依法韦仑在制备治疗前列腺癌的药物中的应用

摘要

本发明提供了依法韦仑在制备治疗前列腺癌的药物中的应用，涉及前列腺癌技术领域。依法韦仑在制备治疗前列腺癌的药物中的应用，使用L1‑RT的非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)依法韦仑，通过靶向非雄激素依赖性耐药机制，治疗内分泌疗法耐药型前列腺癌。

说明书

技术领域

本发明涉及前列腺癌技术领域，具体而言，涉及依法韦仑在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。

背景技术

根据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的2020年全球最新癌症负担数据，前列腺癌已成为全球男性中第二大常见癌症、中国排名第六的男性常见癌症。我国前列腺癌发病率远低于欧美国家，但由于早期诊断率较低，中国前列腺癌患者的死亡率远远高于发达国家。前列腺癌现有治疗方式包括手术、放疗、内分泌治疗、化疗以及新型内分泌治疗。随着前列腺癌的治疗时间的延长，由于治疗带来的压力等因素导致前列腺癌细胞不断的变异，终将进入去势抵抗即CRPC(去势抵抗性前列腺癌)阶段。前列腺癌患者确诊CRPC时高达85％有肿瘤转移，且超过80％的CRPC患者存在骨转移。mCRPC(转移性去势抵抗性前列腺癌)目前在临床上尚无治愈的选择，主要的治疗目标为延长患者生存(OS)和提高患者生活质量(QoL)。

前列腺癌细胞初始阶段的增殖需要雄激素，因此通过抑制雄激素信号传导的内分泌疗法可以一定程度阻止疾病的进展。不幸的是，在许多情况下，前列腺癌患者在经过阶段性(时间段长短具有个体差异)用药后变得对内分泌疗法产生抗性，进入“去势抵抗性前列腺癌”阶段，并开始再次进展。前列腺癌的这种再度发生的进展是由于癌细胞群体经过用药期间的筛选，其中可以利用低浓度雄激素或完全不依赖雄激素即可增殖的肿瘤细胞群体比例升高。这种激素抵抗是由两种类型的机制介导的：

(1)雄激素依赖性耐药，其中癌细胞仍然依赖于雄激素信号传导但发展：(a.)雄激素受体(AR)的功能亢进(hyperactive)，只需少量或几乎不需雄激素来激活和/或(b.)雄激素的异位产生，在对激素抑制疗法不敏感的癌细胞中自主合成。

(2)非雄激素依赖性耐药，部分癌细胞增殖完全独立于雄激素信号传导，因为(a.)细胞的深度去分化，通常伴有上皮-间质转化(EMT)，这增加了肿瘤细胞的恶性并赋予其在没有雄激素的情况下增殖的能力；(b.)获得由抗凋亡蛋白的过表达介导的对细胞凋亡的抗性，抵抗通常情况下由于雄激素缺乏造成的细胞死亡。

因此，针对去势抵抗性前列腺癌的有效治疗，可以从靶向雄激素依赖性耐药机制和非雄激素依赖性耐药机制这两条途径入手，进行新药开发。

目前作为一线用药的新型内分泌疗法的作用机制基本是靶向雄激素依赖性耐药机制的。通过使用更好的AR拮抗剂(MDV3100，Medivation；恩杂鲁胺)或通过阻断癌细胞内雄激素的异位表达(醋酸阿比特龙，J&J；和TAK700，Takeda)以及同时针对两种机制(TOK-001，TokaiPharmaceuticals)减少雄激素合成或抑制其与雄激素受体AR结合，进而抑制肿瘤细胞的增殖。

目前，以阿比特龙及恩杂鲁胺为代表的靶向异常AR通路(雄激素依赖)的新型内分泌治疗几乎是所有mCRPC的一线治疗方案。事实上，我国很多医院现面临对采取内分泌疗法后发生耐药的mCRPC无药可用的困境。另外，尽管目前化疗、放疗、免疫治疗和靶向治疗等多学科综合疗法可以改善晚期患者的病痛，但总生存率仍偏低，迫切需要疗效更好、副作用更低的治疗晚期前列腺癌(APC)的新药来提高患者生存期和生存质量。

发明内容

本发明的目的在于提供依法韦仑在制备治疗前列腺癌的药物中的应用，通过靶向非雄激素依赖性耐药机制，治疗内分泌疗法耐药型前列腺癌。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提出一种依法韦仑在制备治疗前列腺癌的药物中的应用，依法韦仑通过影响细胞形态发生、细胞生长和/或细胞凋亡过程的相关功能基因的表达抑制前列腺癌的发生和发展；依法韦仑通过信号通路CytochromeC-Caspase9-Caspase3-DFF促进前列腺癌细胞的凋亡；依法韦仑通过上调TMEFF1、TAC1、TFPI2、Serpinf1基因中的一种或多种抑制前列腺癌的发生和发展；依法韦仑通过下调FN1或CTGF基因抑制前列腺癌的发生和发展。

本发明至少具有以下有益效果：

本发明开发了一种靶向LINE-1基因座表达的逆转录酶(L1-RT)的非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)依法韦仑用于治疗癌症的方法，特别针对上皮类肿瘤(例如：前列腺癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤等)。以治疗转移性内分泌疗法耐药型前列腺癌为例，给药阶段可设定在紫杉醇类化疗之前或之后，L1-RT抑制剂靶向内分泌疗法耐药型前列腺癌肿瘤细胞的非雄激素依赖性抗性机制，可以有效延缓肿瘤进展及恶化的过程，延长受试者的总生存期。因此为当前大多靶向雄激素依赖性抗性机制的新一代内分泌疗法提供了补充。由于L1-RT抑制剂靶向的细胞机制：即细胞去分化、EMT及细胞凋亡抵抗现象在各类癌症的病理生理学过程中均存在，因此这类药物也可能成为其他癌症类型的潜在治疗方法。本发明涉及的依法韦仑治疗癌症的方法可能扩展到结直肠癌，黑色素瘤和肺癌。临床前研究的小鼠动物模型的实验结果表明，依法韦仑可以抑制接种这三种肿瘤的癌细胞系的裸鼠的肿瘤进展。

