免疫荧光试剂盒、方法及透膜液

摘要

本申请提供了一种免疫荧光试剂盒、方法及透膜液。所述试剂盒包括多个反应盒，所述反应盒包括盒体和封口膜；所述盒体内设有分隔板，所述分隔板将所述盒体的内腔分为多个相互独立的腔室；多个所述腔室内分别容纳有粉剂或液剂，多个所述腔室内的粉剂和液剂混合后能够形成用于免疫荧光试验的试剂；所述盒体内设有多块用于放置玻片的玻片隔板；所述封口膜封住所述盒体并将多个所述腔室相互密封隔离。采用本申请的免疫荧光试剂盒，可以同时对多个固定好的玻片样本进行透化、封闭处理等；能够实现对不同玻片样本的标准化操作，便于临床大批量检测。本申请的试剂盒，对科研人员的操作能力要求较低，具有新手友好性。

说明书

技术领域

本申请涉及免疫荧光技术领域，特别是涉及一种免疫荧光试剂盒、方法及透膜液。

背景技术

免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术；主要包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等步骤。从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，免疫荧光的每一步都非常关键，需要对实验过程中每个步骤都进行严格的把控，才能得到真实的实验结果。

目前，科研人员进行免疫荧光实验时通常为全手工操作，每一步都需要配置对应的试剂、按照一定的顺序分别滴加到载玻片上；在玻片数量较多时，这样的操作方法复杂费时、且不能实现对多个玻片进行标准化的操作，由此得到的实验结果可能存在偏差。

发明内容

基于此，本申请提供了一种操作简单、省时、准确性高的免疫荧光试剂盒。

具体技术方案如下：

根据本申请的一个方面，提供了一种免疫荧光试剂盒，包括：

多个反应盒，所述反应盒包括盒体和封口膜；

所述盒体内设有分隔板，所述分隔板将所述盒体的内腔分为多个相互独立的腔室；多个所述腔室内分别容纳有粉剂或液剂，多个所述腔室内的粉剂和液剂混合后能够形成用于免疫荧光反应的试剂；所述盒体内设有多块用于放置玻片的玻片隔板；所述封口膜封住所述盒体并将多个所述腔室相互密封隔离。

在其中一个实施例中，所述玻片隔板的数量为多块，多块所述玻片隔板成对地设置于所述盒体相对的两个内侧壁上。

在其中一个实施例中，所述玻片隔板从所述盒体的顶部延伸至所述盒体的底部。

在其中一个实施例中，所述分隔板与所述盒体可拆卸地连接。

在其中一个实施例中，还包括：

盒盖，所述盒盖盖合于所述封口膜上且与所述盒体密封连接。

在其中一个实施例中，多个所述反应盒分为第一反应盒、第二反应盒和第三反应盒，所述第一反应盒内所述试剂为透膜液，所述第二反应盒内所述试剂为封闭液，所述第三反应盒内所述试剂为洗涤液。

在其中一个实施例中，所述透膜液包括2.25mM～2.75mM乙二胺四乙酸、8％(v/v)～2.2％(v/v)甲醛、0.8mM～1.05mM紫杉醇和0.5％(v/v)～1.0％(v/v)Triton X-100。

在其中一个实施例中，所述透膜液包括2.25mM～2.5mM乙二胺四乙酸、1.8％(v/v)～2.0％(v/v)甲醛、0.8mM～1.0mM紫杉醇和0.5％(v/v)～0.75％(v/v)Triton X-100。

根据本申请的另一方面，提供了一种免疫荧光的方法，采用上述的免疫荧光试剂盒对固定有待测样本的玻片进行处理。

根据本申请的又一方面，提供了一种透膜液，包括2.25mM～2.75mM乙二胺四乙酸、1.8％(v/v)～2.2％(v/v)甲醛、0.8mM～1.05mM紫杉醇和0.5％(v/v)～1.0％(v/v)TritonX-100。

与传统技术相比，本申请具有如下有益效果：

本申请的免疫荧光试剂盒，可以同时对多个固定好的玻片样本进行透化、封闭处理等；能够实现对不同玻片样本的标准化操作，便于临床上大批量检测。其次，本申请试剂盒的盒体中设有隔板，将粉剂和液剂分隔开，使用时抽掉隔板、放入玻片即可；无需手工临时配试剂，简单、省时、且能延长试剂保质期。此外，本申请的试剂盒，对科研人员的实验水平要求较低，具有新手友好性。

此外，使用本申请的免疫荧光透膜液对玻片样本进行处理后，荧光标记的精子浓度更高，能够用于对精子浓度较低的样本进行处理；并且，使用本申请的透膜液，能够提高荧光染色结果的清晰度。

