一种基于网络药理学及高分辨质谱分析中药复方疏肝健脾方潜在药效物质基础的方法

摘要

本申请提出了一种基于网络药理学及高分辨质谱分析中药复方疏肝健脾方潜在药效物质基础的方法，涉及系统生物信息学技术领域。采用高分辨质谱分析疏肝健脾复方制剂的成分并进行网络预测后，对药效成分筛选作用靶点蛋白，同时对乳腺癌疾病相关靶点进行筛选，之后对药物靶点和疾病靶点取交集构建靶点‑疾病靶点网络并筛选核心治疗靶点，对核心治疗靶点基因富集分析可视化构建靶点‑生物过程/信号通路图形，对核心治疗靶点进行临床重要性验证，最后构建出化合物‑靶点‑通路‑疾病网络图。以高分辨质谱成分分析为基础，通过结合与网络药理学相关的多个数据库，预测了疏肝健脾方的药效化合物，并阐明了他们在乳腺癌发生发展中具有的调控潜力。

说明书

技术领域

本申请涉及系统生物信息学技术领域，具体而言，涉及一种基于网络药理学及高分辨质谱分析中药复方疏肝健脾方潜在药效物质基础的方法。

背景技术

2020年全球癌症报告数据显示，占据女性癌症新发病例数1/4和死亡病例数1/6的乳腺癌已经超过肺癌成为全球最常见的恶性肿瘤。临床上，乳腺癌患者多伴有抑郁、焦虑等情绪异常表现，经过长时间的放化疗，耗损正气，损伤脾胃，此外，还常伴有纳呆、食少、乏力等一派脾气亏虚之像，乳腺癌临证实践中多注重疏肝的同时往往兼顾健脾，正如东汉·张仲景《金匮要略》所言“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”。因此，肝郁脾虚是乳腺癌临床主要证候特征之一，而国内众多医家通过应用疏肝健脾为主的治则治疗乳腺癌也取得了良好效果。但是中药往往具有药效成分复杂的特点，采用的是多靶点、多途径调控的药理特性，用传统的“单药单靶”的研究模式难以明确中药的药效物质基础并无法充分解释其药理作用。目前缺少一种能够系统反应疏肝健脾类药物在针对乳腺癌疾病治疗所起效的药物有效成分以及作用机制的方法。

发明内容

本申请的目的在于提供一种基于网络药理学及高分辨质谱分析中药复方疏肝健脾方潜在药效物质基础的方法，此方法以高分辨质谱成分分析为基础，通过结合与网络药理学相关的多个数据库，经过大数据分析，在乳腺癌背景下对可能具有潜在治疗功能的疏肝健脾方的药效化合物靶点进行系统筛查，发现了在乳腺癌中的TP53、AKT1、EGFR、MYC、CTNNB1等关键靶点，预测了疏肝健脾方的药效化合物，并阐明了他们在乳腺癌发生发展中具有的调控潜力。

本申请解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本申请实施例提供一种基于网络药理学及高分辨质谱分析中药复方疏肝健脾方潜在药效物质基础的方法，其包括以下步骤：

S1采用高分辨质谱分析疏肝健脾复方制剂的成分并进行网络预测：对疏肝健脾复方制剂进行质谱分析后，通过质谱谱库匹配，筛选收集高匹配度化合物，同时通过SwissADME数据库以类药性和肠胃吸收度为指标筛选化合物；

S2药效成分作用靶点筛选：将符合S1筛选条件的化合物名称依次导入SwissTarget Prediction数据库中预测化合物的作用靶点蛋白，合并后剔除重复的靶点蛋白，将整理后的靶蛋白名称通过Uniport数据库转化成标准基因名称，通过Cytoscape软件构建“化合物-靶点”网络图；

