一种猪德尔塔冠状病毒结构蛋白在制备亚单位疫苗中的应用及制备的亚单位疫苗

摘要

本发明提供了一种猪德尔塔冠状病毒结构蛋白在制备亚单位疫苗中的应用及制备的亚单位疫苗，属于生物制品技术领域。本发明利用哺乳动物细胞ExpiCHO

说明书

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种猪德尔塔冠状病毒结构蛋白在制备亚单位疫苗中的应用及制备的亚单位疫苗。

背景技术

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是一种新发、重要的猪肠道冠状病毒，各个年龄段的猪皆可感染，其中哺乳仔猪感染后临床症状最为严重，主要表现为急性呕吐、腹泻，脱水死亡

PDCoV属于德尔塔冠状病毒属成员之一，是单股正链RNA病毒。基因组长度约为25kb，包含5’UTR、3’UTR和8个开放阅读框(ORFs)，分别编码两个多聚蛋白pp1a、pp1b和四个结构蛋白，分别为S(spike(S)glycoprotein)、E(envelope(E)protein)、M(membrane(M)protein)、N(nucleoprotein(N)protein)和两个非结构蛋白NSP6(non-structuralprotein 6(Nsp6))、NSP7

冠状病毒(Coronavirus，CoVs)可引起人和动物的多种疾病，在过去二十年中，新型致命CoV不断出现，在人类社会引发了三次传染病大流行，造成巨大的健康威胁，扰乱了全球经济对于冠状病毒疫苗的研发策略主要包括传统的灭活疫苗和弱毒疫苗以及新型的基因工程疫苗，基因工程疫苗主要有亚单位疫苗、核酸疫苗、病毒活载体疫苗等。传统的灭活疫苗具有工艺成熟，研发周期短，成本低、使用安全等优点。但其也有免疫剂量大，易出现过敏反应等缺点，并且灭活疫苗制作过程中需要保持免疫原性颗粒的完整性以保持疫苗的免疫效果，对灭活的工艺要求较高，且生产过程中要求的生物安全等级较高。研究表明，采用化学方法对冠状病毒进行灭活，会改变病毒粒子表面S蛋白的结构，使其大部分处于融合后状态，导致其免疫保护效果不佳

参考文献

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发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种猪德尔塔冠状病毒结构蛋白在制备亚单位疫苗中的应用，PDCoV主要结构蛋白S以及S联合N和M作为抗原具有诱导产生中和抗体水平高的特点，制备的亚单位疫苗具有良好的免疫保护效果。

本发明提供了一种猪德尔塔冠状病毒亚单位疫苗，包括猪德尔塔冠状病毒结构蛋白抗原和佐剂；

所述结构蛋白抗原包括以下至少一项：S蛋白、S蛋白与M蛋白或N蛋白形成的第一组合物和S蛋白与M蛋白和N蛋白形成的第二组合物。

优选的，所述第一组合物中，所述M蛋白或N蛋白和S蛋白的质量比为0.8～1.2：0.8～1.2。

优选的，所述第二组合物中，所述S蛋白、M蛋白和N蛋白的质量比为0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2。

优选的，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

优选的，所述佐剂包括AddaVax

优选的，所述结构蛋白抗原和佐剂的体积比为1:1。

本发明提供了一种猪德尔塔冠状病毒结构蛋白S或S蛋白联合M蛋白和/或N蛋白在制备防控猪德尔塔冠状病毒引起的流行病的亚单位疫苗中的应用。

优选的，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

优选的，患所述猪德尔塔冠状病毒引起的流行病的动物包括哺乳动物；

优选的，所述哺乳动物包括猪和/或小鼠。

本发明提供了一种猪德尔塔冠状病毒亚单位疫苗，包括猪德尔塔冠状病毒结构蛋白抗原和佐剂；所述结构蛋白抗原包括S蛋白或S蛋白、M蛋白和N蛋白形成的组合物。本发明利用CHO真核表达系统，分别重组表达制备PDCoV主要结构蛋白S、N和M，并对上述蛋白作为疫苗抗原的免疫保护效果进行了评价，结果表明，S蛋白作为抗原制备的疫苗以及S蛋白、M蛋白和N蛋白共同作为抗原制备的疫苗在体内能够诱导产生较高水平的中和抗体，同时在体外条件下，上述两种疫苗免疫后收集的小鼠或仔猪抗血清也具有中和PDCoV的能力，且两种疫苗的中和抗体水平相当。可见，本发明提供的亚单位疫苗为猪德尔塔冠状病毒的防控提供了新手段。