附图说明

为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请一实施方式的免疫荧光试剂盒的立体结构示意图；

图2为本申请一实施方式的免疫荧光试剂盒中反应盒的俯视图；

图3为本申请另一实施方式的免疫荧光试剂盒中反应盒的俯视图；

图4为本申请一实施方式的免疫荧光染色方法与传统免疫荧光染色方法的结果图；

图5为实施例1中使用不同方法进行免疫荧光的染色结果图；

图6为实施例2中使用不同透膜液进行免疫荧光的染色结果图。

附图标记说明：

100、反应盒；110、盒体；111、玻片隔板；112、分隔板；113、腔室；120、封口膜；130、盒盖。

具体实施方式

为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。

本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。

本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。

本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。

本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。

本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。

本申请中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本申请中，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。

本申请中，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。

本申请中，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。

请参阅图1，本申请的一些实施方式提供了一种免疫荧光试剂盒。

在其中一些实施方式中，上述免疫荧光试剂盒包括多个反应盒100，反应盒100包括盒体110和封口膜120；盒体110内设有分隔板112，分隔板112将盒体110的内腔分为多个相互独立的腔室113；多个腔室113内分别容纳有粉剂或液剂，多个腔室113内的粉剂和液剂混合后能够形成用于免疫荧光试验的试剂；盒体110内设有多块用于放置玻片的玻片隔板111；封口膜120封住盒体110并将多个腔室113相互密封隔离。

本申请的免疫荧光试剂盒，包括多个相互独立的反应盒100，每个反应盒100中容纳有预制的试剂，在进行免疫荧光时，科研人员无需精通所有步骤，按照一定顺序将固定有待测样品的玻片依次放置在玻片隔板111上即可，即使是科研新手也能顺利完成免疫荧光的所有步骤。

上述试剂盒中的多个反应盒100具有完全相同或相似的结构，具体地，每个盒体110内部至少设置有一个分隔板112，分隔板112将盒体110内部分为多个相互独立的腔室113。

在其中一个示例中，分隔板112与盒体110接触的位置均用胶水粘合，使各个腔室113互相隔开，达到密封的状态。可理解地，在其他一些示例中，分隔板112与盒体110也可采用其他的方式连接，只要能使各个腔室113互相隔开、达到密封的状态即可。

在其中一些实施方式中，各个腔室113内分别容纳有粉剂或液剂，粉剂和液剂混合后能够形成用于免疫荧光反应的试剂。

当设置有一个分隔板112时，盒体110内部被分为两个独立的腔室113，其中一个腔室113容纳粉剂，另一个腔室113容纳液剂；或者，两个腔室113分别容纳有不同种类的粉剂或液剂。

可理解地，分隔板112的数量可根据需要设置，如反应试剂的成分中包含多种不能提前混合的液剂，则可设置两个或两个以上的腔室113容纳不同种类液剂。

在其中一些具体示例中，分隔板112与盒体110可拆卸地连接。

使用时将分隔板112抽出、使各个腔室113中的液剂/粉剂混合均匀，即可实验；无需科研人员单独配置试剂，简化了各个实验步骤的操作、节省了大量时间。

在其中一些实施方式中，每个盒体110内设有多块用于放置玻片的玻片隔板111。

在其中一些具体示例中，玻片隔板111的数量为多块，多块玻片隔板111成对地设置于盒体110相对的两个内侧壁上。

在一个具体示例中，玻片隔板111从盒体110的顶部延伸至盒体110的底部。

可以理解地，每个盒体110的一对内侧壁上设置有成对的玻片隔板111，反应时将固定好待测样品的玻片两端分别放置在成对的玻片隔板111上。玻片隔板111的数量可以根据实际需要设置，如试剂盒的规格为用于处理5片玻片，则设置5对玻片隔板111；如试剂盒的规格为用于处理10片玻片，则玻片隔板111的数量设置为10对。

请参阅图2，在其中一些实施方式中，玻片隔板111的宽度d1为0.5mm～1.0mm。

在其中一个具体示例中，玻片隔板111的宽度d1为1.0mm。

可以理解的是，玻片隔板111的宽度d1设置为0.5mm～1.0mm，可以防止玻片滑落、且不影响试剂与玻片上的细胞反应。如果玻片隔板的宽度过大，相应地需要扩大盒体110的体积，试剂用量也需增加，不符合资源合理化的要求。

