解淀粉芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌用于增强活性益生菌组合物或用于活化非活性益生菌组合物的用途、由此获得的组合物以及相关方法

摘要

本发明涉及解淀粉芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌用于增强活性益生菌组合物或用于活化非活性益生菌组合物以用于预防和/或治疗炎性肠病的用途，所述炎性肠病如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、未定型结肠炎和显微镜下结肠炎；由此获得的组合物；以及用于增强活性益生菌组合物或用于活化非活性益生菌组合物以用于预防和/或治疗炎性肠病的方法，所述炎性肠病如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、未定型结肠炎和显微镜下结肠炎。

说明书

发明领域

本发明涉及解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和/或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)用于增强活性益生菌组合物或用于活化非活性益生菌组合物以用于预防和/或治疗炎性肠病的用途，所述炎性肠病如克罗恩氏病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎、未定型结肠炎和显微镜下结肠炎；由此获得的组合物；以及用于增强活性益生菌组合物或用于活化非活性益生菌组合物以用于预防和/或治疗炎性肠病的方法，所述炎性肠病如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、未定型结肠炎和显微镜下结肠炎。

背景技术

以英语首字母缩写IBD或以意大利语首字母缩写MICI(Malattie InfiammatorieCroniche dell'Intestino)命名的慢性炎性肠病是在成年和小儿受试者中具有高发病率的病理学病状。迄今，用以治疗这类病变的可用疗法仅展现出有限的功效。尽管IBD包括不同疾病模式，但两种最常见的疾病表现型是克罗恩氏病(Crohn's disease；CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis；UC)。这些病变都是由较强遗传倾向性和免疫发病机制支持的慢性复发性疾病，典型地发现于肠道中，尽管其也可能影响其它器官，考虑到其可在患有自身免疫疾病(如甲状腺炎、硬化性胆管炎和其它疾病)的患者中共同显现(de Souza,H.S.和Fiocchi,C.,Nat.Rev.Gastroenterol.Hepatol.2016年1月13日(1):13-27)。

克罗恩氏病是会影响任何胃肠道的透壁肠道炎症，但最常见部位是仅影响末端回肠或与绞痛部位(回结肠疾病)相关联的部位，其占所有病理形式的约75％。

另外，溃疡性结肠炎可定义为间歇性炎症，但其不涉及透壁。此病状为结肠所特有的，且确切地说，为结肠的末端部分(直肠炎)所特有的。在70％的病例中，UC仅以溃疡性直肠炎的形式显现(Danese,S和Fiocchi.C.,N.Engl.J.Med.365:1713-1725,2011)。

在与结肠炎的存在相关的临床症状内，有可能鉴别具有不确定诊断的患者亚群，已针对所述患者亚群创造出特定术语未定型结肠炎(indeterminate colitis；IC)。此病状以炎症(尽管其限于结肠)为特征，具有可归于克罗恩氏病和溃疡性结肠炎两者但不允许隶属于任一者的组织学特性(Brown,C.J.等人,Dis.Colon Rectum 48(8):1542-9,2005)。

术语显微镜下结肠炎最终鉴别出两种病症，所述病症为由慢性腹泻表征的属于慢性炎性肠病的疾病，即胶原性结肠炎和淋巴球性结肠炎。显微镜下结肠炎主要影响年轻女性且通常与自身免疫疾病相关联，所述自身免疫疾病如干燥综合征(

目前存在以下一般共识：IBD起源于肠道粘液屏障的改变，这在遗传倾向受试者中导致局部免疫系统过载，伴随涉及先天性和适应性免疫的防御机制的后续失调(Baumgart,D.C.和Sandborn,W.J.,Lancet 380:1590-1605,2011)。

现行的治疗性治疗通常基于使用皮质类固醇和免疫抑制剂(如硫唑嘌呤(azathioprine))和抗发炎药物(如5-氨基水杨酸盐)(Neurath,M.F.,Nat.Rev.Gastroenterol.Hepatol.14:269-278,2017；Tiede,I.等人,J.Clin.Invest.111:1133-1145,2003；Lim,W.C.等人,Cochrane Database Syst.Rev.7:CD008870,2016)。最近，已引入具有抗TNF-α作用的生物学药物(如英利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)和戈利木单抗(golimumab))和抗整合素(如维多珠单抗(vedolizumab))(Neurath,M.F.,Nat.Rev.Gastroenterol.Hepatol.14:269-278,2017；Colombel,J.F.等人,N.Engl.J.Med.362:1383-1395,2010)。