附图说明

图1表示依法韦仑抑制裸鼠接种人源前列腺癌细胞后肿瘤生长的结果图；

图2表示依法韦仑抑制非雄激素依赖性及雄激素依赖性的前列腺癌细胞的增殖并促进其凋亡的结果图；

图3表示依法韦仑抑制前列腺癌细胞系DU145肿瘤细胞的克隆形成及生长的结果图；

图4表示依法韦仑给药对人类前列腺癌细胞系DU145细胞表达谱的影响；

图5表示依法韦仑给药后前列腺癌细胞系DU145的表达谱中呈现显著差异表达的基因；

图6表示依法韦仑给药通过激活Caspase信号通路促进肿瘤细胞的凋亡的结果图；

图7表示不同的依法韦仑血浆药物浓度分组对前列腺癌疾病进展(PSA水平及影像学进展)的影响结果图；

图8表示不同的依法韦仑血浆药物浓度分组对受试者无进展生存期及总生存期的影响结果图；

图9表示依法韦仑给药剂量与其在受试者体内血浆药物浓度的相关性的结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

本发明提供依法韦仑在制备治疗前列腺癌的药物中的应用，依法韦仑通过影响细胞形态发生、细胞生长和/或细胞凋亡过程的相关功能基因的表达抑制前列腺癌的发生和发展；依法韦仑通过信号通路CytochromeC-Caspase9-Caspase3-DFF促进前列腺癌细胞的凋亡；依法韦仑通过上调TMEFF1、TAC1、TFPI2、Serpinf1基因中的一种或多种抑制前列腺癌的发生和发展；依法韦仑通过下调FN1或CTGF基因抑制前列腺癌的发生和发展。

临床研究结果表明，通过根据个体化差异调整给药方案，使得依法韦仑在受试者体内的血浆药物浓度达到3000ng/ml及以上的条件下，依法韦仑可以安全且有效地抑制转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)的疾病进展。

详细地，上述应用中依法韦仑抑制非雄激素依赖性的前列腺癌的细胞增殖的半数有效浓度为34～100μM。上述应用中依法韦仑诱导非雄激素依赖性的前列腺癌的细胞凋亡的半数有效浓度为37～193μM。

详细地，上述应用中依法韦仑抑制雄激素依赖性的前列腺癌的细胞增殖的半数有效浓度为33μM。上述应用中依法韦仑诱导雄激素依赖性的前列腺癌的细胞凋亡的半数有效浓度为22μM。

详细地，依法韦仑在受试者体内的血浆药物浓度大于3000ng/ml的条件下，将有助于显著提高抑制前列腺癌进展的临床效果。可以通过调节所述依法韦伦的给药剂量方案，采用检测受试者对应药物代谢的肝药酶基因分型等手段，以提高受试者群体中所述依法韦仑在患者体内达到有效治疗血浆药物浓度的比例。

本发明根据依法韦仑给药剂量和血药浓度依赖性效应关系，通过监测受试者体内的依法韦仑血药浓度，以及人体中依法韦仑代谢相关基因(例如：CYP2B6)的基因型分型检测结果，建立了一套调整受试者的每日的依法韦仑给药剂量的个体化剂量调整策略。目标为：保证受试者体内的依法韦仑血药浓度保持在>3000ng/ml的水平，即预期可以有效抑制肿瘤进展的血药浓度范围。临床治疗癌症应用的推荐初始依法韦仑给药剂量为1200mg/天。在该给药剂量条件下，大多数受试者体内的依法韦仑血药浓度可以达到>3000ng/ml的水平，且没有表现出药物毒性的明显提高，保证了给药剂量增加后的安全性。

本发明涉及的L1-RT抑制剂(依法韦仑)可与现阶段作为临床治疗CRPC的主要手段的第二代内分泌疗法(阿比特龙、恩杂鲁胺等)联合用药，将同时覆盖雄激素依赖及非雄激素依赖途径导致的肿瘤细胞内分泌疗法耐药，这将意味着内分泌疗法耐药型前列腺癌的整体治疗效率的显著提高。

本发明提供了一种使用依法韦仑治疗癌症的方法，其中，依法韦仑是一种靶向LINE-1逆转录酶(L1-RT)的非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)。治疗方法是一种靶向非雄激素依赖性的耐药机制的新疗法，对于晚期转移性内分泌疗法耐药型的前列腺癌患者，主要治疗目标为延缓疾病进展，延长患者生存期(OS)和提高患者生活质量(QoL)。

依法韦仑为主要成分的药品(例如：

本发明的具体实施例中涉及的依法韦仑给药途径为口服，给药剂型及规格设计如下：

本发明涉及的依法韦仑为主要成分的药品，其辅料可以选用任何常规药剂学上可接受的载体，包括月桂基硫酸钠，一水合乳糖，硬脂酸镁及羧甲基淀粉钠等。且其药品剂型以片剂为主，也可以调整为除片剂外的其它剂型，如胶囊剂，散剂或颗粒剂的形式。

本发明涉及的依法韦仑为主要成分的药品规格将根据不同的给药剂量进行设计。在保证受试者体内的依法韦仑血药浓度达到预期有效治疗范围的过程中，建议给药不超过两个单位(一个单位，One unit，表示一片/一颗胶囊)。以给药两个单位为例，为了达到目标血药浓度，每日给药剂量在1200mg，1400mg，1600mg，1800mg，则每个单位及药品规格应设计为600mg，700mg，800mg，900mg。

试验例

1、依法韦仑可以有效抑制裸鼠接种的人源前列腺癌肿瘤的生长

为了研究依法韦仑对前列腺癌的抗肿瘤作用，本实施例选取裸鼠进行体内成瘤实验，并通过依法韦仑给药研究其对肿瘤生长过程的影响。

具体实验操作及结果如下：

选取BALB/c品系的裸鼠进行体内成瘤实验。制备人源前列腺癌细胞系DU145的细胞悬液，通过细胞计数，调整细胞浓度为10

实验分为对照组与给药组：对照组在肿瘤细胞接种后不进行给药处理，给药组在肿瘤细胞接种1天后，使用灌胃法进行给药处理，每日依法韦仑的给药剂量为：每日一次，每次60mg/kg。自接种肿瘤日起40天内，选取共计7个时间点(t＝0,13,17,21,25,30,37天)，进行肿瘤接种部位的拍照记录及取样，测量肿瘤大小(直径)并计算其体积，每个数据点为组内取样所有数据的平均值。

