一种富硒油菜薹中硒形态的分析检测方法

摘要

本发明提供了一种富硒油菜薹中硒形态的分析检测方法，本发明属于成分分析技术领域。本发明提供的一种富硒油菜薹中硒形态的分析检测方法，包括如下步骤：(1)取富硒油菜薹样品，液氮研磨，得到样品粉末；(2)将所述样品粉末与蛋白酶XIV的水溶液混合，进行混合超声酶解，分离液体部分，得到提取液；(3)采用高效液相色谱‑电感耦合等离子体质谱联用法测定所述提取液中不同形态硒的含量。本发明具有操作简便、试剂用量少、提取率高、分析时间短、检出限低、稳定性好、检测准确等特点，可同时测定富硒油菜薹中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒酸盐和亚硒酸盐5种硒形态，解决和弥补了现有检测方法的不足。

说明书

技术领域

本发明涉及成分分析技术领域，尤其涉及一种富硒油菜薹中硒形态的分析检测方法。

背景技术

硒在维持人体生命健康过程中发挥重要生物学功能，开发富硒农产品，提高居民日常硒摄入量，对保障我国人民营养健康具有重要意义。富硒油菜薹为满足国民日常膳食补硒需求提供了新的重要途径，有待进一步开发利用。

富硒产品中有机硒含量的占比是评估富硒产品质量的重要指征，现行国家标准GB5009.93-2017《食品安全国家标准食品中硒的测定》及GB 5009.268-2016《食品安全国家标准食品中多元素的测定》规定了富硒食品中总硒的测定方法，但目前缺乏针对具体硒形态测定的技术标准。

对富硒产品中不同形态硒进行检测分析，首先需要建立一种可以高效，稳定的提取出富硒产品中各种硒形态的样品前处理方法。中国专利CN 112129864B公开了一种富硒植物干粉中硒形态测定的方法(公告日2022.04.01)，其主要技术思路为先利用去离子水或Tris-HCl溶液提取游离硒，然后在利用多步酶解提取结合硒。该方法不仅需要对游离硒和结合硒进行分别提取，而且还采用了多步酶解步骤，提取过程较为复杂，效率低。

此外，不同富硒样品中硒结合形式不一，表现出不同的形态种类，导致不同样品的硒提取释放方式不同，且不同样品在硒形态提取过程中产生的基质和底物不同，因此很难形成统一的样品前处理方法来提取不同样品中的硒形态。因此建立一种可以高效，稳定的提取出富硒产品中各种硒形态的样品前处理方法是必要的。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种同时测定富硒油菜薹中5种硒形态的分析检测方法，解决了富硒油菜薹中硒形态提取和检测的技术问题。

为此，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种富硒油菜薹中硒形态的分析检测方法，包括如下步骤：