尽管上文所提及的药物为高效的，但归因于缺乏对治疗的反应或反应随时间减小，迄今约一半的患者往往会在维持治疗期间复发，且约30-40％的患者(尤其是患有CD的那些患者)未实现完全缓解，或未持久地维持缓解。

此外，并不罕见地，对这些药物的不耐受性和/或副作用出现的现象发生，从而导致需要暂停治疗(Mosli,M.H.等人,Drugs 74:297-311,2014)。

另外，已研发出目标为通过抑制整合素、趋化因子和趋化因子受体来调节白细胞向肠道迁移的治疗方法，但当今约50％的患者复发或不对维持治疗作出反应(Mosli,M.H.等人,Drugs 74:297-311,2014)。

近年来变得越来越重要的IBD的发病机制中的研究因素之一是由肠道微生物群为代表的。肠道微生物群构成微生物群的群体，其包括在给定时间段内在特定环境中定殖(在此情况下是肠道)的细菌、真菌、古细菌、原虫和病毒。

肠道微生物群的组成的改变(称为“菌群失调”)在罹患CD的约75％患者中观测到且可在遗传倾向受试者中的此病变的发展中起致病作用(Bellaguarda,E.and Chang,E.B.,Curr.Gastroenterol.Rep.17:15,2015)。

在此情形下，肠道微生物群被视为IBD治疗中的重要治疗靶标。

众所周知，肠道微生物群的组成/功能可通过使用适当益生菌来调节(Chibbar,R.and Dielman,L.A.,J.Clin.Gastroenterol.49:S50-S55,2015)。

在市场上可获得的众多益生菌制剂当中，下文中将称为“De Simone调配物”(美国专利第5,716,615号)的制剂(随时间推移以品牌VSL#3，且随后以品牌VIVOMIXX和VISBIOME销售)已被广泛研究且被建议用于治疗慢性结肠袋炎(Gionchetti,P.等人,Gastroenterology 119:305-309,2000；Gionchetti,P.等人,Gastroenterology 124(5):1202-9,2003；Shen,J.等人,Bowel Dis.20:21-35,2014)。所述制剂是由八种不同细菌菌株的混合物组成的调配物。然而，近来的体外和体内研究显示通过由不同培养工艺获得的不同原材料产生的类似调配物在减轻炎症方面的功效存在差异性(Cinque,B.等人,J CellPhysiol.232(12):3530-3539,2017；Biagioli,M.等人,Front.Pharmacol.8:505,2017)。

因此，认为需要增加关于肠道微生物群的科学研究，且需要进行新的研究和实验以便基于益生菌来形成新的组合物，或增强现有组合物以获得在预防和/或治疗炎性肠病方面越来越有效的组合物。

本申请人已意外地发现且体验到，使用解淀粉芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌允许增强已具活性的益生菌组合物以及活化非活性益生菌组合物，从而产生创新的和易于使用的益生菌组合物，所述益生菌组合物已被证实尤其成功的适用于预防和/或治疗炎性肠病，如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、未定型结肠炎和显微镜下结肠炎。

使用解淀粉芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌获得的组合物具有以下优点：

1)以比传统益生菌更低的生产成本使用细菌物种，且归因于其稳定性，可将其添加到待存储于室温下的益生菌和待存储于冷藏环境中的那些益生菌，其中以液体组合物和粒剂的形式调配益生菌；

2)改进益生菌混合物的功能性，同时增强或活化治疗功效；

3)有效调节肠道免疫系统；

4)有效调节酶促活性。

发明内容

本申请人已意外地发现，在益生菌混合物中使用解淀粉芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌(较佳地总百分比在2％与50％之间)允许获得具有较高或增强治疗功效的益生菌掺混物。将解淀粉芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌纳入益生菌混合物中不仅可以增加功能活性且因此增加已具活性的益生菌混合物的治疗活性，而且出人意料地，其还可在所研究的各种实验模型中使活性益生菌混合物在减少肠道炎症方面无活性。更具体地说，本发明基于以下证据：与不具有解淀粉芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌的同等组合物相比，将解淀粉芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌添加到益生菌混合物(较佳地总百分比在2％与50％之间)允许获得通过测定CDAI(结肠炎疾病活性指数)值测量的消炎活性的至少30％增加，或在初始组合物无活性的情况下获得活性益生菌混合物。

