一种测定己烯雌酚的适配体-分子印迹荧光共价有机框架传感器及其制备和应用

摘要

本发明公开了一种测定己烯雌酚的适配体‑分子印迹荧光共价有机框架传感器及其制备和应用，属于生物传感技术领域。本发明以荧光共价有机框架为荧光信号和载体，以分子印迹聚合物和适配体为生物识别元件，利用两种识别元件的优点，在适配体固定己烯雌酚后通过溶胶‑凝胶法制备COFs‑Apt@MIPs。之后将待测样品与COFs‑Apt@MIPs接触后，通过DES与COFs‑Apt@MIPs之间的电荷转移导致其荧光淬灭，通过荧光光谱获得荧光信号强度，利用荧光值来实现对DES的定量检测。本发明方法具有检测成本低、稳定性好、操作简单、选择性好和效率高等优点，在复杂食品基质的各类渔药残留检测中具有巨大应用潜力。

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定己烯雌酚的适配体-分子印迹荧光共价有机框架传感器及其制备和应用，属于生物传感技术领域。

背景技术

己烯雌酚(DES)作为一种人工合成的雌激素类物质，常常被作为水产养殖产业中的雌激素调节剂使用，主要用于促进鱼类的生长发育等。由于长时间的不合理应用，DES容易残留在水产品等食品中难以降解，最终通过食物链进入人体。多项研究已证明，人类长时间接触DES会导致免疫功能失常，激素正常水平受损，甚至导致胚胎畸形等。由于其巨大的潜在危害，DES已被世界卫生组织归类为一类致癌物，在包括中国等许多国家已经被列入食品中禁止使用的药物清单中。

目前，已经开发多种检测DES的分析方法，包括液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)、高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳方法。虽然这些方法可靠、选择性和灵敏度高，但仍存在分析步骤复杂、费时费力、经济效益低等缺陷。

随着现代分析技术的快速发展，许多快速、灵敏、高效的新技术在食品农兽药残留检测领域崭露头角。生物传感是一项日益成熟的技术，可以通过探针和特定目标之间的相互作用获得相关的可测量信号，在生物传感法中，识别元件的选择和研究对于检测效果有着极大的影响。为传统识别元件的最佳替代物质，分子印迹聚合物(MIPs)具有较高的稳定性、易于合成、特异性强等优势，但是在实际应用过程中，真实样品中存在的大分子等会占据MIPs的表面空间，进而干扰结合位点对模板分子的选择性识别。而且，在MIPs合成过程中，非特异性结合同样会对影响对复杂基质的检测灵敏度，识别效果和识别准确性都会被影响。此外，现有的适配体-分子印迹检测方法往往是利用荧光纳米材料如上转换材料等作为荧光信号，结合和识别的位点少。

发明内容

[技术问题]

现有分子印迹聚合物生物传感对于复杂基质的检测效果差；且现有的适配体-分子印迹检测方法结合和识别的位点少。

[技术方案]

为了解决上述问题，本发明以荧光共价有机框架为荧光信号和载体，以分子印迹聚合物和适配体为生物识别元件，利用两种识别元件的优点，在适配体固定己烯雌酚后通过溶胶-凝胶法制备适配体-分子印迹荧光共价有机框架(COFs-Apt@MIPs)。本发明的COFs-Apt@MIPs通过适配体与分子印迹聚合物能灵敏、协同选择性测定DES。

本发明的第一个目的是提供一种制备适配体-分子印迹荧光共价有机框架(COFs-Apt@MIPs)的方法，包括如下步骤：

(1)TFPT-PDAN-COF的制备：

将2,4,6-三(4-醛基苯基)-1,3,5-三嗪、1,4-苯二乙腈和碳酸铯分散于有机溶剂中，经过液氮快速冷冻-抽真空通氮气-解冻的三次循环，加热，离心，洗涤，干燥，得到TFPT-PDAN-COF粉末；

(2)偕胺肟基修饰的TFPT-PDAN-COF-AO的制备：

将TFPT-PDAN-COF、碳酸钾和盐酸羟胺分散于有机溶剂中，混合溶液体系搅拌加热，冷却，洗涤，干燥，得到偕胺肟基修饰的TFPT-PDAN-COF-AO；之后用缓冲液分散，得到TFPT-PDAN-COF-AO的缓冲液溶液；