实验结果如图1所示，图1.A为接种肿瘤40天内，未给药对照组(CTR)与依法韦仑给药组(EFV)裸鼠成瘤的体积(cm

为了进一步证明依法韦仑给药对于裸鼠接种的人源前列腺癌生长的抑制作用，本实施例还采取免疫组织化学分析比较了未给药处理的对照组(CTR)与依法韦仑给药组(EFV)裸鼠接种成瘤部位来源的肿瘤细胞中，肿瘤标志物PSMA和Ki-67的表达水平。对未给药处理的对照组(CTR)与依法韦仑给药组(EFV)的裸鼠接种部位获取的肿瘤标本进行常规脱水，石蜡包埋，切片，并按照试剂盒说明进行免疫组织化学SABC法染色(免疫组化染色操作步骤参考1，在本实施例中，使用的两种一抗分别为小鼠抗人PSMA的单克隆抗体及小鼠抗人Ki-67单克隆抗体；二抗依旧使用生物素标记的羊抗小鼠二抗)，检测肿瘤组织中肿瘤标志物PSMA和Ki-67的表达水平。阳性呈现深浅程度不同的棕褐色颗粒；颗粒颜色越深，密度越大，代表该部位相应靶点蛋白表达量越高。

前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)是前列腺癌的特征性蛋白之一，在前列腺癌细胞中表达量很高，而在其他类型的肿瘤或正常组织中表达量很低。另外，随着前列腺癌恶性程度的增高，前列腺癌细胞表达PSMA的量也相应增加。即从良性上皮细胞→高级别前列腺上皮内瘤(HGPIN)→前列腺癌的过程中，PSMA阳性的细胞比例及细胞内PSMA的表达量会逐渐增加，免疫组织化学染色也会趋于加深。Ki-67是细胞增殖相关的核蛋白，其表达水平可以有效反映肿瘤细胞的增殖速率。Ki-67表达量下调，意味着肿瘤细胞的增殖过程受到抑制。

对PSMA及Ki-67蛋白的免疫组织化学显色切片在光学显微镜下进行观察记录，结果如图1.C所示，与未给药处理的对照组(CTR)相比，依法韦仑给药组(EFV)的肿瘤组织中PSMA及Ki-67蛋白的表达量显著下调，表现为切片中免疫组化染色阳性的棕褐色颗粒密度及数量显著下降。上述两种肿瘤标志物表达量的下调，意味着在经过依法韦仑给药后，人前列腺癌来源的DU145细胞在裸鼠体内的增殖及侵袭性受到抑制，表明依法韦仑可以有效抑制人源前列腺癌肿瘤的生长及进展。

2、依法韦仑可以有效抑制前列腺癌细胞的增殖并促进其凋亡

为了研究依法韦仑对前列腺癌来源的肿瘤细胞的增殖及凋亡过程的影响，本实施例选取三种人源前列腺癌细胞系，进行体外梯度给药实验。依法韦仑药物工作浓度范围设定在10

使用Prism 8.0对体外梯度给药实验的数据进行非线性回归分析，结果如图2所示，结果表明在给药浓度10

另外，依法韦仑除了可以有效对非雄激素依赖性的前列腺癌细胞产生抗肿瘤作用外，还可以有效抑制依赖雄激素信号生长的前列腺癌细胞系LNCaP，如图2.C所示，依法韦仑发挥发挥增殖抑制和诱导凋亡作用的EC50分别为33μM和22μM。

上述实验结果表明，依法韦仑可以有效抑制前列腺癌细胞的增殖并促进其凋亡过程，且其抗肿瘤作用不限于针对非雄激素依赖性的前列腺癌，对雄激素依赖性的前列腺癌细胞依然有效。这意味着以依法韦仑为核心药物分子的全新的抗肿瘤疗法，不仅可以应用于目前临床中针对前列腺癌患者主流的内分泌疗法耐药(即去势抵抗性)后的疾病进展阶段，也可以与多种雄激素拮抗类的内分泌疗法进行联合用药，在前列腺癌早期发挥协同的抗肿瘤作用，延缓现有疗法耐药性的产生以及前列腺癌的进展。

3、依法韦仑给药可以有效降低前列腺癌细胞的克隆形成及生长

肿瘤细胞的克隆形成能力远强于正常组织细胞。当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。其中细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。肿瘤细胞的体外克隆能力越强，一定程度意味着该肿瘤细胞在体内的成瘤性越强，细胞克隆形成实验可以算是一种模拟体内成瘤的体外实验。

前期研究结果已经表明：依法韦仑给药可以有效抑制前列腺癌细胞的增殖并诱导其凋亡。因此，为了进一步研究依法韦仑给药对前列腺癌细胞的抗肿瘤作用，本实施例通过细胞克隆形成实验，来检测依法韦仑给药对前列腺癌细胞增殖能力及侵袭性的影响。本实施例选取平板克隆形成法(Colony formation)进行细胞克隆形成实验，该方法主要适用于贴壁细胞。具体实验操作如下：

(1)取对数生长期的DU145细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在完全培养基(基础培养基+10％胎牛血清)中备用。(2)流式细胞仪进行单细胞分选，将单个DU145细胞接种至微孔板的每个孔中。对照组使用不加药物处理的培养基，给药组使用含有不同终浓度依法韦仑的培养基进行细胞培养，给药剂量梯度中的依法韦仑给药浓度分别为：100nM,300nM,1μM,3μM,10μM,30μM。(3)细胞培养板置于37℃，5％CO

细胞克隆形成实验的结果如图3所示。图3.A为未加药处理的对照组(NT)中DU145细胞培养2周后的克隆形成情况。x轴数值表示单个细胞克隆包含的细胞数量，对应的y轴数值表示包含该数量细胞的克隆的形成数量。图3.B依法韦仑给药组(给药剂量：培养基中依法韦仑EFV的终浓度为10μM)中DU145细胞培养2周后的克隆形成情况。图3.C为体外依法韦仑给药浓度梯度下的DU145细胞克隆形成的实验结果-1，箱线图反映了整体克隆形成中单个克隆包含细胞数量的分布情况。除一组未加药处理的对照组NT外，给药剂量梯度中的依法韦仑给药浓度分别为：100nM,300nM,1μM,3μM,10μM,30μM。y轴表示单个细胞克隆包含的细胞数量。图3.D为体外依法韦仑给药浓度梯度下的DU145细胞克隆形成的实验结果-2，柱形图反映了细胞的克隆形成率。单个细胞集落包含细胞数量>200的情况下记为一个克隆。