因此，含有解淀粉芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌的组合物的重要优点是，这些细菌在益生菌中的存在通过充当益生菌来活化/增加其功能性。

与使用本发明的这方面的含有解淀粉芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌的组合物相关的其它重要优点是，因其抗发炎功能而已知存在于结肠固有层内的调节型肠细胞(Treg)的增加。

在第一方面中，本发明涉及解淀粉芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌用于在预防和/或治疗炎性肠病中增强活性益生菌组合物或用于活化非活性益生菌组合物的用途，所述炎性肠病如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、未定型结肠炎和显微镜下结肠炎。

根据这方面的第一实施方案，所添加的解淀粉芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌的按重量计的量在2％与50％之间。

根据这方面的第二实施方案，待增强的活性益生菌组合物是可以品牌VIVOMIXX和VISBIOME商购的以下8种细菌菌株的混合物：

副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)DSM 24733，

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DSM 24730，

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)DSM 24735，

德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspeciesbulgaricus)DSM 24734，

长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)DSM 24736，

婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)DSM 24737，

短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)DSM 24732，和

嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)DSM 24731。

根据这方面的第三实施方案，待增强的活性益生菌组合物包括：

重量比例20％到30％的嗜热链球菌，

重量比例20％到30％的干酪乳杆菌，

重量比例30％到20％的短双歧杆菌，和

重量比例30％到20％的动物双歧杆菌乳酸亚种。

根据这方面的第四实施方案，待活化的非活性益生菌组合物是以下细菌菌株的混合物：

嗜热链球菌BT01，

短双歧杆菌BB02，

长双歧杆菌(最近重新分类为动物双歧杆菌乳酸亚种)BL03，

婴儿双歧杆菌(最近重新分类为动物双歧杆菌乳酸亚种)BI04，

嗜酸乳杆菌BA05，

植物乳杆菌BP06，

副干酪乳杆菌BP07，和

德氏乳杆菌保加利亚亚种(最近重新分类为瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus))BD08。

根据这方面的第五实施方案，解淀粉芽孢杆菌是以编码16S RNA的SEQ ID NO:1为特征的已知菌株。

在第二方面中，本发明涉及一种增强的活性益生菌组合物或活化的非活性益生菌组合物，其包括总共重量比例为2％到50％的经添加以用于预防和/或治疗炎性肠病的解淀粉芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌，所述炎性肠病如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、未定型结肠炎和显微镜下结肠炎。

根据这方面的第一实施方案，增强的益生菌组合物包括

重量比例98％到50％的以下8种细菌菌株的混合物：

副干酪乳杆菌DSM 24733，

植物乳杆菌DSM 24730，

嗜酸乳杆菌DSM 24735，

德氏乳杆菌保加利亚亚种DSM 24734，

长双歧杆菌DSM 24736，

婴儿双歧杆菌DSM 24737，

短双歧杆菌DSM 24732，

嗜热链球菌DSM 24731，

和

重量比例2％到50％的解淀粉芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌，

以用于预防和/或治疗炎性肠病，如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、未定型结肠炎和显微镜下结肠炎。

根据这方面的第二实施方案，活化的益生菌组合物包括

重量比例20％到30％的嗜热链球菌，

重量比例10％到30％的干酪乳杆菌，

重量比例10％到15％的短双歧杆菌，

重量比例10％到15％的动物双歧杆菌乳酸亚种，和

重量比例50％到10％的解淀粉芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌，

以用于预防和/或治疗炎性肠病，如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、未定型结肠炎和显微镜下结肠炎。

根据这方面的第三实施方案，增强的益生菌组合物

重量比例98％到50％的以下8种细菌菌株的混合物：

嗜热链球菌BT01，

短双歧杆菌BB02，

长双歧杆菌(最近重新分类为动物双歧杆菌乳酸亚种)BL03，

婴儿双歧杆菌(最近重新分类为动物双歧杆菌乳酸亚种)BI04，

嗜酸乳杆菌BA05，

植物乳杆菌BP06，

副干酪乳杆菌BP07，

德氏乳杆菌保加利亚亚种(最近重新分类为瑞士乳杆菌)BD08，

和

重量比例2％到50％的解淀粉芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌，

以用于预防和/或治疗炎性肠病，如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、未定型结肠炎和显微镜下结肠炎。