(3)COFs-Apt的制备：

将TFPT-PDAN-COF-AO的缓冲液溶液与Sulfo-SMCC溶液混合均匀，孵育活化，离心收集，得到活化后的TFPT-PDAN-COF-AO；之后将活化后的TFPT-PDAN-COF-AO分散在缓冲液中，再与DES适配体溶液混合孵育，震荡过夜；离心收集沉淀，洗涤，得到成功偶联适配体的COFs-Apt；之后用缓冲液分散，得到COFs-Apt的缓冲液溶液；

(4)COFs-Apt@MIPs的制备：

将COFs-Apt的缓冲液溶液与DES混合孵育，用水分散；再加入APTES搅拌进行预聚合，随后加入TEOS和NH

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的1,4-苯二乙腈和2,4,6-三(4-醛基苯基)-1,3,5-三嗪的质量比为1：(1.5-1.7)，进一步优选为1：1.6；2,4,6-三(4-醛基苯基)-1,3,5-三嗪和碳酸铯的质量比为1：(4-6)，进一步优选1：5。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的有机溶剂为1,4-二氧六环，2,4,6-三(4-醛基苯基)-1,3,5-三嗪和有机溶剂的用量比为(24-26)mg：2mL。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的加热是110-120℃下加热92-96h，进一步优选为120℃下加热72h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的干燥是真空干燥，具体是在60-120℃下进行真空干燥。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的TFPT-PDAN-COF、碳酸钾和盐酸羟胺的质量比为1：(2.5-3)：(2-14)。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的有机溶剂为无水甲醇，TFPT-PDAN-COF和有机溶剂的用量比为1mg：(1-2)mL。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的加热是60-80℃下加热12-24h，进一步优选为80℃下加热24h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的洗涤是采用水洗涤数次；干燥是真空干燥，温度为75-85℃。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的缓冲液是HEPES缓冲液，浓度为10mmol/L，pH＝7.2。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的TFPT-PDAN-COF-AO的缓冲液溶液中TFPT-PDAN-COF-AO和缓冲液的用量比为1mg：(1-2)mL。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中Sulfo-SMCC溶液的浓度为1-4mg/mL，进一步优选为2mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中TFPT-PDAN-COF-AO的缓冲液溶液、Sulfo-SMCC溶液和DES适配体溶液的体积比为7：3：0.6-1.4。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中DES适配体溶液的浓度为1.5-2.5nmol。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述的孵育活化是15-37℃下孵育活化2h，进一步优选为25℃下孵育活化2h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中DES适配体的序列为5’-GGCGATGGGGTAGGGGGTGTGGAGGGGCCGGACGGAGGGG-3’。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述的缓冲液是HEPES缓冲液，浓度为10mmol/L，pH＝7.2。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述的COFs-Apt的缓冲液溶液与DES的用量比为1mL：(4-6)mg。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述的混合孵育是25℃下孵育0.5-2h，进一步优选为1h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述的DES和APTES、TEOS、NH

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述的预聚合是在25℃下搅拌5h；密封搅拌是搅拌12h；洗涤是采用甲醇/乙酸混合液(9:1，v/v)洗涤沉淀数次，并用甲醇洗去多余乙酸，从而彻底去除模板分子。

本发明的第二个目的是本发明所述的方法制备得到的COFs-Apt@MIPs。

本发明的第三个目的是提供一种检测己烯雌酚(DES)的方法，所述的方法采用了本发明所述的COFs-Apt@MIPs。

在本发明的一种实施方式中，所述的检测己烯雌酚(DES)的方法是将待测样品与COFs-Apt@MIPs接触后，通过DES与COFs-Apt@MIPs之间的电荷转移导致其荧光淬灭，通过荧光光谱获得荧光信号强度，利用荧光值来实现对DES的定量检测；

具体包括如下步骤：

(1)待测样品处理：

在待测样品匀浆中加入乙腈-丙酮溶液振荡，离心收集上清液，氮气吹干后加入三氯甲烷复溶；再通过加入NaOH溶液继续振荡后离心；然后加入磷酸溶液，振荡；随后萃取、振荡离心，分离上层有机相；最后将收集到的残渣复溶，得到处理之后的待测样品；

(2)检测：

将处理之后的待测样品在25℃下孵育30min后，在激发波长为365nm下测定发射波长范围为400-700nm的荧光光谱，得到540nm处的荧光强度；

(3)计算己烯雌酚(DES)含量或浓度：

将540nm处的荧光强度代入到标准工作曲线中，计算得到待测样品中DES的浓度。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中标准工作曲线的制作方法为：