通过比较未加药处理的对照组(NT，图3.A)与依法韦仑给药组(EFV 10μM，图3.B)中DU145细胞培养2周后的克隆形成结果，可以观察到：在依法韦仑给药剂量≥10μM的条件下，依法韦仑给药组的细胞克隆形成率大大降低，且单个克隆内的细胞数量显著下降，表明肿瘤细胞克隆的生长受到抑制。图3.C中表明，与未经给药处理的对照组相比，依法韦仑给药组(EFV 10μM)中单个克隆包含的平均细胞数量降低了约50倍。图3.D反映，与未经给药处理的对照组相比，依法韦仑给药组(EFV 10μM)的克隆形成率由93％降低到30％。

上述体外细胞克隆形成实验结果表明，依法韦仑可以有效抑制前列腺癌细胞系DU145肿瘤细胞的克隆形成及生长。依法韦仑既可以阻断单个肿瘤克隆的出现，降低克隆形成率；也可以在克隆形成后显著抑制克隆的生长。

4、依法韦仑给药改变前列腺癌细胞的基因表达谱

前述研究结果表明，依法韦仑给药可以有效抑制人源前列腺癌细胞的增殖并促进其凋亡。为了进一步研究依法韦仑的抗肿瘤作用机制，阐明依法韦仑给药对于肿瘤细胞基因表达谱的影响。本实施例采用Affymetrix公司的人类基因表达谱芯片GeneChip

本实施例使用的GeneChip

选取人类前列腺癌细胞系DU145进行体外给药实验：

对照组-1使用DMSO处理细胞，给药组使用培养基中终浓度为30μM的依法韦仑处理细胞，给药组设置两个平行重复实验(n＝2)。持续培养72小时后，胰蛋白酶消化、收集细胞、制备样品，使用人类基因表达谱芯片进行基因表达差异分析。另外设置对照组-2为不加任何处理的DU145细胞，直接收集相应数量的细胞进行样品制备及芯片杂交检测。

样品制备及使用人类基因表达谱芯片进行检测分析的操作步骤如下所示：

(1)总RNA提取：每组收集2×10

(2)使用QIAGEN RNeasy Total RNA Isolation kit纯化总RNA。

(3)使用(QIAGEN Oligotex Direct mRNA kit提取Poly(A)+RNA。

(4)使用Affymetrix的One-Cycle cDNA Synthesis kit将Poly(A)+RNA合成双链DNA：包含准备PolyA Control，第一链DNA合成，第二链DNA合成及DNA双链纯化。

(5)使用

(6)获得片段化cRNA：20μg cRNA与fragmentationbuffer混合，94℃，35min。反应结束后置于冰上。

(7)微阵列芯片杂交：1)芯片使用前需平衡至室温。2)在新的1.5mL RNase-free离心管中按下表配方配制杂交液。3)杂交液先99℃，5min；再45℃，5min。4)在进行上述步骤的同时通过加样孔加入适量体积的1×杂交缓冲液湿润芯片。5)杂交炉中45℃,60rpm预杂交芯片10min。6)步骤5处理过的样品最大速离心5min。7)从芯片中取出杂交缓冲液，加等体积处理好的杂交液(配方如图5所示)。8)杂交炉中45℃,60rpm杂交芯片16小时。

(8)洗脱、染色、扫描芯片：根据Affymetrix基因表达谱芯片操作指南，配置洗脱液、SAPE和MES染色液及抗体溶液，选择对应真核11μm的洗脱程序EukGE-WS2v5操作洗涤工作站进行洗脱、染色。使用Gene array Scanner3000 7G扫描芯片，采集荧光信号。

(9)数据处理及分析：

使用GCOS(数据处理软件)对采集的荧光信号进行统计分析，阵列中每个点的信号(signal)扫描仪检测出的光强度经过归一化后的数据。差异基因的挑选标准需要计算实验组和对照组的信号比值取Log2后的数据，即Signal Log Ratio。有关差异表达的基因，其上调(Up)和下调(Down)的筛选是按如下条件计算所得，Cutoff设定为FoldChange 1.5，即UpSignal Log Ratio>＝0.58,Down Signal Log Ratio<＝-0.58。

选取实验前后(对照组细胞加DMSO处理(对照组-1)，给药组细胞加依法韦仑处理，分别与处理前的细胞(对照组-2)的基因表达谱进行比较分析)，表达谱中差异倍数超过1.5的基因，根据发挥不同功能的多种细胞信号通路对其进行基因聚类分析，对照组(Control(DMSO)组)与给药组(Efavirenz组)处理前后差异基因聚类的结果分别如图4.A与图4.B所示。可以观察到，与加DMSO处理的对照组相比，加依法韦仑处理的给药组在涉及细胞形态发生、器官发育、细胞生长过程、细胞死亡等信号通路中，发生显著差异表达的基因数量显著上升，整个肿瘤细胞的基因表达发生了重编程，表明依法韦仑的给药可能通过影响这些细胞生理调节相关的信号通路，发挥抗肿瘤作用。

两个独立、平行的依法韦仑给药组的差异基因筛选结果交集揭示了92个差异基因，其中包括58个上调基因以及34个下调基因。为了提高筛选结果的可靠性，本实施例选取了依法韦仑给药及奈韦拉平(另一种非核苷类逆转录酶抑制剂)给药后，在两种同类药物的给药组中均发生差异表达的基因，如图5所示，共计27个基因：包括21个上调基因和6个下调基因。通过分析各个基因的功能可以发现，部分列表中的基因已被明确报道在多种肿瘤的发生及进展过程中发挥重要作用。具体如下：

上调基因：

(1)TMEFF1：编码一种脑肿瘤抑癌蛋白，其上调有利于抑制肿瘤的发生。

(2)TAC1：前体速激肽，TAC1被报道在结肠癌中发生显著下调。

(3)TFPI2：TFPI2的上调被报道与胰腺癌细胞的增殖抑制、潜在的转移性及侵袭性下降相关。

(4)Serpinf1：色素上皮衍生因子，又名PEDF，已有报道表明其对于恶性前列腺癌、神经胶质瘤、胰腺癌等具有抗肿瘤活性，该蛋白可通过抑制血管生成、诱导肿瘤细胞分化及凋亡等途径协同发挥抗肿瘤作用，因此其上调有利于抑制肿瘤的发生及进展。

下调基因：

(1)FN1：纤维连接蛋白，是一类细胞黏附分子，与肿瘤细胞的转移性相关。有报道表明：人纤维肉瘤浸润的肺组织与周围组织相比，其FN1表达明显上调，表明FN1的高表达有利于肿瘤的转移。其下调将有利于降低肿瘤的转移性，进而抑制肿瘤的进展。

