一种可次第释放多种生长因子的核壳纳米纤维膜及其制备方法

摘要

本发明涉及一种可次第释放多种生长因子的核壳纳米纤维膜及其制备方法。本发明中，采用同轴静电纺丝技术制备具有核壳结构的纳米纤维膜，将第一种生长因子载入核壳纤维的核层，同时利用乙醇梯度脱水法将第二种生长因子载入微球，并将该微球载入核壳纤维的壳层，最后利用静电层层自组装技术将第三种生长因子负载到核壳纤维的外表面，构建一种以三种不同速率释放生长因子的控释系统。本方法利用同轴静电纺丝技术、乙醇梯度脱水法、静电层层自组装技术将不同生长因子载入纳米纤维的核、壳以及外表面中，达到以多种不同的释放速率长效缓释生长因子的目的，从而实现生长因子对组织再生修复的协同诱导作用，在组织创伤修复中具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明制备了一种可次第释放多种生长因子的核壳纳米纤维膜，可协同促进组织再生，属于组织修复材料的制备技术领域。具体地说，是采用同轴静电纺丝技术、乙醇梯度脱水法和静电层层自组装技术构建一种多生长因子次第释放系统的新方法，特别涉及同轴静电纺丝技术和静电层层自组装技术对载药纳米纤维的绿色可控制备过程，及核壳纳米纤维中多种生长因子的次第可控释放。

背景技术

采用组织工程方法构建复合种子细胞、支架材料和生长因子的生物活性人工骨被认为是进行骨缺损修复最有效的方法之一。生长因子是一类在组织修复和再生过程中调节关键细胞活动的天然生物介质，通过诱导细胞的生长和增殖，从而促进组织的再生愈合。在组织的形成、发育及修复的过程中，各种生长因子分别作用于不同时相，且存在相互协调作用。但生长因子对组织再生的调控作用受多种因素影响，包括生长因子的组合、用量、载体、释放速率等。因此，需要根据不同因子的诱导特性和机理构建一种具有多种生长因子次第释放特性的载体系统，使其模拟组织再生的生理过程，适时适量地释放不同的生长因子到需要的组织和细胞。

目前组织工程支架的制备方法有很多种，主要包括：纤维连接法、溶剂浇铸/粒子沥滤法、热致相分离法、静电纺丝法、冷冻干燥法、原位聚合法等，这些方法需要使用大量的有机溶剂，并且需要在高温等苛刻条件下进行，制备过程复杂，无法保持蛋白类生长因子的完整生物活性。其中静电纺丝的方法被认为制备纳米纤维材料的最有效的方法之一。这种方法制备的组织工程纤维支架孔连通性好、与天然细胞外基质相似，有利于细胞的粘附增殖与分化。而同轴静电纺丝作为静电纺丝技术的一大突破，制备的核壳纳米纤维，可以在核层材料中负载生物活性因子，最大化保证生长因子的活性。将同轴静电纺丝技术和静电层层自组装技术结合可实现多种生长因子的次第释放，从而满足组织再生修复不同阶段对不同生长因子的需要。

发明内容

本发明的目的在于根据不同生长因子对组织再生修复的诱导机理和协同作用，制备一种模拟生理修复状况以不同速率释放多种生长因子的复合支架。本发明制备的一种可次第释放多种生长因子的核壳纳米纤维膜所采用的工艺步骤如下：

