高于高GI组的60%，益生菌组比较对照组ATEC评分显著提升，有效缓解了低胃肠道指数的儿童孤独症患者临床症状。

表1高GI组和低GI组对照ATEC评分

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。