S3乳腺癌疾病相关靶点筛选：在疾病靶标数据库检索查找乳腺癌候选靶点，通过GEO数据库，选取并保存合适样本表达数据，通过R语言limma包与WGCNA包分别获得乳腺癌差异表达基因与关键基因，然后两者取交集作为乳腺癌相关靶点，然后与GeneCard所筛选出靶点进行合并，去重后最终获得乳腺癌疾病靶点；

S4构建成分靶点-疾病靶点网络并筛选核心靶点：将S2得到的药物靶点与S3得到的疾病靶点取交集，获得疏肝健脾方潜在药效化合物针对乳腺癌的治疗靶点，经DisGeNet数据库查询确定其基因属性后，导入至String数据库中搜索，设置物种定义为“Homosapiens”，其置信度定义为0.4，以TSV数据形式保存PPI数据，剔除游离的干扰蛋白信息，经Cytoscape软件处理，得到蛋白互作图，并通过计算度中心性、中间中心性、密切中心性、特征向量中心性和基于局部平均连接度方法这几个拓扑参数，利用Cytoscape插件CytoNCA筛选出枢纽基因，即核心治疗靶点；

S5对核心靶点基因富集分析并可视化构建“靶点-生物过程/信号通路”图形：对核心治疗靶点进行GO生物学功能注释和KEGG通路富集分析，以P<0.05作为筛选条件，分别筛选GO与KEGG各自的前十位，制作出反映两者与其涉及基因的对应关系的表格，以R包ggplot2和ggalluvial进行映射关系的可视化展示，构建“靶点-生物过程/信号通路”的可视化图形；

S6核心靶点的临床重要性验证：将筛选的代表性前五位核心靶点输入至GEPIA与Kaplan Meier plotter数据库，获得核心靶点在乳腺癌与正常组织表达量对比、在乳腺癌不同阶段表达量对比以及对乳腺癌患者总体生存预后评估的临床信息；

S7化合物-靶点-通路-疾病网络图建立：将化合物-靶点网络与核心治疗靶点PPI网络、基因-通路网络进行合并，建立化合物-靶点-通路-疾病网络，筛选出疏肝健脾方中起主要治疗作用的药效物质成分。

相对于现有技术，本申请的实施例至少具有如下优点或有益效果：

1、本申请提供的一种基于网络药理学及高分辨质谱分析中药复方疏肝健脾方潜在药效物质基础的方法，以高分辨质谱成分分析技术加持网络药理学预测的研究模式弥补了用传统的“单药单靶”的研究模式难以明确中药的药效物质基础并无法充分解释其药理作用的问题，可客观全面的分析中药的化学成分组成，并针对潜在的药效化合物，从药物相关分子、网络、信号通路等多层次，通过对药物相关分子进行网络构建、核心靶点筛选、功能富集分析等技术手段，从药物多靶点、多途径的特点着手进行探索，预测中药主要药理活性成分，阐释药效物质基础可能的药理作用机制，此方向性的指引作用，能够节省大量人力、财力、时间等成本，减少研发风险，可以实现对中药资源进行更加合理的利用。

2、本申请利用网络药理学技术首次构建了中药复方疏肝健脾方抗乳腺癌的“药物-成分-靶点-疾病”网络图，揭示了该复方通过“多靶点、多通路、多途径”联合调控发挥其药效，其中疏肝健脾方的主要药效活性成分有：

1,5-dimethyl-N-(4-morpholinobenzyl)-1H-pyrazole-3-carboxamide；

3-[(2-phenyl-1H-imidazol-4-yl)methylene]-1,3-dihydro-2H-indol-2-one；3-(tert-Butyl)-N-[4-(2,3-dihydroimidazo[2,1-b][1,3]thiazol-6-yl)phenyl]-1-meth yl-1H-pyrazole-5-carboxamide。