向1m 1mg/L LCOFs-Apt@MIPs乙醇溶液中加入1mL含不同浓度(具体为0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6mg/L)DES溶液，25℃下孵育30min后，在激发波长为365nm下测定发射波长范围为400-700nm的荧光光谱，以540nm处的荧光强度和DES浓度绘制标准工作曲线；

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中待测样品、乙腈-丙酮溶液、三氯甲烷、NaOH溶液、磷酸溶液的用量比为2g：6mL：0.5mL：2mL：200μL；乙腈-丙酮溶液中V

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的待测样品为水产品，包括市售鲫鱼等。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述的标准工作曲线为F

[有益效果]

(1)本发明所述的荧光共价有机框架(TFPT-PDAN-COF)通过Knoevenagel缩合反应合成，sp

(2)本发明所述的偕胺肟基修饰的TFPT-PDAN-COF-AO含有大量氨基，可以提供适配体的偶联位点。

(3)本发明所述的COFs-Apt@MIPs中分子印迹聚合物能够为适配体提供保护层，适配体能够减少分子印迹聚合物的非特异性识别，进而通过适配体与分子印迹聚合物协同识别DES。

(4)本发明所述的检测己烯雌酚(DES)的方法以荧光共价有机框架作为荧光信号，采用荧光淬灭法检测DES；具有操作方便、高选择性等优点，共存的禁用渔药、重金属离子和结构类似物不干扰测定；克服了高效液相色谱法等仪器法费时、价格昂贵等不足。

附图说明

图1为TFPT-PDAN-COF(A)与TFPT-PDAN-COF-AO(B)的SEM图像。

图2为不同时间(A)、pH值(B)和温度(C)下TFPT-PDAN-COF-AO的荧光强度。

图3为COFs-Apt@NIPs的SEM图像。

图4为COFs-Apt@MIPs合成条件的优化；其中A是TFPT-PDAN-COF-AO添加量的优化；B是DES适配体溶液的用量的优化；C是交联剂TEOS的添加量的优化。

图5为COFs-Apt@MIPs对DES检测可行性验证。

图6为与不同浓度DES孵育后COFs-Apt@MIPs的荧光光谱(A)；相对荧光强度与DES浓度之间的线性曲线(B)；与不同浓度DES孵育后COFs-Apt@NIPs的荧光光谱(C)。

图7为COFs-Apt@MIPs的重复利用性能。

图8为COFs-Apt@MIPs的特异性分析；其中A是单一结构类似物对于COFs-Apt@MIPs的影响；B是结构类似物和DES同时存在对于COFs-Apt@MIPs的影响；C是金属离子对于COFs-Apt@MIPs的影响；D是其他渔药对于COFs-Apt@MIPs的影响。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

实施例中的溶液未具体提及溶剂的都是以水为溶剂。

实施例中采用的DES适配体的序列为5’-GGCGATGGGGTAGGGGGTGTGGAGGGGCCGGACGGAGGGG-3’。

实施例1

一种制备适配体-分子印迹荧光共价有机框架(COFs-Apt@MIPs)的方法，包括如下步骤：

(1)荧光共价有机框架(TFPT-PDAN-COF)的制备：

准确称取25.58mg 2,4,6-三(4-醛基苯基)-1,3,5-三嗪和15.99mg 1,4-苯二乙腈于25mL的厚壁反应管中，随后加入2mL 1,4-二氧六环和127.90mg碳酸铯，进行超声混合均匀，得到混合溶液；之后将混合溶液经过液氮快速冷冻-抽真空通氮气-解冻的三次循环，脱除反应体系中的氧气和水分后氮气密封；待反应管恢复至室温后，在120℃下加热72h；反应结束后，离心得到黄色沉淀，并依次用四氢呋喃和水洗涤数次，最终在80℃真空干燥箱中过夜，得到具有明亮荧光的黄色粉末，即：TFPT-PDAN-COF粉末；

(2)荧光共价有机框架的偕胺肟基后修饰(TFPT-PDAN-COF-AO)的制备：

称取50mg TFPT-PDAN-COF于100mL的圆底烧瓶中，向其中依次加入138.2mg碳酸钾和694.90mg盐酸羟胺，最后加入50mL无水甲醇，超声处理均匀分散，得到混合溶液；将混合溶液在80℃下搅拌24h，冷却至室温后，通过超纯水洗涤数次，最终在80℃真空干燥箱中过夜获得偕胺肟基修饰的TFPT-PDAN-COF-AO；之后将1mg干燥后的TFPT-PDAN-COF-AO分散溶解于1mL HEPES缓冲液中(10mmol/L，pH＝7.2)，得到TFPT-PDAN-COF-AO的缓冲液溶液，备用。