(1)取富硒油菜薹样品，液氮研磨，得到样品粉末；

(2)将所述样品粉末与蛋白酶XIV的水溶液混合，进行混合超声酶解，分离液体部分，得到提取液；

(3)采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法测定所述提取液中不同形态硒的含量。

优选的，所述样品粉末的粒径为100-200目。

优选的，所述样品粉末与蛋白酶XIV的水溶液的质量体积比为1g：100-120ml。

优选的，所述所述蛋白酶XIV的水溶液中蛋白酶XIV的浓度为8-12mg/ml。

优选的，所述蛋白酶XIV的酶活力大于等于3.5units/mg；所述水为超纯水，所述超纯水的电导率大于18.2MΩ·cm。

优选的，所述蛋白酶XIV的用量为样品粉末质量的7.5-10％。

优选的，所述混合超声酶解的温度为20-25℃，所述混合超声酶解的时间为35-45min，所述超声的功率为150-180W。

优选的，所述分离液体部分的方法为离心，所述离心的转速为10000-14000rpm，时间为18-22min，温度为0-4℃。

优选的，所述高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法中高效液相色谱的条件为：

色谱柱：阴离子交换色谱柱(HamiltonPRP-X100，250×4.1mm，10μm)；

流动相：40mM磷酸氢二铵(PH＝6.0)；

流速：0-5min:0.8ml/min，5-7min:1.2ml/min，7-15min:1.5ml/min；

进样体积：30μL；

柱温：30℃。

优选的，所述不同形态硒包括硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒酸根和亚硒酸根。

本发明在恒温超声辅助下利用蛋白酶XIV的水溶液酶解提取富硒油菜薹中硒形态，该样品处理方法简便，稳定，提取率高，可在1h内提取出富硒油菜薹中不同形态硒化物。同时以磷酸氢二铵溶液为流动相，Hamilton PRP-X100分析柱为固定相，建立高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用(HPLC-ICP-MS)技术同时测定富硒油菜薹中5种硒形态的检测方法。2.HPLC-ICP-MS联用技术可在15-20min内同时对富硒油菜薹中5中形态硒化物进行定性和定量分析，检测时间短，所需试剂种类少，试剂毒性较低。

因此本发明的方法具有操作简便、试剂用量少、提取率高、分析时间短、检出限低、稳定性好、检测准确等特点，可同时测定富硒油菜薹中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒酸盐和亚硒酸盐5种硒形态，解决和弥补了现有检测方法的不足。

本发明提供了一套高效、精准的鉴定富硒油菜薹中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、亚硒酸盐和硒酸盐的技术方案，为进一步深入了解油菜的硒富集特征，从功能营养的角度开发富硒油菜产品提供技术支持。

附图说明

图1为实施例1中使用不同蛋白酶提取的富硒油菜薹中5种硒形态含量及总硒含量。

图2为实施例1中使用不同量的蛋白酶XIV提取的富硒油菜薹中5种硒形态含量及总硒含量。

图3为实施例1中不同处理时间提取的富硒油菜薹中5种硒形态含量及总硒含量。

图4为实施例1中不同样品前处理定容体积提取的富硒油菜薹中5种硒形态含量及总硒含量。

图5为实施例1中色谱条件Ⅰ分离5种形态硒的色谱图，从左到右色谱峰依次为硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、亚硒酸根(SeIV)、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒酸根(SeVI)。

图6为实施例1中色谱条件Ⅱ分离5种形态硒的色谱图，从左到右色谱峰依次为硒酸根(SeVI)、亚硒酸根(SeIV)、硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1材料：本实施例所用实验材料为外源添加无机硒进行水培生产的油菜薹样品(总硒含量大于20μg/kg，符合富硒产品的要求)。取新鲜富硒油菜薹样品，液氮保护环境下研磨，过200目筛，取筛下物，得到硒油菜薹样品粉末备用。

1.1.2试剂：硝酸(优级纯，购自国药集团化学试剂有限公司)；蛋白酶XIV生物来源为Streptomyces griseus(灰色链霉菌)，购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；甲醇(色谱级纯，购自上海安谱实验技术股份有限公司)；磷酸氢二铵(优级纯，购自上海麦克林生化科技股份有限公司)；柠檬酸及己烷磺酸钠(优级纯，购自上海安谱实验技术股份有限公司)；甲酸(优级纯，购自国药集团化学试剂有限公司)；三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，蛋白酶K，蛋白酶E，胰蛋白酶和碱性蛋白酶均购自北京索莱宝科技有限公司。

硒形态标准物质：硒酸根溶液(SeⅥ，浓度41.5μg/g，以硒计)，亚硒酸根溶液(SeⅣ，浓度42.9μg/g，以硒计)，硒代胱氨酸溶液(SeCys2，浓度44.2μg/g，以硒计)，甲基硒代半胱氨酸溶液(MeSeCys，浓度34.8μg/g，以硒计)，硒代蛋氨酸(SeMet，浓度39.4μg/g，以硒计)均购自中国计量科学研究院。