3、本申请通过构建成分靶点-疾病靶点网络发现了中药复方疏肝健脾方抵抗乳腺癌是通过TP53、AKT1、MYC、CTNNB1、EGFR等关键治疗靶点，以调控癌症中的蛋白多糖、脂质和动脉粥样硬化、内分泌抵抗和晚期糖基化终产物及其受体信号通路为主发挥作用，这为阐明疏肝健脾方抗乳腺癌的药效物质基础研究提供了新途径，为进一步使用该方用于乳腺癌的防治提供了前期研究基础。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本申请实施例化合物-靶点网络图；

图2为本申请实施例乳腺癌疾病靶点与药物靶点交集的维恩图；

图3为本申请实施例核心靶点筛选过程示意图；

图4为本申请实施例核心靶点属性比例图；

图5为本申请实施例核心靶点度值排序示意图；

图6为本申请实施例核心靶点临床验证结果图；

图7为本申请实施例GO注释中生物学过程代表性排名前十条目；

图8为本申请实施例KEGG富集分析前二十位条目；

图9为本申请实施例基因-生物学过程/信号通路示意图；

图10为本申请实施例化合物-靶点-信号通路-疾病网络图。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本申请。

本申请实施例提供一种基于网络药理学及高分辨质谱分析中药复方疏肝健脾方潜在药效物质基础的方法，其包括以下步骤：

S1采用高分辨质谱分析疏肝健脾复方制剂的成分并进行网络预测：对疏肝健脾复方制剂进行质谱分析后，通过质谱谱库匹配，筛选收集高匹配度化合物，同时通过SwissADME数据库以类药性和肠胃吸收度为指标筛选化合物；

S2药效成分作用靶点筛选：将符合S1筛选条件的化合物名称依次导入SwissTarget Prediction数据库中预测化合物的作用靶点蛋白，合并后剔除重复的靶点蛋白，将整理后的靶蛋白名称通过Uniport数据库转化成标准基因名称，通过Cytoscape软件构建“化合物-靶点”网络图；

S3乳腺癌疾病相关靶点筛选：在疾病靶标数据库检索查找乳腺癌候选靶点，通过GEO数据库，选取并保存合适样本表达数据，通过R语言limma包与WGCNA包分别获得乳腺癌差异表达基因与关键基因，然后两者取交集作为乳腺癌相关靶点，然后与GeneCard所筛选出靶点进行合并，去重后最终获得乳腺癌疾病靶点；

S4构建成分靶点-疾病靶点网络并筛选核心治疗靶点：将S2得到的药物靶点与S3得到的疾病靶点取交集，获得疏肝健脾方潜在药效化合物针对乳腺癌的治疗靶点，经DisGeNet数据库查询确定其基因属性后，导入至String数据库中搜索，设置物种定义为“Homo sapiens”，其置信度定义为0.4，以TSV数据形式保存PPI数据，剔除游离的干扰蛋白信息，经Cytoscape软件处理，得到蛋白互作图，并通过计算度中心性、中间中心性、密切中心性、特征向量中心性和基于局部平均连接度方法这几个拓扑参数，利用Cytoscape插件CytoNCA筛选出枢纽基因，即核心治疗靶点；

S5对核心靶点基因富集分析并可视化构建“靶点-生物过程/信号通路”图形：对核心治疗靶点进行GO生物学功能注释和KEGG通路富集分析，以P<0.05作为筛选条件，分别筛选GO与KEGG各自的前十位，制作出反映两者与其涉及基因的对应关系的表格，以R包ggplot2和ggalluvial进行映射关系的可视化展示，构建“靶点-生物过程/信号通路”的可视化图形；

S6核心靶点的临床重要性验证：将筛选的代表性前五位核心靶点输入至GEPIA与Kaplan Meier plotter数据库，获得核心靶点在乳腺癌与正常组织表达量对比、在乳腺癌不同阶段表达量对比以及对乳腺癌患者总体生存预后评估的临床信息；

S7化合物-靶点-通路-疾病网络图建立：将化合物-靶点网络与核心治疗靶点PPI网络、基因-通路网络进行合并，建立化合物-靶点-通路-疾病网络，筛选出疏肝健脾方中起主要治疗作用的药效物质成分。