(3)后修饰荧光共价有机框架的适配体偶联(COFs-Apt)的制备：

将700μL TFPT-PDAN-COF-AO的缓冲液溶液(1.5mg TFPT-PDAN-COF-AO)与300μL浓度为2mg/mL的Sulfo-SMCC溶液混合均匀，在25℃的摇床上孵育活化2h，在10000r/min下离心10min，收集被活化的TFPT-PDAN-COF-AO；通过HEPES缓冲液洗涤沉淀数次来洗脱多余的Sulfo-SMCC，最终在1mL HEPES缓冲液中重新分散；之后在活化后的TFPT-PDAN-COF-AO的缓冲液中加入100μL浓度为2nmol的DES适配体溶液，在25℃下孵育，震荡过夜；离心收集沉淀，用超纯水多次洗涤沉淀以去除未能偶联的适配体，得到成功偶联适配体的COFs-Apt；之后用1mL缓冲液分散，得到COFs-Apt的缓冲液溶液；

(4)COFs-Apt@MIPs的制备：

将1mL COFs-Apt的缓冲液溶液与5.4mg DES在摇床中25℃孵育1h进行DES的捕获；之后将体系转移至25mL圆底烧瓶中，并用5mL超纯水分散，加入23μL APTES在25℃下搅拌5h进行预聚合；随后向上述混合溶液中加入40μL TEOS和50μL NH

将得到的TFPT-PDAN-COF、TFPT-PDAN-COF-AO、COFs-Apt和COFs-Apt@MIPs进行性能测试，测试结果如下：

①荧光共价有机框架(TFPT-PDAN-COF)的制备和后修饰表征

图1为TFPT-PDAN-COF(A)与TFPT-PDAN-COF-AO(B)的SEM图像。从图1可以看出：TFPT-PDAN-COF在2μm标尺下观察其清晰表面形貌是由许多较粗的条状结构排列组成的，在粗条之间均具有空隙；TFPT-PDAN-COF-AO与TFPT-PDAN-COF相比表面形态并未出现较大的变化，证明合成后修饰对COFs框架的形态和完整性无负面影响，孔隙率也能够得到较好的保持。通过FT-IR光谱对TFPT-PDAN-COF和TFPT-PDAN-COF-AO的相关特征官能团进行了表征。对比单体与TFPT-PDAN-COF之间官能团的变化，能够进一步印证TFPT-PDAN-COF的成功合成。与TFPT相比，TFPT-PDAN-COF中2731cm

图2为不同时间(A)、pH值(B)和温度(C)下TFPT-PDAN-COF-AO的荧光强度。从图2可以看出：TFPT-PDAN-COF-AO在不同时间、pH和温度下的荧光强度稳定。

②后修饰荧光共价有机框架的适配体功能化表征

通过紫外可见光分光光度计进行了相关实验的表征。在TFPT-PDAN-COF-AO与DES适配体孵育后，收集反应后的上清测定紫外可见吸收光谱，并通过同浓度的适配体进行对照比较。DES适配体在254nm处有一个明显的紫外可见吸收峰，而TFPT-PDAN-COF-AO与适配体反应后的上清液中未出现明显的DES适配体特征峰。

③COFs-Apt@MIPs的制备表征

图3为COFs-Apt@NIPs的SEM图像。从图3可以看出：印迹层能够均匀地包覆COFs-Apt形成明显的硅球状结构。COFs-Apt@MIPs和COFs-Apt@NIPs的FT-IR光谱类似，并且均出现分子印迹层的特征峰如1028cm

实施例2

COFs的添加量、适配体的添加量和MIPs的厚度都会对COFs-Apt@MIPs的荧光传感检测效果造成影响，因此分别从这三部分对COFs-Apt@MIPs的合成条件进行优化。荧光材料的本体荧光强度值(F)以及与目标物反应前后的荧光淬灭效率(F

(1)调整TFPT-PDAN-COF-AO的添加量：

调整实施例1步骤(2)的TFPT-PDAN-COF-AO的缓冲液溶液中TFPT-PDAN-COF-AO的添加量为0.20mg-2.00mg，其他和实施例1保持一致，制备得到COFs-Apt@MIPs。