1.1.2仪器设备：高效液相色谱系统(Agilent 1260Infinity II)和电感耦合等离子体质谱仪(Agilent ICP-MS 7900)采用美国安捷伦公司产品，SBL-10DT超声波恒温清洗机购自宁波新芝生物科技有限公司，D-37520型低温高速离心机采用赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品，Milli-Q Syhthesis超纯水系统采用美国Millipore公司产品，电子天平(精确到0.0001g)和PH计(精确到0.01)采用梅特勒-托利多仪器有限公司产品，C18柱采用赛默飞世尔科技(中国)有限公司的Hypersil GoldTM aQ(250×4.6mm i.d.,5μmparticlesize)色谱柱，阴离子交换柱采用HamiltonPRP-X100(250mm×4.1mm i.d.,10μm particlesize)色谱柱，0.22μm孔径亲水PTFE滤膜购自上海安谱实验技术股份有限公司。

1.2方法及实验步骤

1.2.1建立两种液相色谱条件，所述主要工作参数见表1

表1两种液相色谱条件的主要工作参数

1.2.2电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)主要工作参数：射频功率1550W，射频电压为1.10V，采样深度为8.0-10.0mm，载气流量：0.83-1.10L/min，氦气流速为8-10ml/min，碰撞池采用HeHe模式，采集质量数为78Se，积分时间：0.5-0.8s。

1.2.3流动相的配制：准确称取5.28g磷酸氢二铵，溶于950ml超纯水中，用10％甲酸调PH至6.0，定容至1L，制成适用于液相色谱条件Ⅰ的流动相。称取1.92g柠檬酸和0.94g己烷磺酸钠，溶于950ml超纯水中，加入20ml甲醇后用10％氨水调PH至3.4，定容至1L，制成适用于液相色谱条件Ⅱ的流动相。所用流动相配制完成后经0.22μm PTFE滤膜过滤，水浴超声脱气15min，备用。

1.2.4配制硒形态标准溶液

(1)配制单形态硒标准溶液储备液：分别准确吸取0.2262ml硒代胱氨酸，0.2874ml甲基硒代半胱氨酸，0.2538ml硒代蛋氨酸，0.241ml硒酸根标准物质，0.2334ml亚硒酸根标准物质，用超纯水分别定容至10ml，制成1000μg/L的单形态硒标准溶液储备液，4℃保存备用(有效期1-2周)。

(2)配制硒形态混合标准溶液工作液：分别准确吸取1ml单形态硒标准溶液储备液到10ml容量瓶中，超纯水定容至10ml，制成100μg/L的硒形态混合标准溶液工作液，再用超纯水逐级稀释成0、1、5、10、25、50、100μg/L7个浓度级别的硒形态混合标准溶液工作液，现配现用。

1.2.5富硒油菜薹中硒形态提取方法的优化选择及结果

(1)蛋白酶类型的选择：

液氮保护环境下快速称取0.2g(精确到0.01g)同一富硒油菜薹样品粉末到带刻度的50ml离心管中，加入2ml不同类型蛋白酶溶液(10mg/ml，蛋白酶XIV，蛋白酶E，蛋白酶K，碱性蛋白酶或胰蛋白酶)，超纯水定容至20ml，25℃超声处理40min，期间每隔10min将样品摇匀一次，超声处理后的样品在4℃条件下12000rpm离心20min，取上清液过0.22μm滤膜，制成富硒油菜薹样品硒形态提取液，采用色谱条件Ⅰ上机检测提取液中5种形态硒的

(2)提取剂的选择

分别使用超纯水、30mmol Tris-HCl作提取剂，保持其他处理条件与(1)一致，利用确定的最优蛋白酶XIV超声酶解提取样品中的硒形态，并进行加标实验，比较不同提取剂对富硒油菜薹样品中硒形态提取效率的影响。结果如表2所示。

表2两种不同提取剂提取富硒油菜薹中硒形态加标实验的结果

由表2可知，使用30mmol Tris-HCl作提取剂时，SeCys2三个浓度水平的平均加标回收率只有7.09％左右，明显低于超纯水作提取剂时的74.50％，SeMet的加标回收率也明显低于超纯水作提取剂的加标回收率，而两种无机硒(SeIV和SeVI)的加标回收率均明显高于超纯水作提取剂的加标回收率，可能两种有机硒形态和无机硒形态在Tris-HCl作用下存在某种转化关系。