根据这方面的第四实施方案，解淀粉芽孢杆菌是以编码16S RNA的SEQ ID NO:1为特征的已知菌株。

在第三方面中，本发明涉及一种新益生菌组合物，其包括：

重量比例20％到30％的嗜热链球菌，

重量比例20％到30％的干酪乳杆菌，

重量比例30％到20％的短双歧杆菌，和

重量比例30％到20％的动物双歧杆菌乳酸亚种，

以用于预防和/或治疗炎性肠病，如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、未定型结肠炎和显微镜下结肠炎。

在第四方面中，本发明涉及一种用于在预防和/或治疗炎性肠病中增强活性益生菌组合物或用于活化非活性益生菌组合物的方法，所述炎性肠病如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、未定型结肠炎和显微镜下结肠炎，所述方法包括向这类益生菌组合物中添加解淀粉芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌。

根据这方面的第一实施方案，所添加的解淀粉芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌的按重量计的量在2％与50％之间。

根据这方面的第二实施方案，待增强的活性益生菌组合物是以下8种细菌菌株的混合物：

副干酪乳杆菌DSM 24733，

植物乳杆菌DSM 24730，

嗜酸乳杆菌DSM 24735，

德氏乳杆菌保加利亚亚种DSM 24734，

长双歧杆菌DSM 24736，

婴儿双歧杆菌DSM 24737，

短双歧杆菌DSM 24732，和

嗜热链球菌DSM 24731。

根据这方面的第三实施方案，待增强的活性益生菌组合物包括：

重量比例20％到30％的嗜热链球菌，

重量比例20％到30％的干酪乳杆菌，

重量比例30％到20％的短双歧杆菌，和

重量比例30％到20％的动物双歧杆菌乳酸亚种。

根据这方面的第四实施方案，待活化的非活性益生菌组合物是以下7种细菌菌株的混合物：

嗜热链球菌BT01，

短双歧杆菌BB02，

长双歧杆菌(最近重新分类为动物双歧杆菌乳酸亚种)BL03，

婴儿双歧杆菌(最近重新分类为动物双歧杆菌乳酸亚种)BI04，

嗜酸乳杆菌BA05，

植物乳杆菌BP06，

副干酪乳杆菌BP07，e

德氏乳杆菌保加利亚亚种(最近重新分类为瑞士乳杆菌)BD08。

根据这方面的第五实施方案，解淀粉芽孢杆菌是以编码16S RNA的SEQ ID NO:1为特征的已知菌株。

图1A到1F显示在已针对此作用具活性的细菌组合物以外，与施用物种解淀粉芽孢杆菌相关联的保护作用的增强。具体地说，图1A显示体重的趋势，图1B显示考虑了体重减轻、粪便硬度和便血的存在的结肠炎疾病活性指数(CDAI)的每日测量值，图1C显示结肠的长度，图1D显示结肠重量与结肠长度的比率，且图1E和1F展示存在于结肠固有层中的免疫细胞的百分比(图1E：CD3+T淋巴细胞内的CD3+IL-10+T淋巴细胞；图1F：CD11+Gr1-巨噬细胞内的M2 CD11b+Gr1-IL-10+巨噬细胞)。结果表示为每实验组的7-10只小鼠的平均值±SEM。*p<0.05。

图2A到2E显示在已针对此作用具活性的另一细菌组合物以外，与施用细菌物种解淀粉芽孢杆菌相关联的保护作用的增强。具体地说，图2A显示体重的趋势，图2B显示考虑了体重减轻、粪便硬度和便血的存在的CDAI的每日测量值，图2C显示结肠重量与结肠长度的比率，且图2D和图2E显示存在于结肠固有层中的Treg CD4+FoxP3+免疫细胞的频率(图2D：在CD4+T淋巴细胞内；图2E：在结肠固有层中的所有细胞内)。结果表示为每实验组的6-8只小鼠的平均值±SEM。*p<0.05。