(2)CTGF：结缔组织生长因子，有研究报道可以促进胰腺癌细胞的生长、侵袭、转移及血管生成。其下调将有利于抑制肿瘤的发生及进展。

综上所述，通过对经依法韦仑给药处理(给药组)前后的人前列腺癌细胞系DU145细胞进行基因表达谱的检测、差异表达基因及信号通路聚类分析，可以发现依法韦仑给药对前列腺癌细胞的整个基因表达谱产生了显著的影响，实现了基因组的重编程。差异表达基因及信号通路聚类分析的结果进一步证明了，依法韦仑以改变肿瘤细胞的基因表达谱的方式，上调部分具有抗肿瘤活性或降低肿瘤转移性及侵袭性的抑癌基因，下调部分有利于肿瘤发生发展的基因表达。通过抑制肿瘤组织附近的血管生成、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化及凋亡等途径，达到抗肿瘤的作用效果。

5、依法韦仑给药诱导前列腺癌细胞凋亡的分子机制

前述体外细胞实验结果表明，特定给药剂量范围内的依法韦仑可以有效诱导前列腺癌细胞的凋亡，本实施例将在分子水平，进一步研究依法韦仑给药诱导前列腺癌细胞发生凋亡的分子机制。本实施例选取经不同浓度的依法韦仑给药处理的前列腺癌细胞系PC-3细胞，提取细胞质总蛋白进行蛋白质免疫印迹(Western Blot)实验，检测凋亡途径中关键活性因子的含量及激活情况，来反映前列腺癌细胞中的凋亡途径是否被启动。

Caspases是一类半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡信号传导的级联反应中协同作用。这种级联反应的结果是细胞内大量蛋白质的裂解，接着是细胞的解体、细胞的死亡，最后是细胞的吞噬作用和细胞碎片的清除。在包括FasL(Fas配体)、TNF(肿瘤坏死因子)、Granzyme-B、GRB(生长因子受体结合蛋白)、DNA损伤等促凋亡刺激信号的介导下，启动Caspases(包括8、9、10和12)被激活，这些Caspases将裂解并激活下游效应Caspases(包括3、6和7)。

Caspase 8裂解BID(BH3相互作用死亡域)，tBID(Truncated BID)破坏线粒体外膜，导致促凋亡因子细胞色素C(Cytochrome-C)的释放，而后者对激活Caspase 9酶原(pro-Caspase 9)至关重要。从膜间隙释放的CytoC与APAF1(凋亡蛋白酶激活因子-1)结合，后者招募Caspase 9，进而通过水解Caspase 3酶原(pro-Caspase 3)而获得Caspase 3。

在非凋亡细胞中，Caspase 3以酶原(32kD)的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase 3由两个大亚基(17kD)和两个小亚基(12kD)组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。

DFF(DNAFragmentation factor)是一类DNA片断化分解因子，属于Caspase 3下游作用的底物之一。其中的DFF40/CAD也称作Caspase激活的DNA酶。在非凋亡细胞中，DFF由分子量45kD的分子伴侣/抑制剂的DFF45-ICAD-L亚单位和40kD的DFF40/CAD/CPAN两个亚单位组成，以无活性的异源二聚体形式存在。然而，在启动凋亡程序的细胞中，Caspase 3/7的凋亡激活作用引起DFF45-ICAD-L裂解，从而释放DFF40/CAD，使其成为有活性的DNA核酸酶，引起DNA断裂和染色质凝聚，是Caspase级联反应介导的细胞凋亡中关键性的一环。

因此，本实施例选取上述凋亡信号通路中的4个关键蛋白，通过蛋白质免疫印迹WB实验检测其在细胞质中的表达量或活化状态。4个目标蛋白分别为：

(1)细胞色素C(Cytochrome-C)：凋亡启动后由线粒体释放，细胞质含量应该上升；

(2)Caspase 9酶原(pro-Caspase 9)：凋亡启动后自切割活化为Caspase 9，分子量由45kD减小为35kD。

(3)Caspase 3酶原(pro-Caspase 3)：凋亡启动后被水解切割，活化为Caspase 3，分子量由32kD减小为17kD。

(4)DFF45(DNA片断化分解因子)：凋亡启动后被Caspase 3裂解，抗体可检测到的蛋白分子量由45kD减小为11kD，此处使用的WB检测抗体为Cleaved DFF45(Asp224)Antibody。

给药实验设计如下：

包括1个未加药处理的对照组与4个不同依法韦仑给药浓度的给药组，4组依法韦仑给药的终浓度分别为：10μM，25μM，50μM，100μM。按照设计对前列腺癌细胞系PC-3细胞进行加药处理，在37℃5％CO

细胞蛋白质提取及蛋白质免疫印迹实验(Westernblot)的操作步骤如下：(1)胰蛋白酶消化，PBS洗涤三次，800rpm，4℃5min离心收集细胞。(2)弃上清，加入细胞裂解液，裂解30min。(3)最大转速4℃离心15min，取上清，加入50μL蛋白上样缓冲液。(4)置于95℃水浴锅中孵育10min，取出置于冰上。(5)15％SDS-PAGE凝胶电泳。(6)剪取硝酸纤维素膜和滤纸，硝酸纤维素膜在电转液中浸泡3min，按序插入电转槽中。(7)转膜：100V恒压1h。(8)取出硝酸纤维素膜在TSB中漂洗，置于平皿，室温轻摇1h。(9)将滤膜放入杂交盒，加入5％脱脂奶粉作为封闭液，1:1000加入靶标蛋白的一抗，4℃摇床滚动过夜。(10)取出滤膜，使用TBST(含0.05％Tween 20的TBS)洗涤3次，5min/次，将滤膜放入杂交盒。(11)1:10000加入二抗，置于室温水平摇床避光摇动1h。(12)取出滤膜，TBST漂洗2次，TBS漂洗1次，5min/次。(13)显色：有蛋白条带的滤膜一面朝上放入保鲜膜，将显色底物A液B液等体积混匀，混合物覆盖保鲜膜表面，包好放入夹杯。(14)iBright CL750智能成像，调整曝光时间，拍照记录包含目标蛋白的条带。

蛋白质免疫印迹实验结果如图6所示，从上而下依次为Cytochrome C(45kDa、11kDa)、Pro-caspase9(45kDa、11kDa)、Pro-caspase3(45kDa、11kDa)和DFF(45kDa、11kDa)，可以观察到随着依法韦仑给药剂量的增加，尤其是依法韦仑给药浓度达到100μM的给药组中，细胞质中细胞色素C含量显著增加，表明线粒体外膜破坏，细胞色素C被释放。