同时，本发明提供的亚单位疫苗，S蛋白、M蛋白和N蛋白形成的组合物作为蛋白抗原不但能在体内、体外诱导产生与S蛋白相同的中和抗体水平，而且在M蛋白和N蛋白的参与下，免疫诱导了更强烈的细胞免疫应答，并且在仔猪攻毒保护试验中获得了更好的保护效果。本发明首次通过试验证明，PDCoVN和M蛋白在诱导机体产生免疫保护反应中同样具有重要作用。与其他潜在的CoV抗原相比，N和M抗原具有一些独特的优势，包括蛋白序列的保守性、遗传学和生物化学知识的扩展以及强的免疫原性，与S蛋白混合免疫后能够进一步提升亚单位疫苗的免疫保护效果。这一结果对于今后进一步研制开发猪肠道冠状病毒疫苗具有重要的指导意义。因此，在今后PDCoV新型疫苗研制中，可以将N和M抗原作为疫苗抗原成分，从而进一步提升疫苗的免疫效力。

附图说明

图1为重组蛋白S、N、M的构建和表达结果，其中A为重组质粒构建示意图，B为考马斯亮蓝染色结果；C为蛋白免疫印迹结果；

图2为免疫程序及免疫小鼠和猪的特异性IgG抗体水平结果，A为免疫策略；B为小鼠和仔猪中特异性抗体IgG的检测结果；

图3为仔猪攻毒保护试验结果；

图4为免疫小鼠和猪中和抗体水平结果；

图5为免疫小鼠细胞免疫水平结果。

具体实施方式

本发明提供了一种猪德尔塔冠状病毒亚单位疫苗，包括猪德尔塔冠状病毒结构蛋白抗原和佐剂；所述结构蛋白抗原包括以下至少一项：S蛋白、S蛋白与M蛋白或N蛋白形成的第一组合物和S蛋白与M蛋白和N蛋白形成的第二组合物。

在本发明中，所述第一组合物中，所述M蛋白或N蛋白和S蛋白的质量比优选为0.8～1.2：0.8～1.2，更优选为1:1:1。所述第二组合物中，所述S蛋白、M蛋白和N蛋白的质量比优选为0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2，更优选为1:1:1。

在本发明中，所述S蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:1所示。所述M蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:2所示。所述N蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:3所示。在本发明中，所述S蛋白、M蛋白和N蛋白的制备方法分别采用CHO真核表达系统重组表达得到。本发明对所述CHO真核表达系统重组表达的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的CHO真核表达系统重组表达的方案即可。

在本发明中，所述佐剂优选包括AddaVax

本发明提供了一种猪德尔塔冠状病毒结构蛋白S或S蛋白联合M蛋白和/或N蛋白在制备防控猪德尔塔冠状病毒引起的流行病的亚单位疫苗中的应用。

在本发明中，所述S蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:1所示。所述M蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:2所示；所述N蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:3所示。

在本发明中，患所述猪德尔塔冠状病毒引起的流行病的动物优选包括哺乳动物。所述哺乳动物优选包括猪和/或小鼠。本发明实施例中，小鼠免疫采用3针免疫法，间隔14天免疫1次，免疫剂量优选为20μg S蛋白/只小鼠/次或S、M、N蛋白各20μg/只小鼠/次。仔猪免疫优选为2针免疫，间隔14天免疫一次。仔猪的免疫剂量优选为200μg S蛋白/只仔猪/次或S、M、N蛋白各200μg/只仔猪/次。对免疫后动物采集血清检测，结果表明，本发明提供的S蛋白亚单位疫苗和组合物亚单位疫苗均能够诱导高水平的特异性抗体，并且在体内和体外均能够诱导较高水平的中和抗体，且两种疫苗无显著性差异。此外，本发明还评估了两种亚单位疫苗产生的细胞免疫应答情况，结果表明组合物亚单位疫苗诱导产生的小鼠脾脏淋巴细胞的CD8