（1）采用乙醇梯度脱水法将一种或多种生长因子载入明胶微球中，将明胶微球与聚合物溶液混合均匀，作为壳层溶液。

（2）将明胶溶解于混合溶剂中，充分溶解后，加入一种或多种生长因子溶液，混合均匀，作为核层溶液。

（3）将核层和壳层溶液分别装入不同注射器，控制静电纺丝工艺参数，采用同轴静电纺丝技术制备得到核层和壳层分别负载不同生长因子的核壳纤维膜。真空干燥，去除残留溶剂。

（4）运用静电层层自组装技术将另一种生长因子载入纤维膜的外表面。

（5）冷冻干燥得到一种以不同速率次第释放多种生长因子的核壳纳米纤维膜。

所述步骤1中，采用乙醇梯度脱水法制备载生长因子的明胶微球。在室温下将明胶溶解于去离子水中，直至得到澄清溶液，浓度为10~60 mg/mL。使用 0.2mol/L 氢氧化钠调节溶液 pH 值至 7.0~7.4。搅拌条件下加入乙醇梯度置换出水以形成明胶颗粒，再加入乙二醛进行交联，室温下搅拌10~20 h。反应结束后用 12 %（w/v）的焦亚硫酸钠水溶液除去乙二醛中未反应的醛基。14000rpm离心 90min，将收集到的明胶颗粒用去离子水洗涤两次后，冷冻干燥。为了负载生长因子，使明胶颗粒的羧基在N-乙基-N`-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐(EDC，4 mg/ml)和 N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠(NHS，4 mg/mL)的 MES缓冲液(100mM，pH 6)中活化 1~3h。在去离子水中透析过夜后离心，冷冻干燥，再加入到生长因子溶液中，反应10~20h。离心收集，冷冻干燥。其中，在 100ml 的最终洗脱混合液中，乙醇与水的体积比为13：7~7：13。

所述步骤1中，微球制备材料为天然高分子材料，如明胶、壳聚糖、透明质酸等。壳层材料为合成高分子材料，如聚乳氨酸、乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯等，分子量为10~30万，质量浓度为5~20 %(w/v)。溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、三氟乙醇、六氟异丙醇、甲醇等的一种或多种混合。

所述步骤2中，核层材料为天然高分子材料，如明胶、壳聚糖、透明质酸、聚乙二醇、胶原蛋白等，核层材料的溶剂为去离子水、磷酸盐缓冲液、醋酸等水性溶剂，或水性溶剂与有机溶剂按照不同配比制备的混合溶剂。配制不同浓度的核层材料溶液，质量浓度为10~20%(w/v)，混合溶剂体积比为1:3~3:1。

所述步骤1中，微球制备材料为天然高分子材料，如明胶、壳聚糖、透明质酸等。壳层材料为合成高分子材料，如聚乳氨酸、乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯等，分子量为10~30万，质量浓度为5~20 %(w/v)。溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、三氟乙醇、六氟异丙醇、甲醇等的一种或多种混合。

所述步骤3中，采用同轴静电纺丝技术制备核壳纤维工艺参数为：温度20~30℃，相对湿度35~45%，核纺丝液流速0.0005~0.001 mm/s，壳纺丝液流速0.0025~0.003 mm/s，负电压15~20 kV，接收距离10~20 cm。真空干燥的温度为30~37℃，时间为24~48h。

所述步骤4中，采用层层自组装的技术制备负载生长因子的纤维膜时：生长因子的用量为10~20 μg/mL，溶剂为水、PBS缓冲液等。采用与壳层材料带相反电荷的水溶性材料发生自组装反应，如壳聚糖、透明质酸、胶原等，其浓度为1~5 mg/mL，pH为3~5。纳米纤维膜小片在不同溶液中浸泡的时间为10~20 min，整个浸泡过程均在-4℃条件下进行，自组装层数为一层或多层。

本发明原创性和显著的技术进步在于

本发明涉及一种可次第释放多种生长因子以协同促进组织再生修复的核壳纳米纤维膜的制备。一方面，利用同轴静电纺丝技术制备了核壳结构的纳米纤维，并将不同生长因子分别载入纤维的核、壳结构内。核壳纤维不但能模拟天然细胞外基质，还能有效保证核内包载的生长因子的生物活性及释放速率。另一方面，静电层层自组装技术具有独特优势，不仅能够有效控制纤维膜外表面负载的细胞因子总量，还可以通过改变聚电解质的种类调控膜的亲水性和生物活性。总的来说，本发明制备的纳米纤维充分展现了其核壳结构的优势，模拟生理修复模式释放不同生长因子，充分发挥生长因子的协同诱导效应，满足组织再生修复过程中机体对不同生长因子的需要。