Caspase9酶原(pro-Caspase9，45kD)含量降低，同时活化的Caspase9(35kD)的含量增加，表明Caspase9酶原被激活，自切割为具有水解酶活性的Caspase9。

Caspase3酶原(pro-Caspase3，32kD)含量降低，同时活化的Caspase3其中的大亚基(17kD)的含量增加，表明Caspase3酶原被激活，被水解为活化的Caspase3。

作为Caspase3下游底物的DFF45，表现为完整的45kD的DFF被Caspase3裂解，部分在Asp224位置被切割后产生11kD的条带。

上述实验结果均表明，依法韦仑在给药终浓度达到100μM的条件下，可以有效诱导前列腺癌细胞PC-3内的凋亡的发生，其通过启动Caspase级联反应的信号通路，促进了肿瘤细胞的程序性死亡。

6、探索依法韦仑用于治疗内分泌疗法耐药型前列腺癌的有效性

依法韦仑是一种属于非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)的苯并恶嗪酮。它最初是作为HIV逆转录酶的抑制剂开发的。当以推荐用于治疗艾滋病(AIDS)的剂量(600mg/天)使用时，人体对依法韦仑药物分子的耐受性良好，无明显毒副作用。在接受600mg/天的依法韦仑治疗的人体中获得的数据表明，约有70-80％的受试者体内，依法韦仑血浓度超过1500ng/ml。

动物模型的试验结果表明，在使用依法韦仑的大鼠中(WO03555493),可以达到抑制肿瘤进展效果的给药剂量约为5mg/kg/天(1mg/大鼠/天，腹腔注射给药，一只老鼠的体重约200g)。大鼠的药代动力学研究结果表明，静脉注射5mg/kg依法韦仑，可达到的最大血药浓度为5μM(可换算为：1578ng/ml)。

因此，用于治疗艾滋病的依法韦仑剂量(600mg/天)，其在人体内的血药浓度，预期可以达到治疗人类肿瘤疾病的效果。

(1)II期临床试验

研究依法韦仑治疗内分泌疗法耐药型的前列腺癌有效性的II期临床试验，初期设定的依法韦仑给药剂量为600mg/天。然而，由于临床II期研究的初期结果(三个月时间点)表明，600mg/天的给药剂量，不足以保证大部分受试者体内的血药浓度达到可以有效抑制肿瘤进展的水平(3000ng/ml)。

前列腺癌在进展的最初阶段，可采用第一代内分泌疗法很好地控制。然而，几年后，受试者会对内分泌疗法产生耐药性，雄激素阻滞不再有效。在该阶段，最常用来表征癌症进展的生物标志物是PSA(前列腺特异性抗原)在血浆中的水平的升高。初期PSA水平升高，但受试者无临床症状表现，此阶段建议不进行治疗；六到十二个月后，受试者出现症状，可实施化疗(

临床II期研究中入组的受试者患有转移性内分泌疗法耐药型前列腺癌，除血清睾酮低于50ng/dL外，没有任何与疾病进展和血清PSA升高相关的临床症状。本研究的主要目标是评估三个月时间内，依法韦仑给药对PSA水平进展的影响。

在探索性分析研究中，PSA进展被定义为比基线增加超过25％，并且血清PSA水平增加至少2ng/ml。研究过程还记录了受试者出现的临床症状，如新骨转移灶出现的数量和对治疗的整体响应效果(采用RECIST标准评估)。

前三个月，受试者每天接受的依法韦仑剂量为600mg，并且在依法韦仑治疗期间维持激素治疗。三个月后，研究人员有可能逐渐将依法韦仑剂量提高到1200mg/天。该研究纳入了61名受试者，53名受试者没有违反资格标准，并且至少接受过一次依法韦仑治疗。三个月后，在随访研究中评估总缓解率(ORR)和总生存期(OS)。

依法韦仑血药浓度的评估是一个可选的探索性目标，受试者必须明确同意。最终收集了41名受试者在给药三个月时间点的依法韦仑血药浓度，该数据用于探索性试验的统计分析。

评估受试者体内的依法韦仑血药浓度的方法如下：

血样采集：在依法韦仑给药开始的三个月后，开始实施用于评估依法韦仑血药浓度的血样采集。为了测定依法韦仑的血药浓度，使用肝素钠或肝素锂试管采集10mL的受试者血液。每次采血后，将试管5000g离心5min，血浆部分收集到聚丙烯管中。每个受试者的血浆管包装并存储在带有适当标签的塑料防冻袋中，-20℃保存至送样分析。

样品送至药代动力学分析实验室，使用超高效液相色谱-串联质谱检测(UPLC-MS/MS)技术，分析样品中含有的依法韦仑浓度。

提取步骤：将20μL内标溶液(依法韦仑

液相色谱/质谱分析：UPLC-MS/MS由Waters

用电喷雾进行检测负离子模式下的电离(ESI)。质谱仪选择多反应监测(MRM)模式。用来定量和验证的离子跃迁分别为314.3→69和314.3→244。通过分析血浆中制备的浓度范围为100-10000ng/ml的标准溶液获得校准曲线，定量极限(LOQ)为2.5ng/ml。

给药后三个月时间点的检测结果：在依法韦仑给药三个月的时间点，对受试者PSA水平的检测结果表明，接受依法韦仑的剂量为600mg/天受试者中(N＝53)，15/53(28％)未在3个月内表现出PSA水平的升高，而剩余72％的受试者均表现出PSA水平的升高，即肿瘤的继续进展。尽管在可以收集到依法韦仑血药浓度数据的41名受试者中，有70％受试者的血药浓度达到了预期有效的阈值(>1500ng/ml)。然而，对依法韦仑血药浓度高于3000ng/ml的受试者组进行分析，结果表明，仅29％的受试者表现出了PSA水平的升高。

结果表明：依法韦仑在给药剂量为600mg/天(治疗AIDS的依法韦仑推荐剂量)的条件下，无法达到抑制前列腺癌进展的临床效果。为了达到治疗癌症的效果，依法韦仑的给药剂量应高于治疗艾滋病的推荐剂量，保证受试者体内依法韦仑的血药浓度>3000ng/ml，有助于显著提高抑制肿瘤进展的临床效果。