下面结合实施例对本发明提供的一种猪德尔塔冠状病毒结构蛋白在制备亚单位疫苗中的应用及制备的亚单位疫苗进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

1.本发明涉及的病毒与细胞说明：

PDCoV(Gen Bank登录号:MN064712)毒株、LLC porcine kidney(LLC-PK)细胞由中国农业科学院兰州兽医研究所国家重点实验室保存；

ExpiCHO-S细胞购于赛默飞世尔科技公司；LLC-PK用含10％胎牛血清的MEM在37℃、5％CO

2.数据统计分析方法

使用GraphPad Prism软件对试验数据进行单因素方差分析(ANOVA)确定组间差异。各组保护率采用Fisher精确检验或卡方检验进行统计学分析(P>0.05代表各组间无显著性差异，*P<0.05表示为各组间的统计学差异，**P<0.01表示各组间有显著性统计学差异，而***P<0.001表示各组间有极显著性统计学差异)。

实施例1

1.真核表达质粒的构建及大量提取

为了使蛋白能够更好的分泌表达，本发明选择表达S蛋白(Gen Bank登录号:MN064712)胞外域部分(D20-N1077)，并去除自身信号肽序列，M蛋白胞外域(D88-M217)部分和完整的N蛋白(M1-A342)。在S、M和N蛋白氨基端添加人源基因secretoglobin family 1Dmember 1信号肽序列(MRLSVCLLLLTLALCCYRANA)，在羧基末端添加6×His标签序列，形成融合蛋白，氨基酸序列见SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3。根据融合蛋白设计基因序列，并交由武汉金开瑞生物公司进行密码子优化合成，优化后的融合基因的核苷酸序列对应SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:6，并构建入pCDNA3.1(+)真核表达载体中(见图1中A)。

将构建好的三种真核表达质粒分别转化到Escherichia coli DH5α(Takara，Beijing，China)感受态细胞中，挑取阳性克隆，接种于含有50μg/mL氨苄霉素的200ml LB液体培养基中，在37℃恒温摇床培养箱中过夜培养。次日用EndoFree Plasmid Maxi Kit(Qiagen，Germany)大量提取重组质粒(具体实验步骤参考说明书)，并用NanoDrop 2000分光光度计测定重组质粒的浓度，并分装稀释至1000ng/μL。

2.结构蛋白的重组表达和分离纯化

将提取好的三种质粒按照ExpiCHO表达系统操作手册转染ExpiCHO-S细胞，在32℃培养箱含5％CO

3.利用westernblot分析纯化的重组结构蛋白

纯化的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转印硝酸纤维素膜(Pall，USA)进行免疫印迹分析，以MouseAnti-His mAb(1：5000稀释，中杉金桥，北京，中国)，HRP标记山羊抗小鼠IgG(1：10000稀释，中杉金桥，北京，中国)为二抗，用化学发光底物(ECL，ThermoScientific，USA)进行显影。

重组蛋白的表达纯化与鉴定结果

三种重组质粒转染ExpiCHO-S细胞，按高滴度实验方案培养10天后，离心收取细胞培养上清液，经镍柱亲和层析纯化获得重组蛋白，进行SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色清晰可见三条纯度较高目的蛋白条带，蛋白分子量大小分别为S(160kDa)、N(42kDa)、M(16kDa)，与预期一致(图1中B)。

为了进一步确定重组蛋白的特异性，分别用MouseAnti-His mAb对S、N和M三个重组蛋白进行westernblotting鉴定。结果表明，三种重组蛋白不可以被MouseAnti-His mAb所识别(图1中C)。