图3A到3B显示与不存在此作用的细菌组合物相比，与施用解淀粉芽孢杆菌物种相关联的保护作用。具体地说，图3A显示体重的趋势，且图3B显示考虑了体重减轻、粪便硬度和便血的存在的CDAI的每日测量值。结果表示为每实验组的6-8只小鼠的平均值±SEM。*p<0.05。

图4A到4B显示单独的解淀粉芽孢杆菌以及与本发明的组合物中的一些组合的作用。具体地说，图4A显示体重的趋势，且图4B显示考虑了体重减轻、粪便硬度和便血的存在的CDAI的每日测量值。结果表示为每实验组的6-8只小鼠的平均值±SEM。*p<0.05。

图5A到5B显示解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌在所进行的试验中的作用的基本等效性。具体地说，图5A显示体重的趋势，且图5B显示考虑了体重减轻、粪便硬度和便血的存在的CDAI的每日测量值。结果表示为每实验组的6-8只小鼠的平均值±SEM。*p<0.05。

具体实施方式

用于实验的解淀粉芽孢杆菌的菌株是以编码16S RNA的SEQ ID NO:1为特征的已知菌株。

由2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的鼠类结肠炎模型用以测试所研究的组合物的抗炎活性。在此模型中，通过直肠内施用含TNBS的50％乙醇溶液来诱导结肠炎症。乙醇对于进入肠道上皮细胞、破坏屏障功能且允许TNBS穿透肠道壁为必需的。

由于此模型与高度活化的T细胞(其在TNBS诱导的结肠炎中具有关键致病作用)的增加有关，因而所述模型自身适合于研究T细胞在肠道炎症中的作用(Elson,C.O.等人,J.Immunol.157:2174-2185,1996；Dohi,T.等人,J.Exp.Med.189:1169-1180,1999)。然而，免疫机制也参与TNBS结肠炎的发展(Fiorucci,S.等人,Immunity 17:769-780,2002)。

组织学上，在疾病诱导之后，获得巨噬细胞、嗜中性白细胞和淋巴细胞浸润的透壁炎症以及结肠肥大(Kiesler,P.等人,Cell.Mol.Gastroenterol.Hepatol.1:154-170,2015)。由于一些免疫和组织病理学特征与同克罗恩氏病相关联的那些特征类似，因而TNBS诱导的结肠炎已广泛用以研究可能与此疾病相关的多种方面(Kiesler,P.等人,Cell.Mol.Gastroenterol.Hepatol.1:154-170,2015；Rieder,F.等人,Gut 62:1072-1084,2013)。

使用购自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)的8周龄C57BL6雄性小鼠。将动物保存于佩鲁贾大学(the University of Perugia)的临床前研究中心。

使小鼠保持在22℃的受控温度下，明/暗周期为12/12小时，且在使其在用于实验活动中之前在这些条件下适应7天。根据意大利法律进行研究，且实验方案由佩鲁贾大学的伦理委员会和卫生部批准(许可编号1126/20-PR)。

对于结肠炎诱导，使小鼠保持空腹12h(第-1天)。次日(第0天)将小鼠麻醉，且将导管从肛门插入结肠中达4cm。为诱导结肠炎，通过具有1ml注射器(注射体积：100μl)的导管施用溶解于50％乙醇中的1mg TNBS以诱导结肠炎。

对照动物(未处理，NT)仅接受50％乙醇溶液。随后通过测量体重和CDAI(结肠炎疾病活性指数)(其包括体重减轻百分比、粪便硬度和便血的存在)每日监测小鼠以评定疾病病程(每一参数具有范围介于0到4的值)。

在实验结束时，处死动物，且回收结肠以进行宏观特性的分析以及借助于小鼠固有层解离试剂盒(Miltenyi Biotec)提取固有层细胞以用于通过细胞荧光测定术进行分析。