根据依法韦仑在体外实验中对细胞抑制作用的药物浓度-抑制效果曲线，推测该化合物在受试者体内的血药浓度达到3000ng/ml时，开始表现出抗癌效果。鉴于依法韦仑吸收的个体差异很大，预计达到该浓度范围的受试者仅作为给药剂量600mg/天的受试者的子集出现。正是由于依法韦仑的血药浓度与治疗效果潜在的相关性，后续研究对可获得依法韦仑血药浓度数据的41名受试者进行了探索性分析。

根据依法韦仑的血药浓度(<1500ng/ml，n＝12；1500-3000ng/ml，n＝22；>3000ng/ml，n＝7)将受试者(n＝41)分成三组，可以观察到明显的量效关系。

根据图7A可知，在依法韦仑浓度高于3000ng/ml的组中，仅有28.6％的受试者(占无疾病进展的受试者的71.4％)观察到PSA进展。相反，在依法韦仑的低和中等血药浓度组(<1500ng/ml和1500-3000ng/ml)的受试者中，分别在83.3％和81.8％的受试者中观察到PSA进展[>3000v.s.<1500：P＝0.0449(双尾)和P＝0.029(单尾)；>3000v.s.1500-3000.P＝0.0164(两尾一尾)，Fisher精确检验]。显著性检验结果表明，依法韦仑血药浓度最高(>3000ng/ml)的受试者与低和中等血药浓度组受试者相比，显著延缓了PSA水平的进展。

根据图7B可知，新的骨转移灶仅出现在14.3％的血浆依法韦仑浓度>3000ng/ml的受试者中，而在<1500ng/ml和1500-3000ng/ml组受试者中出现的比例分别为66.7％和40.9％[>3000v.s.<1500：P＝0.0572(双尾)和P＝0.0389(单尾)；>3000v.s.1500-3000，P＝0.2817(双尾)和P＝0.1408(单尾)，Fisher精确检验]。具有低和中等依法韦仑血药浓度受试者组在PSA水平的进展[P＝1(双尾)和P＝0.649(单尾)Fisher精确检验]和新骨转移[P＝0.366(双尾)和P＝0.206(单尾)，Fisher精确检验]百分比方面均没有显著差异。显著性检验结果表明，依法韦仑血药浓度最高(>3000ng/ml)的受试者新骨转移灶的发生率，与低和中等血药浓度组受试者相比，显著降低。

结果表明：三个月的依法韦仑治疗(600mg/天)延缓了内分泌疗法耐药型前列腺癌的进展，治疗效果与血药浓度成正相关。

随访研究结果：

第一个随访探索性分析根据受试者的依法韦仑血药浓度分组，并分别进行药物响应效果的比较。这组分析仅使用三个月后未接受剂量递增的受试者(n＝28)。另有13名受试者接受剂量递增给药。

图8(A)高依法韦仑血药浓度组(无剂量递增前>3000ng/ml+剂量递增后>3000ng/ml)受试者和低依法韦仑血药浓度组(<3000ng/ml且无剂量递增)受试者无进展生存期的Kaplan-Meier曲线)。(B)(A)中两组的总生存期。上述为符合方案集分析(PP)的统计分析结果。

在随访期间，一些受试者终止了用药(n＝6)，因此使用符合方案集分析(PP，PerProtocol analysis)进行随访分析(图8)。

低依法韦仑血药浓度组(<3000ng/ml，无剂量递增)的受试者与高依法韦仑血药浓度组(>3000ng/ml，无剂量增加+剂量递增组合并)的受试者进行比较。后两组(无剂量递增组血药浓度高于3000ng/ml：7人；剂量递增后血药浓度>3000ng/ml：8人，7+8＝N＝15人)累计用于统计比较。

高依法韦仑血药浓度组(M＝15个月)的受试者与低依法韦仑血药浓度(M＝3个月)的受试者相比，无进展中位生存期PFS显著延长(图8A，P＝0.0032，Log-rank Mantel-Cox检验)。高依法韦仑血药浓度(M＝49个月)与低依法韦仑血药浓度受试者组(M＝23个月)相比，受试者的总生存期显著延长(图8B，P＝0.0127，Log-rank Mantel-Cox检验)。

随访结果表明：受试者体内依法韦仑血药浓度与疾病进展的相关性，反映了依法韦仑治疗转移性内分泌疗法耐药型前列腺癌的有效给药剂量。

临床II期研究，探索了依法韦仑作为转移性内分泌疗法耐药型前列腺癌的新疗法的有效性。研究结果揭示的给药剂量与血药浓度的依赖性效应，可以提供与安慰剂对照研究效力相似程度的证据。

依法韦仑在给药剂量为600mg/天(治疗艾滋病的依法韦仑推荐剂量)的条件下，无法达到抑制前列腺癌进展的临床效果。为了达到治疗癌症的效果，依法韦仑的给药剂量应高于治疗艾滋病的推荐剂量，例如本研究中实施的每日给药剂量递增至1200mg/天，以保证大多数受试者体内依法韦仑的血药浓度>3000ng/ml，有助于显著提高抑制肿瘤进展的临床效果。

研究结果表明，该化合物对人体毒副作用不明显，并且在血药浓度高于3000ng/ml条件下具有显著的治疗效果，依法韦仑的主要作用是减缓疾病进展。

通过临床II试验及给药剂量优化调整，验证了依法韦仑对mCRPC(转移性去势抵抗型前列腺癌/转移性内分泌疗法抵抗型前列腺癌)治疗的有效性，展示了其作为一种新型mCRPC临床治疗药物良好的应用及市场前景。

(2)I期剂量爬坡临床试验

该研究的目标为，探索合适的每日用药剂量，以保证大多数受试者体内的依法韦仑血药浓度可以达到3000ng/ml的水平，实现对肿瘤进展的有效抑制。

为了保证治疗过程中受试者体内的依法韦仑血药浓度达到有效阈值：

临床II期研究为确定可用于CRPC(去势抵抗性前列腺癌/内分泌疗法耐药型前列腺癌)未来临床试验的依法韦仑剂量提供了两个重要信息：首先，当依法韦仑的血药浓度>3000ng/ml时可以观察到治疗效果。然而，在接受剂量为600mg/天依法韦仑的受试者中，达到该血药浓度的比例仅为17％。其次，在依法韦仑血药浓度低于<3000ng/ml的受试者中，将给药剂量增加至1200mg/天，可以显著提高治疗效果。