此外，westernblotting中重组蛋白条带的位置与SDS-PAGE中蛋白条带位置一致。结果进一步证实了重组蛋白结构完整(末端带有His标签)。

实施例2

1.亚单位疫苗的制备和小鼠免疫试验

总共30只4～6周龄的无特定病原体雌性BALB/c小鼠由兰州兽医研究所实验动物中心提供，所有动物试验程序均由LZVR的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。(Allmice used inthis study are in good health and are not involved in otherexperimental procedure.)将小鼠随机分为3组(10只/组)，各组小鼠分别在第0、14和28天免疫一次(图2中A)，免疫时用PBS稀释相应抗原至400μg/ml，并与等体积的AddaVaxadjuvant(InvivoGen,USA)混合，进行后腿肌肉注射。第一组为S组，每次每只小鼠免疫S蛋白20μg，第二组为Mixture组，每次每只小鼠免疫S、M、N蛋白各20μg，第三组为PBS对照组，每次每只注射等量的PBS-AddaVax adjuvant混合物。

2.仔猪免疫和攻毒保护试验

所有试验猪均饲养于兰州兽医研究所动物饲养设施内，在实验期间，每一组都被安置在不同的房间里，动物使用协议得到了兰州兽医研究所的批准。本研究中所有试验动物均接受人道关怀，并在实验结束时实施安乐死。15头1周龄哺乳仔猪均购自无PDCoV感染或疫苗接种史的商品化猪场。用间接ELISA方法对母猪和仔猪血清样品进行检测，以确保PDCoV抗体阴性，通过实时荧光定量PCR对母猪和仔猪粪便样品进行检测，进一步证实试验动物为PDCoV阴性。将15头1周龄哺乳仔猪随机分为3组(5头/组)，各组仔猪分别在第0天和第14天免疫一次(图2中A)，免疫时用PBS稀释相应抗原，并与等体积的AddaVax adjuvant(InvivoGen,USA)混合，进行颈部肌肉注射。第一组为S组，每次每头仔猪免疫S蛋白200μg，第二组为Mixture组，每次每头仔猪免疫S、M、N蛋白各200μg，第三组为PBS对照组。在免疫后第28天，3组中的所有仔猪均经口服攻毒3mL 1000PDD

引物：

PDCoV-RT-F：ACGTCGTAAGACCCAGCATC(SEQ ID NO:7)；

PDCoV-RT-R：CCCACCTGAAAGTTGCTCTC(SEQ ID NO:8)；

探针：

PDCoV-Probe B：FAM-GTATGGCTGATCCTCGCATCATGGC-BHQ1(SEQ ID NO:9)。

反应体系(Takara一步法试剂盒)：

2×buffer 10μL，HS 0.4μL、5pmol/L PDCoV-Probe B 0.4μL，RT酶0.4μL，10pmol/L引物F\R 0.4μL，RNA2μL，补水至20μL。

反应程序：42℃5min，95℃10s；95℃5s，57℃20s，40个循环。

为了评估本研究中的亚单位候选疫苗对仔猪的免疫保护效果，在对仔猪进行两针免疫后第28天进行攻毒保护试验。当粪便粘稠度评分≥1分，同时粪便样本中可检出排毒时(log10 N gene copys/ml＞3.347)，判定为PDCoV感染阳性。如图3所示，PBS组仔猪在2dpi开始出现临床症状(FC score≥1)，且肛门拭子粪便样品中可检测到排毒，在4dpi时，腹泻评分和排毒量达到峰值，且腹泻症状一直持续到6dpi，排毒一直持续到7dpi；S组仔猪在2dpi和3dpi时出现腹泻临床症状，并可检测到排毒，但在4dpi时，腹泻症状消失，且不排毒；Mixture组仔猪在2dpi出现轻微腹泻(FC score≥1)，但肛门拭子粪便样品PDCoV检测为阴性，并且在3dpi，腹泻症状迅速转归，在5dpi时，1头仔猪出现腹泻症状(FC score＝2)且可检测到排毒(log10 N gene copys/ml＝4.93)。通过攻毒后7天的临床观察与监测，PBS组仔猪全部发病，保护率为0(0/4)(在免疫试验过程中PBS组仔猪死亡1头)，S组仔猪免疫保护率为40％(2/5)，Mixture组可有效保护仔猪抵抗PDCoV的攻击，免疫保护率为80％(4/5)。