在其中一些实施方式中，封口膜120为易撕封口膜；可选地，封口膜120为易撕封口铝膜。

在其中一些实施方式中，上述试剂盒还包括盒盖130，盒盖130盖合于封口膜120上且与盒体110密封连接。

在其中一些实施方式中，盒盖130与盒体110密封连接，使粉剂、液剂在长期保存的过程中不会受潮变质；此外，在使用时，扯掉分隔板112后可以摇晃盒体110使液体不会泄漏。可理解地，盒盖130与盒体110的连接方式可以是螺旋口式，也可以是卡扣式，还可以是其他连接方式，只要能使盒体110与盒盖130密封连接即可。

在其中一些实施方式中，反应盒100为聚苯乙烯盒。

采用与培养皿类似的材质，如聚苯乙烯作为反应盒100，制成一次性的免疫荧光试剂盒，无需消毒重复利用，能够有效避免不同试剂之间交叉污染。

在其中一些实施方式中，反应盒100为不透光的聚苯乙烯盒体110。可理解地，免疫荧光实验中，涉及荧光染料的反应步骤应当避光处理，因此选用不透光的反应盒100。

在其中一些实施方式中，多个反应盒100分为第一反应盒、第二反应盒和第三反应盒，第一反应盒内试剂为透膜液，第二反应盒内试剂为封闭液，第三反应盒内试剂为洗涤液。

在一个具体示例中，上述试剂盒包括1个第一反应盒、1个第二反应盒以及10个第三反应盒。具体地，将固定有待测样本的玻片，按照如下所示的顺序依次放入：第一反应盒(透膜液)→第三反应盒(洗涤液)→第三反应盒(洗涤液)→第二反应盒(封闭液)→孵育一抗→第三反应盒(洗涤液)→第三反应盒(洗涤液)→第三反应盒(洗涤液)→孵育二抗→第三反应盒(洗涤液)→第三反应盒(洗涤液)→第三反应盒(洗涤液)→DAPI复染→第三反应盒(洗涤液)→第三反应盒(洗涤液)。

在其中一些实施方式中，封闭液包括5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)。反应盒100中试剂为上述封闭液时，盒体110被分隔板112分为两个相互独立的腔室113；一个腔室113容纳BSA粉剂；另一个腔室113容纳纯水。

在其中一些实施方式中，封闭液包括BSA、C

在其中一些实施方式中，洗涤液选自PBS缓冲液、DPBS缓冲液或PBST缓冲液。

在其中一些实施方式中，透膜液包括PIPES(1-4-哌嗪二乙磺酸)缓冲液、MgCl

在其中一些示例中，透膜液包括2.25mM～2.75mM乙二胺四乙酸、1.8％(v/v)～2.2％(v/v)甲醛、0.8mM～1.05mM紫杉醇和0.5％(v/v)～1％(v/v)TritonX-100。

进一步地，透膜液包括2.25mM～2.5mM乙二胺四乙酸、8％(v/v)～2.0％(v/v)甲醛、0.8mM～1.0mM紫杉醇和0.5％(v/v)～0.75％(v/v)TritonX-100。

更进一步地，透膜液包括0.1M PIPES缓冲液、5.0mM MgCl

PIPES缓冲液和MgCl

在其中一些实施方式中，反应盒100中包含的透膜液也可以选自其他的透膜液，如TritonX-100和PBS缓冲液混合制成的透膜液。

本申请的一些实施方式还提供了一种采用上述试剂盒进行免疫荧光的方法。

在其中一些实施方式中，上述免疫荧光的方法，包括如下步骤：将固定有待测样本的玻片依次放入容纳有不同试剂的反应盒100中反应。

图4中早细线期至双线期为传统方法得到的免疫荧光染色图，早终变期至末期Ⅰ为使用上述免疫荧光方法得到的免疫荧光染色图，本申请的免疫荧光方法与传统的免疫荧光染色结果一致、蛋白定位的清晰程度相同；表明两种方法的结果可以通用。

本申请的一些实施方式还提供了一种透膜液。

在其中一些实施方式中，上述透膜液包括0.1M PIPES缓冲液、5.0mM MgCl

进一步地，透膜液包括0.1M PIPES缓冲液、5.0mM MgCl

更进一步地，透膜液包括0.1M PIPES缓冲液、5.0mM MgCl

使用本申请的透膜液，能够使免疫荧光染色图中荧光浓度较高、荧光清晰；适用于对精子数量稀少的样本进行染色。

下面将结合具体实施例和对比例对本申请作进一步说明，但不应将其理解为对本申请保护范围的限制。

实施例1：本申请的免疫荧光试剂盒与传统染色方法的比较

(1)使用本申请的试剂盒进行免疫荧光

本实施例的试剂盒共包含12个相互独立的反应盒100，各个反应盒100中包含的成分如表1所示。分别打开1～12号反应盒100的盒盖130，撕去封口膜120，抽出分隔板112，再盖上盒盖130，上下颠倒反应盒100使粉剂和液剂混合均匀；将固定好的玻片依次放入1～12号反应盒100，将玻片较长的两边放置在玻片隔板111上，使载玻片浸泡在混合后的液体中。然后按表1所示的条件进行处理。