在国家农业行业标准《NY/T 3556-2020粮谷中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的测定液相色谱-电感耦合等离子体质谱法》中使用30mmol Tris-HCl作提取剂，利用蛋白酶XIV超声酶解提取粮谷中的硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸。本实验对其进行验证但结果并不理想，其对SeCys2三个浓度水平的平均加标回收率只有7.09％左右，因此尝试其他提取剂，最终筛选到超纯水作为酶解提取剂时提取效果最好。

(3)采用蛋白酶XIV进行酶解，以超纯水为提取剂，保持其他处理条件与(1)一致，分别考察不同蛋白酶用量、不同样品处理时间、不同样品处理体积对提取效率的影响，确立提取富硒油菜薹中硒形态的最优样品前处理条件。

①蛋白酶用量的优化选择：设置蛋白酶XIV的添加量为样品质量的：1.0、2.5、5.0、7.5和10.0％，比较不同酶质比对富硒油菜薹样品中硒形态提取效率的影响。结果如图2所示，在酶质比为7.5％时，提取液中各种硒形态含量及总硒(各形态硒含量的加和)均达到最大值，因此本发明中使用蛋白酶XIV超声酶解提取富硒油菜薹样品中硒形态时，所用酶的添加量控制在7.5-10.0％之间。

②样品处理时间的优化选择：比较不同处理时间(10、20、30、40、50和60min)对富硒油菜薹样品中硒形态提取效率的影响。结果如图3所示，在处理时间为40min时，提取液中各种硒形态含量及总硒(各形态硒含量的加和)均达到最大值，因此本发明使用蛋白酶XIV超声酶解提取富硒油菜薹样品中硒形态时，样品前处理时间控制在40-50min之间。

③样品处理体积的优化选择：比较不同定容处理体积(5、10、15、20和25ml)对富硒油菜薹样品中硒形态提取效率的影响。结果如图4所示，在处理体积为20ml时，提取液中各种硒形态含量及总硒(各形态硒含量的加和)均达到最大值，因此本案例使用蛋白酶XIV超声酶解提取富硒油菜薹样品中硒形态时，样品与样品处理体积之间的比值为1：100-120(g/ml)。

1.2.6选择适用于检测富硒油菜薹中硒形态的色谱条件

(1)分别利用表1中的两种色谱条件分离检测0、1、5、10、25、50、100μg/L 7个浓度级别的硒形态混合标准溶液工作液，绘制标准曲线，比较两种色谱条件分离检测5种硒形态的线性关系及检测限，取同一管混合标准溶液，连续测定5次，计算5次检测结果中各形态硒保留时间的RSD值，计为RSDR，5次检测结果中各形态硒峰面积的RSD值，计为RSDP，考察两种色谱条件的精密度。结果如表3所示。

表3两种色谱条件分离5种硒形态的线性方程，相关系数，检测限及精密度

如表3所示，在1-100μg/L线性范围内，两种色谱条件分离5种硒形态均具有良好的线性关系，相关系数R均大于0.999，以3倍信噪比确定所述方法的检测限，色谱条件Ⅰ的方法检测限为0.3871-1.2701μg/L，色谱条件Ⅱ的方法检测限为0.0891-0.2403μg/L。如表3所示，两种色谱条件分离检测5种硒形态的RSDR及RSDP均小于5％，说明两种色谱条件均具有良好的精密度。

同时，分析比较两种色谱条件分离检测5种硒形态的精密度，检测限以及准确性，结果如图5、6所示。如图5所示，在色谱条件Ⅰ中，5种形态硒在15min内分离完全，均能达到基线分离；如图6所示，在色谱条件Ⅱ中，5种形态硒在13min内完成分离，均能达到基线分离。