通过经口探针以溶解于盐水溶液中的50×10

在此实例中，已单独和在添加解淀粉芽孢杆菌的情况下测试在预防和/或治疗炎性疾病中具活性的组合物，所述组合物包括以下8种细菌菌株：

副干酪乳杆菌DSM 24733，

植物乳杆菌DSM 24730，

嗜酸乳杆菌DSM 24735，

德氏乳杆菌保加利亚亚种DSM 24734，

长双歧杆菌DSM 24736，

婴儿双歧杆菌DSM 24737，

短双歧杆菌DSM 24732，和

嗜热链球菌DSM 24731，

其可以VIVOMIXX品牌商购。

图1显示根据上述方法进行的测试的结果。在图中，NT＝未处理，且TNBS＝仅用2,4,6-三硝基苯磺酸处理。

实验数据的结果清楚地显示，在TNBS诱导的结肠炎模型中，添加解淀粉芽孢杆菌提高VIVOMIXX在预防体重减轻的减少中，以及在诱导如CDAI所测量的炎症的改善中，和在减弱TNBS诱导的结肠形态变化(如结肠重量与结肠长度的比率)中的功效。结肠固有层内的调节型肠道细胞(Treg)的增加也较明显。

在此实例中，已测试新组合物，已发现所述新组合物在预防和/或治疗炎性疾病中具有活性。

新组合物包括：

重量比例30％的嗜热链球菌，

重量比例30％的干酪乳杆菌，

重量比例20％的短双歧杆菌，和

重量比例20％的动物双歧杆菌乳酸亚种。

图2A到2E显示根据上述方法进行的测试的结果。在图中，NT＝未处理，且TNBS＝仅用2,4,6-三硝基苯磺酸处理。

关于上述组合物的实验数据的结果清楚地显示，在TNBS诱导的结肠炎模型中，此组合物在预防体重减轻的减少中，以及在诱导如CDAI所测量的炎症的改善中，和在减弱TNBS诱导的结肠形态变化(如结肠重量与结肠长度的比率)中展现良好功效。结肠固有层内的调节型肠道细胞(Treg)的增加也较明显。

为验证将解淀粉芽孢杆菌添加到此组合物中的作用，已如下改进组合物：

重量比例30％的嗜热链球菌，

重量比例30％的干酪乳杆菌，

重量比例15％的短双歧杆菌，

重量比例15％的动物双歧杆菌乳酸亚种，和

重量比例10％的解淀粉芽孢杆菌。

总结于图2A到2E中的实验数据的结果清楚地显示，在TNBS诱导的结肠炎模型中，添加解淀粉芽孢杆菌提高新组合物在预防体重减轻的减少中，以及在诱导如CDAI所测量的炎症的改善中，和在减弱TNBS诱导的结肠形态变化(如结肠重量与结肠长度的比率)中的功效。结肠固有层内的调节型肠细胞(Treg)的增加也较明显。

在此实例中，已测试包括以下细菌菌株的商用组合物：

嗜热链球菌BT01，

短双歧杆菌BB02，

长双歧杆菌(最近重新分类为动物双歧杆菌乳酸亚种)BL03，

婴儿双歧杆菌(最近重新分类为动物双歧杆菌乳酸亚种)BI04，

嗜酸乳杆菌BA05，

植物乳杆菌BP06，

副干酪乳杆菌BP07，e

德氏乳杆菌保加利亚亚种(最近重新分类为瑞士乳杆菌)BD08。

如从图3中所显示的结果可见，此组合物在所执行的测试中无活性，最有可能是归因于菌株培养程序的差异。

然而，添加解淀粉芽孢杆菌已使组合物在预防体重减轻的减少中，以及在诱导如CDAI所测量的炎症的改善中具活性。

根据图4A到4B，显而易见的是，除已针对此作用具活性的细菌组合物以外，与施用细菌物种解淀粉芽孢杆菌相关联的保护作用的增强，或除最初不呈现此特性的细菌组合物以外，施用相同物种相关联的保护活性的建立。

此外，图5A到5B展示与细菌物种解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的施用相关联的作用的基本等效性。此等效性将由两个细菌组之间的较高程度的遗传相似度来解释。