本发明的用途

本发明方法所得到的复合支架在蛋白类大分子药物的递送载体、再生医学领域具有重大的推动作用及应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例一中制备的载血管内皮细胞生长因子的明胶微球扫描电镜图。

图2 为本发明实施例一中制备的明胶/聚乳酸同轴静电纺丝的扫描电镜图。

图3为本发明实施例一中经过层层自组装后的明胶/聚乳酸同轴静电纺丝的扫描电镜图。

图4 为本发明实施例一中经过层层自组装后的明胶/聚乳酸同轴静电纺丝的激光共聚焦图。

具体实施方式

下面结合附图及以下实施例对本发明做进一步详细说明，但并不能限制本发明的内容。在本发明的构思前提下，对本发明方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实例一

步骤1 载血管内皮细胞生长因子的明胶微球（VEGF-gel）的制备

在室温下，将 200mg 明胶溶解在 20ml 去离子水中，直至得到澄清溶液。使用0.2mol/L 氢氧化钠调节溶液 pH 值至 7.0。搅拌条件下加入乙醇，直至乙醇与水的比例为65:35，梯度置换出水以形成明胶颗粒，再加入乙二醛进行交联，室温下搅拌10h。反应结束后使用 12%的焦亚硫酸钠水溶液除去乙二醛中未反应的醛基。在 14000rpm 下离心90min，将离心收集到的明胶颗粒用去离子水洗涤两次后进行冷冻干燥。为了能够负载VEGF，使明胶颗粒的羧基需要在添加 N-乙基-N`-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐(EDC，4 mg/ml)和 N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠(NHS，4 mg/mL)的 MES缓冲液(100 mM，pH 6)中活化 1h。将活化的明胶颗粒在去离子水中透析过夜后离心且冷冻干燥，再于已加入的生长因子溶液的 PBS 中溶胀 10h。冷冻干燥，收集微球。扫描电镜观察微球形貌，如附图1所示。

步骤2 负载BMP-2和VEGF-gel微球的核壳纳米纤维膜的制备

将0.2g PLLA溶解于2.5mL三氟乙醇和二氯甲烷混合溶剂中，其中三氟乙醇和二氯甲烷的体积比为1:1，磁力搅拌器搅拌过夜，使其充分溶解，得到质量分数为 8% 的均一壳纺丝溶液，并加入50mgVEGF-gel微球，使用注射器输送到外同轴针头，另外，称取明胶0.075g溶于0.5mL三氟乙醇和去离子水的混合溶剂中，其中三氟乙醇和去离子水的体积比为1:2，同样使用磁力搅拌器搅拌过夜，使其充分溶解，得到质量分数为 15% 的均一纺丝溶液备用，在静电纺丝开始前，将BMP-2 溶解于上述纺丝溶液中，得到含有10 μg/mL BMP-2的核纺丝溶液，使用另一个注射器将明胶纺丝液输送到内同轴针头，调节静电纺丝工艺参数，在 17 kV 电压下以核0.0005 mm/s，壳0.0025 mm/s的推注速度进行静电纺丝，调整接收距离为 20 cm，控制温度25℃，湿度45%，完成纳米纤维膜的制备，将制备好的纤维膜置于37℃的真空干燥箱中48h，去除残留的溶剂，备用。扫描电镜观察核壳纤维形貌，如附图2所示。

步骤3 负载酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）的核壳纤维的制备

将上述制备好的Gel-PLLA膜剪成20mm*20mm的正方形小片并用去离子水彻底清洗后备用，分别配制 1 mg/mL 的壳聚糖（CS）溶液（ph=4.5）和 10μg /mL aFGF 溶液，然后将浸润过后的Gel/PLLA薄膜浸泡在CS溶液中 15 min，然后在去离子水中清洗3次，每遍 10~30s，接着又浸泡在 aFGF 溶液中 15 min，取出清洗 3次（这样算作一层），一直重复该工作，直到达到我们所需要的层数（该操作一直在 4℃ 条件下进行）。制备好负载生长因子所需层数的纳米纤维膜（Gel-PLLA）