之后将得到的COFs-Apt@MIPs和DES进行混合，使得DES的终浓度为10mg/L，在25℃下孵育2h，测试孵育前后的荧光强度。

结果如图4中A所示。

从图4中A可以看出：TFPT-PDAN-COF-AO添加量在1.50mg以下时，COFs-Apt@MIPs的原始强度随着TP-COF-AO添加量的增加而升高。当TFPT-PDAN-COF-AO添加量超过1.5mg后，荧光淬灭效果开始降低。因此，TFPT-PDAN-COF-AO的最适添加量为1.5mg。

(2)调整DES适配体的添加量：

调整实施例1步骤(3)的DES适配体溶液的用量为60、80、100、120和140μL，其他和实施例1保持一致，制备得到COFs-Apt@MIPs。

之后将得到的COFs-Apt@MIPs和DES进行混合，使得DES的终浓度为10mg/L，在25℃下孵育2h，测试孵育前后的荧光强度。

结果如图4中B所示。

从图4中B可以看出：随着适配体添加量的增高，荧光淬灭效果先升高后降低，荧光响应效果最好的适配体添加量为100μL。

(3)调整交联剂TEOS的添加量

调整实施例1步骤(4)的交联剂TEOS的添加量为10μL-60μL，其他和实施例1保持一致，制备得到COFs-Apt@MIPs。

之后将得到的COFs-Apt@MIPs和DES进行混合，使得DES的终浓度为10mg/L，在25℃下孵育2h，测试孵育前后的荧光强度。

结果如图4中C所示。

从图4中C可以看出：TEOS添加量的增加会导致COFs-Apt@MIPs荧光强度逐渐降低。且，COFs-Apt@MIPs的荧光淬灭效率随TEOS添加量的增加呈现先升高后下降的趋势。因此，TEOS的最适添加量为40μL。

对比例1

省略实施例1步骤(4)中DES的添加，其他和实施例1保持一致，得到没有分子印迹的COFs-Apt@NIPs。

对比例2

省略实施例1步骤(3)中DES适配体溶液的添加，其他和实施例1保持一致，得到没有适配体的COFs@MIPs。

实施例3传感器的检测性能

COFs-Apt@MIPs的荧光传感性能是基于分子印迹层和适配体对DES的协同识别作用来实现的。

(1)分子印迹与适配体

为了验证COFs-Apt@MIPs的荧光传感性能，将实施例1、对比例1、对比例2的传感器与DES进行混合，使得DES的终浓度为10mg/L，在25℃下孵育2h，比较三者的荧光信号变化情况。

结果如图5。

从图5可以看出：COFs-Apt@MIPs与COFs-Apt@NIPs在未与DES孵育时荧光强度相近，当两种传感器分别与DES孵育一定时间后，COFs-Apt@MIPs的荧光相较COFs-Apt@NIPs有着显著的降低。这说明COFs-Apt@MIPs在适配体和MIPs的协同作用下，能够达到最佳识别传感性能。而COFs-Apt@NIPs虽然有DES的适配体的存在，但由于NIPs是在无模板分子存在的情况下聚合形成的非印迹层，会阻碍DES通过硅层，进而难以与适配体结合。因此，MIPs的成功合成是实现选择性识别检测的重要条件。

(2)检测的DES浓度

向1mL 1mg/mL的适配体-分子印迹荧光共价有机框架(COFs-Apt@MIPs)乙醇溶液中加入1mL不同浓度(0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6mg/L)DES溶液，孵育30min后，在激发波长为365nm下测定发射波长为540nm处的荧光强度。

同时采用COFs-Apt@NIPs作为对比。

如图6所示。

从图6可以看出：随着DES浓度的升高，COFs-Apt@MIPs荧光强度随之降低，而由于COFs-Apt@NIPs缺少能够特异性识别DES的位点，其荧光强度对DES的浓度变化并不敏感。对于最终浓度范围为0.4mg/L-25.6mg/L的DES，DES的含量与COFs-Apt@MIPs的相对荧光强度(F

通过与已报道的DES检测方法比较，本发明所构建的COFs-Apt@MIPs荧光传感器有着相对较宽的线性范围和较低的检测限。

(3)重复利用性能

将实施例1的传感器COFs-Apt@MIPs经过5次吸附-洗脱循环使用。

结果如图7。

从图7可以看出：经过5次吸附-洗脱循环使用，COFs-Apt@MIPs荧光强度较初始值略有下降，但是对于DES的荧光信号响应依旧保持着较好的效果。证明COFs-Apt@MIPs在吸附-洗脱-再吸附的过程中，印迹位点能够基本保持住原有的性能，适配体也在COFs和印迹层的双重保护下维持较好的高亲和力，此结果显示所构建的COFs-Apt@MIPs荧光传感器具有多次重复使用的潜力。