实际上，解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌构成两个姐妹物种(由从共享的祖先分化出来的物种)，所述姐妹物种属于以高遗传相关性为特征的较大细菌物种组，称为枯草芽孢杆菌组(Fritze,D.,"Taxonomy of the genus Bacillus and related genera:theaerobic endospore-forming bacteria",Phytopathology 94:1245-1248,2004)。物种解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌之间的高遗传相似度由通过比较编码16S rRNA的序列来有效区分这两种细菌组的难度和/或不可能性来明确证实(Wang等人,"Bacillus velezensisis a later heterotypic synonym of Bacillus amyloliquefaciens",Int.J.Syst.Evol.Microbiol.58:671-675,2008)，其是分类鉴别细菌的选择标记(Woese,C.R.,"Bacterial evolution",Microbiol.Rev.51:221-271,1987)。近年来，新一代测序技术的发展使得有可能存取关于许多细菌物种的全基因组的序列的大量数据，且研发出能够更可靠且准确地评定微生物群组之间的遗传相似度的研究方法。在此情形下，基于扩展到整个保藏基因组的多个基因座的基因组分型(核心MLST)代表一种用以借助于同步比较在其间共享的数百个或数千个遗传标记来确定不同分类组之间的相关性的有效工具。将此技术应用于属于解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌物种的特定细菌菌株，进一步突显这些分类组之间的较大遗传相似度。基于通过使用≥80％的序列相似度阈值测定的1664个基因簇的比对来重构属于两个物种的基因组之间的系统发育关系(参见下文的树状图)显示相较于包括在其自身分类组(组A、B、C、D)中的菌株，解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌菌株在系统发育学上彼此更接近。

基于比较两个物种所共享的1664个遗传标记来重构解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌菌株之间的系统发育关系的树状图。针对系统发育树的每个臂都报告了共祖距离(patristic distance)，共祖距离定义为两个分类群之间的派生特性变化的数目。

高遗传相关性以及在两个细菌物种之间共享的大量基因，使得有可能假设其从功能性视角来看也可以是等效的。

对与公共数据库(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)中可获得的解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌物种相关的基因组执行基于扩展到整个核心基因组的多个基因座的基因组分型。针对每一细菌物种(包括与物种类型菌株解淀粉芽孢杆菌DSM7和枯草芽孢杆菌ATCC13952相关的那些物种)选择五个完整基因组序列。为避免由于不同基因组注释而引入的错误，通过Prokka v1.12管线(Seeman T,"Prokka:rapid prokaryotic genomeannotation",Bioinformatics 2014年7月15日,30(14):2068-9)强制遵从Genbank/ENA/DDJB标准从头注释所有序列。将基因组导入BPGA生物信息程序内(Chaudhari等人,"BPGA-an ultra-fast pan-genome analysis pipeline"Sci.Rep.6:24373,2016)，且使用由基因序列编码的蛋白序列之间的≥80％的相似度阈值来确定同源基因组。使用MUSCLE v3.8.31分别比对同源蛋白组(Edgar,R.C.,"MUSCLE:multiple sequence alignment withhigh accuracy and high throughput",Nucleic Acids Res.32:1792-7,2004)，且随后接合以形成串联体(concatenameres)。使用近似最大似然法(Approximately Maximum-Likelihood method)使用Fasttree 2程序执行系统发育重构(Price等人,"FastTree 2-Approximately maximum-likelihood trees for large alignments",PLoS One 5:e9490,2010)。

图5A到5B也显示解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌在所进行的试验中的作用的基本等效性。

序列表

<110> 奥尔门德斯公司

<120> 解淀粉芽孢杆菌和/或枯草芽孢杆菌用于增强活性益生菌组合物或

用于活化非活性益生菌组合物的用途、由此获得的组合物以及相关方法

<140> IT102019000002567

<141> 2019-05-14

<160> 1

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 1438

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌

<220>

<223> 解淀粉芽孢杆菌

<400> 1

gggggctgct aagctgcaag tcgagcgggc agatgggagc ttgctccctg atgttagcgg 60

cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaacc 120

ggggctaata ccggatggtt gtctgaaccg catggttcag acataaaagg tggcttcggc 180

taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag 240

gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc 300

agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc 360

aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag ggaagaacaa 420

gtgccgttca aatagggcgg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac ggctaactac 480

gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa 540

gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc ggggagggtc 600

attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt gtagcggtga 660

aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc tgtaactgac 720

gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 780

aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct aacgcattaa 840

gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg 900

cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg 960

acatcctctg acaatcctag agataggacg tccccttcgg gggcagagtg acaggtggtg 1020

catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1080

cttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg 1140

gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc 1200

tacaatggac agaacaaagg gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc acaaatctgt 1260

tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc tagtaatcgc 1320

ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac 1380

gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg taacctttag gagccagccg ccgaaggt 1438