依法韦仑在作为艾滋病治疗药物开发的过程中，已经观察到感染HIV的受试者在给药剂量600mg条件下口服药物，可观察到依法韦仑的血药浓度存在明显的个体差异，变异系数在53和110％之间。

在稳定状态(经过数月的给药治疗)下，依法韦仑的血药浓度范围为125至15230ng/ml，中位数为2188ng/ml。13％的受试者的血药浓度可达到>4000ng/ml，7％的受试者的血药浓度<1000ng/ml。这些数据表明，依法韦仑在癌症治疗的血药浓度有效范围(>3000ng/ml)在人体中具有良好的安全性。

本研究是在上述临床II期研究的阳性结果的基础上，补充进行的给药剂量优化研究，探索可以给予癌症受试者的最高剂量的依法韦仑。临床II期研究的结果表明，人体对于给药剂量1200mg/天的依法韦仑耐受性良好。

本研究是单臂，单中心的剂量递增I期研究。旨在评估实体瘤(非胰腺癌)受试者和化疗失败的非霍奇金淋巴瘤(NHL)受试者口服依法韦仑的安全性，耐受性和推荐剂量。该研究采用连续重新评估法似然法对剂量递增进行评估。

其中，主要研究目标是使用国家癌症研究所不良事件通用术语V4.0(NCI-CTCAE)评估依法韦仑可用于难治性实体瘤或非霍奇金淋巴瘤(NHL)受试者对依法韦仑的最大耐受剂量(MTD)。依法韦仑给药28天(+/-7天)后，评估剂量限制性毒性(DLT)。三个次级研究目标：分析依法韦仑的药代动力学特征：在给药治疗2，4和12周后，采集受试者血样，测量依法韦仑的血药浓度。

评估给药3个月时的客观缓解率，评估6个月时的无进展生存期(PFS)，上述评估基于RECISTV1.1和NHL。同时在前列腺癌的情况下，根据Scher推荐方法评估疾病发生生物学进展的时间。

剂量爬坡I期研究的药代动力学试验结果，不同给药剂量条件下受试者体内依法韦仑的血药浓度及剂量限制性毒性(DLT)检测结果：

剂量爬坡I期研究中获得的药代动力学结果表明，提升剂量给药后依法韦伦的血药浓度可持续处于稳态。增加每日给药剂量，将保证大多数受试者体内的依法韦仑血药浓度成功达到有效治疗的浓度范围。

剂量爬坡I期研究在3年的时间内，向23例受试者施用了不同剂量的依法韦仑，并在不同的时间间隔(540至12240分钟)后测量依法韦仑的血药浓度。一些患者可能多次接受不同剂量的依法韦仑，因此提供了多个样本。

给药600mg的条件下，采集了5个样品；给药1200mg的条件下，采集了15个样品；给药1800mg的条件下，采集了8个样品；给药2200mg的条件下，采集了5个样品。

根据图9可知，接受600mg剂量依法韦仑的5例受试者中，仅有20％的受试者(1例)血药浓度高于3000ng/ml。接受1200mg依法韦仑治疗的15名受试者中，有73％的受试者(11例)血药浓度高于3000ng/ml。

数据表明，依法韦仑的每日剂量增加显著增加了依法韦仑的血药浓度，使其临床II期试验结果预期的、对于癌症治疗有效的血药浓度范围内。

对接受不同依法韦仑给药剂量的24名受试者，进行剂量限制性毒性(DLT)分析，结果如下表：

表1依法韦仑给药剂量的限制性毒性分析结果

根据表1的DLT的研究结果表明，依法韦仑给药剂量为1200mg剂量组的毒性程度与600mg接近，处于可以接受的范围：而1800mg及2200mg剂量组的的剂量限制性毒性发生比例大幅上升，毒性过高，不可接受。

依法韦仑引起的DLT以精神科症状为主，主要出现在给药的前两周内，且停药后毒副作用可以完全缓解。因此，建议临床试验设置2周的“试用给药阶段”，用来筛选提出对依法韦仑不耐受的患者。

鉴于依法韦仑给药后血药浓度的个体差异明显，为保证所有受试者的依法韦仑血药浓度高于目标浓度阈值(>3000ng/ml)，本研究设计了一种“给药剂量调整策略”。

根据药代动力学研究结果，依法韦仑在人体内，一般在给药10至12天后达到稳态浓度。因此本研究设计在依法韦仑给药治疗两周后，采集受试者血样，检测依法韦仑的血药浓度。

推荐的依法韦仑起始给药剂量设定为1200mg/天，有两个原因：首先，它是已经在临床II期研究中的CRPC受试者中使用的剂量，并且已经显示出临床功效和良好的耐受性。其次，1200mg/天剂量将保证大多数受试者(73％)的依法韦仑血药浓度处于有效治疗浓度范围，从而减少需要进行剂量调整的受试者数量(27％)。

由于血药浓度的个体差异很大，因此依法韦仑在作为治疗艾滋病的药物的开发的过程中，已经使用贝叶斯最大似然法制作了基于HIV受试者群体分析的剂量调整模型。本研究按照相同的血药浓度范围分组，对临床II期研究的受试者血药浓度数据进行统计分析，结果如表2所示：

表2在临床II期研究的不同受试者中依法韦仑的血药浓度分布结果

其中，本研究的受试者与年龄和HIV人群不同(中位年龄分别为72岁与40岁)且内在的病理学基础也不同。然而，在本研究和HIV受试者中观察到的依法韦仑的血药浓度在很大程度上是可比较的，这意味着HIV受试者中产生的剂量调整模型可以适用于CRPC受试者。这简化了剂量调整程序，使其可以一步完成。这两个分布没有显著差异(P>0.27，Fisher精确检验)。

以剂量爬坡I期研究结果为基础，设计临床治疗用药剂量方案：所有受试者的初始给药剂量设定为1200mg，并根据个体差异进行给药剂量调整，保证受试者体内依法韦仑的血药浓度大于3000ng/ml的水平，处于预期的的有效治疗浓度范围内。

临床I期及II期的研究结果表明，依法韦仑在合适的给药剂量方案下，治疗转移性去势抵抗性前列腺癌(mCPRC)具有安全性及有效性。

综上，补充剂量爬坡试验的临床I期试验结果表明：在大多数受试者中，增加给药剂量，确实可以使受试者的依法韦仑血药浓度达到对于临床治疗效果有益的目标水平(3000ng/ml)，且在给药剂量为1200mg/天的条件下，没有造成药物毒性的显著提高，保证了给药剂量增加后的安全性。以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。