(4)特异性识别能力

以结构类似物作为干扰物，考察了壬基酚(NP)、雌二醇(E2)、双酚A(BPA)和己烷雌酚(HEX)四种物质对COFs-Apt@MIPs和COFs-Apt@NIPs荧光淬灭情况。

向1mL 1mg/mL的适配体-分子印迹荧光共价有机框架(COFs-Apt@MIPs)乙醇溶液中分别加入1mL 5mg/L壬基酚(NP)、雌二醇(E2)、双酚A(BPA)和己烷雌酚(HEX)溶液，25℃下孵育30min后，在激发波长为365nm下测定发射波长为540nm处的荧光强度。

同时采用COFs-Apt@NIPs作为对比。

结果如图8中A。

从图8中A可以看出：DES的结构类似物对于COFs-Apt@MIPs和COFs-Apt@NIPs的荧光淬灭效果非常接近，并且均呈现微弱的荧光强度变化。但是，DES对于COFs-Apt@NIPs的荧光淬灭效果与其他物质类似，进而证明COFs-Apt@NIPs的非特异性识别性质。

由于实际待测样本中经常多种物质共存，因此进一步考察了结构类似物与DES同时存在时对COFs-Apt@MIPs和COFs-Apt@NIPs的竞争结合实验。

向1mL 1mg/mL的适配体-分子印迹荧光共价有机框架(COFs-Apt@MIPs)乙醇溶液中分别加入1mL 5mg/L壬基酚(NP)、雌二醇(E2)、双酚A(BPA)和己烷雌酚(HEX)溶液，随后分别再加入DES，使得DES的终浓度为10mg/L，25℃下孵育30min后，在激发波长为365nm下测定发射波长为540nm处的荧光强度。

结果如图8中B。

从图8中B可以看出：在仅有DES存在时，COFs-Apt@MIPs呈现出良好的荧光传感性能，在后续加入干扰物和DES同时存在时，并未对COFs-Apt@MIPs的荧光信号变化造成影响，证明在混合体系中COFs-Apt@MIPs仍能保持其特异性识别的信号响应能力。

随后，还针对水产品中可能存在的其他渔药和金属离子对COFs-Apt@MIPs检测性能的影响进行了探究，

向1mL 1mg/mL的适配体-分子印迹荧光共价有机框架(COFs-Apt@MIPs)乙醇溶液中分别加入1mL 5mg/L的土霉素(OXY)、恩诺沙星(ENR)、磺胺二甲基嘧啶(SM

如图8中C和D所示。

从图8中C和D可以看出：COFs-Apt@MIPs的相对荧光强度证明了其并未受此类物质存在的影响。

上述结果能够充分证明COFs-Apt@MIPs双识别元件的优异的抗干扰能力。

实施例4加标回收

为探究COFs-Apt@MIPs的实际应用潜力，对市场购买的鱼肉样本进行了加标回收实验。

从当地超市中购买鲫鱼，剪碎后用组织匀浆机均质，得到匀浆样本；

向2±0.05g匀浆样本中分别加入1mL不同浓度(具体为0.5、1和10mg/L)的DES溶液。随后，通过6mL乙腈-丙酮溶液(两者比例为V

随后通过加入2mL NaOH溶液(2mol/L)继续振荡30s后离心；加入200μL磷酸溶液(6mol/L)至上清液中，振荡5s。

随后利用乙腈进行萃取处理，通过加入乙腈后振荡2min，在室温下离心10min，分离上层有机相，在60℃的水浴下用氮气吹干，得到处理之后的待测样品；收集到的残渣用乙腈复溶后，储存备用。

将得处理之后的待测样品和购买的鱼肉直接利用商品化ELISA试剂盒和实施例1的COFs-Apt@MIPs对其中的DES进行测试；其中COFs-Apt@MIPs的测试条件为：25℃下孵育30min后，在激发波长为365nm下测定发射波长范围为400-700nm的荧光光谱，得到540nm处的荧光强度；将荧光强度带入实施例3第(3)部分的标准曲线F

结果如下：

COFs-Apt@MIPs测定DES的回收率范围为98.68％-101.97％，相对标准偏差(RSD)均在3.05％以下。

ELISA 实验结果与本发明的测定结果接近，进一步证明了本发明方法测定结果的可靠性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。