(2)称取等量的同一富硒油菜薹样品粉末，加入低，中，高3个浓度水平的标准溶液，按照统一的样品前处理方法处理样品，利用两种色谱条件分别检测加标回收结果，每个独立实验设置3次技术重复，考察两种色谱条件对检测富硒油菜薹样品中硒形态的影响，选择适用于检测富硒油菜薹中硒形态的色谱条件。结果如表4所示。

表4利用两种不同色谱条件进行加标回收实验的结果

由表4可知，3种浓度水平MeSeCys，SeIV，SeMet，SeVI以及总硒的加标回收效率在两种色谱条件下均达到80％以上，利用色谱条件Ⅰ检测SeCys2的加标回收率在74.50％左右，利用色谱条件Ⅱ检测SeCys2的加标回收率只有19.38％，因此本发明选择色谱条件Ⅰ检测富硒油菜薹中的硒形态。

1.2.7方法的稳定性及可重复性分析

取一份富硒油菜薹样品，上述优选的样品前处理方法提取样品的硒形态，利用色谱条件Ⅰ每隔1小时测定一次，重复测定5次，计算5次测定结果的RSD值，考察方法的稳定性。取同一富硒油菜薹样品，等量称取5份，每隔一段时间进行一次处理，利用色谱条件Ⅰ进行测定，计算5次测定结果的RSD值，考察方法的可重复性。结果如表5所示，

表5方法的稳定性及可重复性

如表5所示，同一样品处理后5次测定各形态硒的结果RSD值均小于10％，说明所述样品前处理方法提取富硒油菜薹中的5种硒形态在5小时内稳定性良好。相同样品的5次处理及测定结果的RSD值均小于10％，说明所述方法可重复性良好。

1.2.8方法的实际应用

取5份富硒油菜薹样品，采用上述优选的技术方法(超纯水为提取剂，采用蛋白酶XIV酶解，添加量7.5％，定容体积0.2g：20ml，处理40min，色谱条件Ⅰ)检测样品5种硒形态的含量。结果见表6，其中5种硒形态含量的加和计为总硒1，利用微波消解法测得的总硒含量计为总硒2，总硒1与总硒2的比值得出硒形态的提取效率。结果如表6所示。

其中微波消解法为：快速称取0.5g(精确到0.01g)液氮研磨的油菜薹样品粉末至石英消解管中，加入9ml硝酸和1ml高氯酸，充分混匀，室温静置过夜后进行微波消解，微波消解程序如下：30min内升温至100摄氏度，100摄氏度保持40min；15min内升温至155摄氏度，155摄氏度持续消解至消解管中剩余液体体积大约为2ml，冷却；加入2ml盐酸，10min内升温至130摄氏度，130摄氏度持续消解至消解管中剩余液体体积大约为2ml，冷却；加入超纯水定容至所需体积，0.22μm滤膜过滤，滤液引入ICP-MS检测78Se信号强度。

表6中数据得出，利用所述优选技术方法鉴定富硒油菜薹样品中硒形态，提取得率高，提取效率均大于80％。三种有机硒含量的加和与总硒2的比值得出样品中有机硒含量的占比，如表6所示，所测5份富硒油菜薹样品中有机硒占比均超过60％，可见富硒油菜薹中硒成分主要为有机硒。

表6五份富硒油菜薹样品中硒形态含量检测鉴定结果

综上，在本发明中，使用超声辅助酶法提取富硒油菜薹中的硒形态时，蛋白酶XIV具有最高的提取效率，所述提取方法中，样品前处理体系中蛋白酶用量与样品量最佳比值在7.5-10.0％之间，样品前处理体系中样品与定容体积的最优比值控制在1：100-120(g/ml)之间，样品最佳处理时间控制在40-50min之间。本实施案列发现利用HamiltonPRP-X100阴离子交换色谱柱做固定相，40mmol磷酸氢二铵溶液(PH＝6.0)为流动相构建的色谱条件更适合用来分析富硒油菜薹中的硒形态。所述方法利用ICP-MS检测78Se信号强度，5种形态硒在0-100μg/L范围内线性关系良好，精密度高，所述方法检测富硒油菜薹中5中硒形态回收率高，稳定性及可重复性良好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。