本申请提供的一种基于网络药理学及高分辨质谱分析中药复方疏肝健脾方潜在药效物质基础的方法，以高分辨质谱成分分析技术加持网络药理学预测的研究模式弥补了用传统的“单药单靶”的研究模式难以明确中药的药效物质基础并无法充分解释其药理作用的问题，可客观全面的分析中药的化学成分组成，并针对潜在的药效化合物，从药物相关分子、网络、信号通路等多层次，通过对药物相关分子进行网络构建、核心靶点筛选、功能富集分析等技术手段，从药物多靶点、多途径的特点着手进行探索，预测中药主要药理活性成分，阐释药效物质基础可能的药理作用机制，此方向性的指引作用，节省大量人力、财力、时间等成本，减少研发风险，可以实现对中药资源进行更加合理的利用。

在本申请的一些实施例中，上述S1中将高分辨质谱数据经m/z cloud best match打分，以70.0分为阈值筛选收集高匹配度化合物，经Swiss ADME筛选，其中以类药性和肠胃吸收度两项指标来进行判断，两项或两项以上为Yes的化合物判定为符合标准。

采用以上指标可以对化合物进行筛选可以保证后续预测的准确性。

在本申请的一些实施例中，上述S4中核心靶点筛选范围的所有拓扑参数属性值均大于平均值。

通过将核心靶点筛选范围的所有拓扑参数属性值设定为均大于平均值能够筛选出PPI网络中的关键基因。

以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例

本实施例提供一种基于网络药理学及高分辨质谱分析中药复方疏肝健脾方潜在药效物质基础的方法。

(1)中药复方疏肝健脾方化学成分的高分辨质谱分析

色谱柱Welch(AQ-C18，150×2.1mm，1.8μm)；流动相为0.1％甲酸/水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0-30min，流动相A5％-98％)，条件如下所示：流速0.30mL/min；质谱条件扫描范围100.0-1500.0m/z；电喷雾电离源(ESI)；正负离子切换扫描；以Full mass/dd-MS2为检测方式；分辨率70000(full mass)，17500(dd-MS2)；柱温35℃；进样量5.00μL。按照以上条件对疏肝健脾方颗粒剂进行高分辨质谱分析，结合化合物匹配软件，将高分辨质谱数据通过CD2.1(Thermo Fisher)完成数据初步整理后进行数据库检索比对(mzCloud)，经m/zcloud best match打分≥70.0分后筛选收集高匹配度化合物，经Swiss ADME进行Pharmacokinetics(GI absorption-High)及Druglikeness(两项或两项以上为Yes)筛选得到符合类药性和肠胃吸收度要求的化合物，共计199个。

(2)药物作用靶点筛选

将满足(1)条件的化合物依次导入到Swiss Target Predictionr数据库，预测作用靶点，经重复数据删除及矫正后得到182个有对应靶点的活性成分，将整理后的靶蛋白名称通过Uniport数据库转化成标准基因名称，通过Cytoscape软件构建“化合物-靶点”网络图，如图1所示。

(3)乳腺癌候选靶点识别

以“Breast cancer”为关键词，应用GeneCard数据库查相关疾病靶点，其中Genecard数据库筛选条件为：Relevance score＞10。然后，通过GEO数据库，选取并保存合适样本表达数据，通过R语言limma包与WGCNA包分别获得乳腺癌差异表达基因与关键基因，然后两者取交集作为乳腺癌相关靶点，然后与GeneCard所筛选出靶点进行合并，去重后最终获得乳腺癌疾病靶点。其中，通过GeneCard数据库共筛查整理出879个与乳腺癌相关非重复行靶点，通过生信工具映射处理得到成分-疾病交集靶点217个。