实施例3

特异性抗体检测

用间接ELISA方法测定血清中S、M和N蛋白的特异性抗体水平，具体操作如下：

将纯化的S、M和N蛋白分别用50mM的碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释至5μg/ml，包被96孔微孔板(Corning，USA)，100μl/孔，4℃过夜包被；弃去包被液，PBST洗板3次，滤纸上拍干，加入用PBST配制的含5％脱脂奶粉的封闭液200μL/孔，37℃孵育2h；弃去封闭液，PBST洗板3次，滤纸上拍干，每孔加入100μl用血清稀释液(百迪泰，济南，中国)稀释的上述实施例中制备的小鼠或仔猪血清(1：100)，37℃孵育1h；弃去孔中液体，PBST洗3次，滤纸上拍干，每孔加入100μl血清稀释液稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG(1：10000稀释，中杉金桥，北京，中国)或HRP标记山羊抗猪IgG(1：20000稀释，Abcam，UK)，37℃孵育1h；弃去孔中液体，PBST洗3次，滤纸上拍干，每孔加入100μL TMB底物溶液(索莱宝，北京，中国)，37℃避光反应10～15min；每孔加入100μL 2M H

为了评估S、M、N三种结构蛋白作为亚单位疫苗的潜力，对小鼠进行了免疫试验，并对仔猪进行了免疫攻毒保护试验。免疫后，使用间接ELISA方法检测S、M、N三种结构蛋白在小鼠或猪体内诱导的特异性抗体水平。如图2中B所示，S、M、N三种结构蛋白在小鼠或猪体内均诱导了高水平的特异性IgG抗体，与PBS对照组相比，统计学差异极显著(P＜0.001)，但S蛋白组与Mixture组的S蛋白特异性抗体水平无显著差异(P＞0.05)。在第14天时(一免后两周)，小鼠血清中的特异性抗体水平略高于仔猪血清中的特异性抗体水平，这可能与仔猪较小，免疫系统尚不完善有关，在第28天时(二免后两周)，特异性抗体水平均显著升高，由此可见，该亚单位候选疫苗对仔猪的免疫可能需要两剂免疫达到理想的免疫效果。

实施例4

血清中和试验

应用固定病毒—稀释血清的方法测定血清中PDCoV中和抗体滴度，具体操作如下：

提前准备铺满70％～80％LLC-PK细胞的96孔板；将血清置于56℃水浴锅中灭活30min，然后在96孔微量培养板中将血清作2倍连续倍比稀释，每个稀释度作4孔重复。在上述各孔内加入等体积的稀释好的病毒液(200TCID

为了测定小鼠或仔猪血清在体外中和PDCoV的能力，我们应用固定病毒—稀释血清的方法测定了试验动物血清的中和抗体滴度。如图4所示，在小鼠或仔猪体内，S组和Mixture组均诱导了高水平的中和抗体，显著高于PBS对照组(P＜0.001)；三免后两周(第42天)的小鼠血清的中和抗体滴度高达1：1000；两针免疫(第28天)的仔猪血清的中和抗体滴度也达到约1：200；但无论是小鼠血清或是猪血清，S组和Mixture组诱导的中和抗体水平相当，统计学无显著差异(P＞0.05)。

实施例5

亚单位疫苗对小鼠细胞免疫的影响

1.流式细胞术分析

免疫后第42天取小鼠脾脏，并用动物淋巴细胞分离液试剂盒(Solarbio,Beijing,China)分离制备淋巴细胞悬液。用RPMI 1640培养基(Gibco,USA)将淋巴细胞悬液稀释至5×10

2.血清中细胞因子水平检测

利用细胞因子ELISA试剂盒检测初免后第42d采集的各免疫组小鼠血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的表达水平(具体实验步骤参考该试剂盒说明书)。

为了评估S、N和M蛋白在小鼠体内诱导的细胞免疫水平，采用流式细胞术检测小鼠脾脏淋巴细胞中的CD4

如图5中A和B所示，Mixture组中小鼠脾脏淋巴细胞的CD8

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。