表1

质控：将试剂盒中附带的精子质控涂片与实验样品涂片一同放入试剂中进行染色，目的蛋白在质控片中的定位正确、荧光清晰，表明透膜步骤没有问题；质控片背景干净，表明洗片步骤没有问题；质控片的核染色清晰，目的蛋白在质控片中的定位正确、荧光清晰，表明抗体贴步骤没有问题。

(2)使用传统方法进行免疫荧光

2.1实验材料

2.1.1.通用试剂：Triton X-100、NaCl、KCl、Na

2.1.2.实验耗材：载玻片、盖玻片、抗体贴、湿盒

2.2实验步骤

将处理好的小鼠睾丸单细胞悬液离心去上清，用4％多聚甲醛重悬，固定10分钟；将处理后的细胞涂在酸处理过的、多聚赖氨酸涂层的载玻片上，待自然风干；用0.25％(v/v)的Triton X-100室温渗透化处理10min；使用1×PBS缓冲液洗两次，各5min；5％(w/v)BSA室温封闭1h；加一抗SCP3(1：500稀释于5％BSA)和γH2AX(1：200稀释于5％ BSA)孵育，置于湿盒，4℃过夜；1×PBS洗三次，各10min；加FITC(Fluorescein Isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)连接的二抗(1：500稀释于5％ BSA)，TITC连接的二抗(1：500稀释于5％BSA)，室温避光置于湿盒1h；1×PBS洗三次，各10min；精子核用DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole，4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色，室温避光置于湿盒5min；1×PBS洗两次，各10min；盖玻片拍照，观察。

(3)结果比较

图5为采用不同的方法对目的蛋白进行定位的实验结果，其中A为使用本申请的试剂盒进行染色的结果；B为使用传统方法进行染色的结果。采用两种方法对同一个样本进行免疫荧光检测，蛋白定位的清晰程度相同、蛋白定位一致，两种方法的实验结果相同，对实验结果没有影响，因此认为两种方法得到的实验结果完全可以通用。

实施例2：比较不同透膜液对免疫荧光的影响

分别采用A、B两种不同的透膜液配方对人精子进行免疫荧光，具体实验方法、步骤与实施例1(1)基本相同；荧光抗体包括PNA、a-TUBULIN和DAPI。

透膜液A(本申请的透膜液)：PIPES 30.24g(0.1M)，MgCl

透膜液B：2.5mL TritonX-100、997.5mL PBS。

透膜液C：PIPES 30.24g(0.1M)，MgCl

免疫荧光染色后，判断实验效果具体包括是否有脱片情况、观察精子固定后的形态、染色后的清晰情况。细胞形态的判定通常包括三种情况：(1)细胞形态基本正常，没有出现明显的缩胀(例如，与光镜下的精子形态比较，染色后的精子头部没有异常膨大，精子尾部没有异常卷曲，精子头颈部没有异常断裂)；(2)细胞形态发生改变，明显缩胀；(3)细胞出现严重的缩胀。

图6为采用两种不同透膜液处理后对精子进行免疫荧光的染色结果图，其中A为使用透膜液A处理后进行染色的结果；B为使用透膜液B处理后进行染色的结果；C为使用透膜液C处理后进行染色的结果。与透膜液B相比，采用本申请的透膜液进行处理后染色的荧光信号相对较高(透膜效果好)，且无脱片现象，说明同时可适用于精子数量稀少的样本进行染色；精子形态正常，表明本申请的透膜液对细胞形态变化没有影响；荧光染色结果中微管蛋白的清晰度更高(可以看清楚目的蛋白在精子局部结构中表达的高低和位置)。使用透膜液B有少许样本脱片；与透膜液C相比，采用本申请的透膜液进行处理后染色的荧光信号更高，荧光染色结果中微管蛋白的清晰度更高(可以看清楚目的蛋白在精子局部结构中表达的高低和位置)。

综上，采用本申请的试剂盒进行免疫荧光得到的荧光图，能够反应真实、准确的实验结果；同时还具有简单易操作、省时等优点。此外，本申请的透膜液能够提高免疫荧光的荧光密度和清晰度，适用于精子数量稀少的样本。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。