(4)构建药效化合物靶点-乳腺癌靶点网络及筛选核心靶点

将步骤(2)得到的药物靶点与步骤(3)得到的疾病靶点取交集获得疏肝健脾方药效活性化合物针对乳腺癌的治疗靶点，经DisGeNet数据库查询确定其基因属性后，导入至String数据库中搜索，设置物种定义为“Homo sapiens”，其置信度定义为0.4，以TSV数据形式保存PPI数据，如图2所示，得出PPI网络图共有217个节点。

如图3所示，核心靶点筛选过程中首先需要剔除游离的干扰蛋白信息，将String数据以TSV文件的形式输入到Cytoscape软件，经过处理，得到蛋白互作图(PPI)，然后以Cytoscape软件中的CytoNCA插件，分析互作网络中所有节点的拓扑参数，选取计算度中心性(degree centrality，DC)、介性中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)、特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)和基于局部平均连通度方法(local average connectivity-based method，LAC)作为核心靶点的筛选条件，需要说明的是，核心靶点筛选范围所有拓扑属性值即DC、BC、CC、EC、LAC均大于平均值。另外，将得到的互作关系数据输入到软件Cytoscape软件建立治疗靶点PPI网络图。其中图4展示了核心靶点属性的比例图。

图5展示了核心靶点度值排序情况。最终筛选出度值排名前5的关键靶点如下：TP53、AKT1、MYC、CTNNB1、EGFR。

(5)对核心靶点富集分析以探讨药物成分可能的作用机制

使用Cytoscape的ClueGO插件及R语言的“clusterProfiler”、“pathview”等相关R包对1.4的核心靶点进行GO功能注释和KEGG通路富集分析，输出其相应数据图，预测靶点的功能分布，并以优选富集项分析核心通路富集程度，获得关键核心靶点，以及其对应的关键通路信息，从而阐释疏肝健脾方药效活性化合物抗乳腺癌的作用机制。

如图7所示，通过使用Cytoscape中的Clue GO插件，筛选出来147个满足条件的生物过程(P<0.05)，其中最高的前5个分别为：DNA生物合成过程的正向调控(Positiveregulation of DNA biosynthetic process)、一氧化氮合酶活性(Nitric oxidesynthase activity)、周期蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸激酶活性(Positive regulation ofcyclin-dependent protein serine/threonine kinase activity)、细胞对氧化应激反应的负调控(Negative regulation of cellular response to oxidative stress)、alpha-beta T细胞谱系决定(Alpha-beta T cell lineage commitment)。

基于R语言的相关包对假设靶点进行KEGG途径富集分析，设置P<0.05为差异有统计学意义。结果如图8所示，在20个最重要的通路中，以调控癌症中的蛋白多糖(proteoglycans in cancer)，脂质和动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)，内分泌抵抗(endocrine resistance)，晚期糖基化终产物及其受体(AGE-RAGE)信号通路为主发挥抗乳腺癌作用。

(6)绘制可视化的网络关系解析图

以P<0.05作为筛选条件，分别从富集的GO注释与KEGG信号通路数据中筛选出其中排名前十的条目，并制作表格反映两者对应关系，以R包ggplot2和ggalluvial进行映射关系的可视化展示，如图9所示，构建“靶点-生物过程/信号通路”的可视化图形。

(7)核心靶点的临床重要性验证

将筛选的TP53、AKT1、MYC、CTNNB1、EGFR这代表性前五位核心靶点输入至GEPIA与Kaplan Meier plotter数据库，获得核心靶点在乳腺癌与正常组织表达量对比、在乳腺癌不同阶段表达量对比以及对乳腺癌患者总体生存预后评估的临床信息，以此证明筛选出的核心靶点对于乳腺癌的发生、发展及预后的密切相关性，从而反映网络药理学分析结果的可靠性。如图6所示，通过公共数据库查询，我们发现所鉴定的核心靶点在乳腺癌与乳腺癌表达量均有明显差异，且随着乳腺癌程度进展，其表达量亦出现变化，其表达水平高低与总体生存率亦存在明显相关性，以上说明了我们筛选出的核心靶点对于乳腺癌的发生、发展及预后均起到重要作用，因此也进一步说明了我们网络药理学分析结果的可靠性。

(8)化合物-靶点-信号通路-疾病网络

如图10所示，最后将化合物-靶点网络与核心治疗靶点PPI网络、基因-通路网络进行合并，建立化合物-靶点-通路-疾病网络。依据与靶点相连的数目，即度值，与靶点相连数目越多，即度值越高，代表在乳腺癌治疗中所发挥的作用越重要，依此筛选疏肝健脾方中在乳腺癌治疗中可能起主要作用的活性化合物。

通过建立化合物-靶点-通路-疾病网络，可以发现化合物1,5-dimethyl-N-(4-morpholinobenzyl)-1H-pyrazole-3-carboxamide；

3-[(2-phenyl-1H-imidazol-4-yl)methylene]-1,3-dihydro-2H-indol-2-one；3-(tert-Butyl)-N-[4-(2,3-dihydroimidazo[2,1-b][1,3]thiazol-6-yl)phenyl]-1-meth yl-1H-pyrazole-5-carboxamide，能够作用于更多的核心治疗靶点，进而调控相应的通路，起到治疗乳腺癌的作用，因此推测这三个化合物为疏肝健脾方中起主要药理作用的活性成分。该网络明确了疏肝健脾方中起主要治疗作用的药效物质成分，为后续研究奠定了基础。

综上所述，本申请实施例提供一种基于网络药理学及高分辨质谱分析中药复方疏肝健脾方潜在药效物质基础的方法。相对于现有技术，本申请的实施例至少具有如下优点或有益效果：

1、本申请提供的一种基于网络药理学及高分辨质谱分析中药复方疏肝健脾方潜在药效物质基础的方法，以高分辨质谱成分分析技术加持网络药理学预测的研究模式弥补了用传统的“单药单靶”的研究模式难以明确中药的药效物质基础并无法充分解释其药理作用的问题，可客观全面的分析中药的化学成分组成，并针对潜在的药效化合物，从药物相关分子、网络、信号通路等多层次，通过对药物相关分子进行网络构建、核心靶点筛选、功能富集分析等技术手段，从药物多靶点、多途径的特点着手进行探索，预测中药主要药理活性成分，阐释药效物质基础可能的药理作用机制，此方向性的指引作用，节省大量人力、财力、时间等成本，减少研发风险，可以实现对中药资源进行更加合理的利用。

2、本申请利用网络药理学技术首次构建了中药复方疏肝健脾方抗乳腺癌的“药物-成分-靶点-疾病”网络图，揭示了该复方通过“多靶点、多通路、多途径”联合调控发挥其药效，其中疏肝健脾方的主要药效活性成分有：

1,5-dimethyl-N-(4-morpholinobenzyl)-1H-pyrazole-3-carboxamide；

3-[(2-phenyl-1H-imidazol-4-yl)methylene]-1,3-dihydro-2H-indol-2-one；

3-(tert-Butyl)-N-[4-(2,3-dihydroimidazo[2,1-b][1,3]thiazol-6-yl)phenyl]-1-methyl-1H-pyrazole-5-carboxamide。

3、本申请通过构建成分靶点-疾病靶点网络发现了中药复方疏肝健脾方抵抗乳腺癌是通过TP53、AKT1、MYC、CTNNB1、EGFR等关键治疗靶点，以调控癌症中的蛋白多糖、脂质和动脉粥样硬化、内分泌抵抗和晚期糖基化终产物及其受体信号通路为主发挥作用，这为阐明疏肝健脾方抗乳腺癌的药效物质基础研究提供了新途径，为进一步使用该方用于乳腺癌的防治提供了前期研究基础。

以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。