用于血清半乳糖凝集素-3检测的磁微球电化学发光免疫检测试剂盒及其该试剂盒制备

摘要

本发明涉及电化学检测领域，特别涉及用于血清半乳糖凝集素‑3检测的磁微球电化学发光免疫检测试剂盒及其该试剂盒制备。本发明提供了组合物及其在制备Gal‑3检测试剂盒中的应用。Gal‑3分子量小，做成商业化诊断产品较难满足重复性、稳定性要求。本发明将抗体‑抗原反应的高度特异性与三联吡啶钌发光的高度灵敏性结合起来，利用三联吡啶钌在DBAE下产生的光子以检测产物浓度，提高了灵敏度、稳定性、重复性，缩短反应时间、抗干扰性高、操作简单。

说明书

技术领域

本发明涉及电化学检测领域，特别涉及用于血清半乳糖凝集素-3检测的磁微球电化学发光免疫检测试剂盒及其该试剂盒制备。

背景技术

慢性心力衰竭(chronicheartfailure，CHF)是一种以心室射血功能严重受损、外周血流分布异常为主要特征的临床综合征，其病理过程主要表现为心脏重塑和心肌纤维化，因其发病率高、预后不良导致该病死亡率较高。

血清Gal-3是可溶性β-半乳糖苷结合凝集素，是一个相对分子质量为30kDa、与G-半乳糖苷结合的蛋白，参与多种生物活性，主要已知的是其介导肿瘤生长，侵袭和转移，同时它也与年龄的增长，糖尿病肾病，纤维变性疾病如肝纤维化、肾纤维化、特发性肺纤维化和慢性胰腺炎相关。与心脏纤维化和心肌重构相关，能促进心脏成纤维细胞增殖，胶原沉积和心室功能障碍。

Gal-3作为炎性反应的重要介质，在心肌重构和心力衰竭的病理发展过程中有重要作用，心力衰竭患者血浆Gal-3水平表达越高，越易进展为心力衰竭恶化，住院率与病死率也越高。血清Gal-3能促进心肌巨噬细胞的活化和迁移，加速成纤维细胞增殖以及胶原蛋白沉积，导致心脏重塑以及心肌纤维化，而心脏重塑和心肌纤维化正是影响慢性心力衰竭的重要决定性因素。血清Gal-3在人体组织器官中表达的普遍性，使血清Gal-3产生不受特定条件的限制。因此近年来，国内外逐渐将血清Gal-3作为心力衰竭的重要诊断指标。目前，Gal-3已成为欧美国家临床诊断与评估心力衰竭患者近期预后的重要指标。除此之外，Gal-3还可用于各种脏器的纤维化，包括且不限于：心脏、肾脏、肝脏等。

到目前为止，虽然认为Gal-3可用于动态或急性心衰患者的附加风险分层，但迄今为止，Gal-3很少用于常规临床患者检查。用于检测人血清中血清半乳糖凝集素-3(Gal-3)的方法主要有：酶联免疫法(ELISA)和酶促磁微粒化学发光。Gal-3分子量较小，且在各个组织器官中都有，正常人当中也有，因此其检测数据基础数据较高，现有技术及产品检测的重复性、灵敏度、特异性、稳定性和检测时间长等不能满足商业化的临床诊断的需要。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了用于血清半乳糖凝集素-3检测的磁微球电化学发光免疫检测试剂盒及其该试剂盒制备。本发明提供了组合物及其在制备血清半乳糖凝集素-3(Gal-3)磁微粒电化学发光检测试剂盒中的应用。本发明通过实验发现将抗体-抗原反应的高度特异性与三联吡啶钌发光的高度灵敏性结合起来，利用三联吡啶钌在DBAE下产生的光子以检测产物浓度，具有灵敏度更高、反应时间短、操作简单、抗干扰性高的特点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了组合物，包括含有生物素标记的可特异性结合Gal-3的抗体、含有三联吡啶钌标记的可特异性结合Gal-3的抗体和链霉亲和素超顺磁微球；

所述链霉亲和素超顺磁微球的粒径包括1.0～6.0μm。

在本发明的一些具体实施方案中，所述可特异性结合Gal-3的抗体包括抗Gal-3单克隆抗体。

在本发明的一些具体实施方案中，可特异性结合Gal-3的抗体分子表面的生物素分子标记量包括2～5个。

在本发明的一些具体实施方案中，所述可特异性结合Gal-3的抗体包括抗Gal-3单克隆抗体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述可特异性结合Gal-3的抗体分子表面的钌分子标记量包括2～10个。

在本发明的一些具体实施方案中，所述链霉亲和素超顺磁微球的粒径包括3μm。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物还包括缓冲液；

所述缓冲液包括：

20mmol/L～200mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4；和/或

20mmol/L～200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH＝7.4。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物还包括第一清洗液；

所述第一清洗液包括2-N-二丁氨基乙醇；

所述第一清洗液还包括磷酸盐缓冲液。

在本发明的一些具体实施方案中，所述第一清洗液包括浓度90mmol/L的二丁基乙醇胺，其中含浓度300mmol/L的磷酸盐缓冲液。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物还包括稳定剂；

所述稳定剂包括甘氨酸、蛋氨酸、PEG20000、葡聚糖200000、普鲁兰多糖或聚乙烯比咯烷酮360中的一种或多种。

在本发明的一些具体实施方案中，所述稳定剂包括：

在本发明的一些具体实施方案中，所述稳定剂与所述缓冲液的体积比为5：100。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物还包括第二清洗液；

所述第二清洗液包括清洗液1、清洗液2、清洗液3和/或清洗液4；

所述清洗液1包括聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚、聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚和/或Proclin950；

所述清洗液2包括氢氧化钠、氯化钠和/或次氯酸钠溶液；

所述清洗液3包括聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚、聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚和/或氢氧化钾；

所述清洗液4包括85wt％的磷酸、二氯乙酰胺、聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚、聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚、磷酸二氢钾和/或2-N-二丁氨基乙醇。

在本发明的一些具体实施方案中，所述清洗液1包括：

聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚     1.0g/L

聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚        10g/L

Proclin950                         75g/L

在本发明的一些具体实施方案中，所述清洗液2包括：

氢氧化钠                            120g/L

氯化钠                              87.75g/L

次氯酸钠溶液                        25g/L

在本发明的一些具体实施方案中，所述清洗液3包括：

聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚     1.0g/L

聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚        10g/L

氢氧化钾                           9.856g/L

在本发明的一些具体实施方案中，所述清洗液4包括：

本发明还提供了所述组合物的制备方法，所述含有生物素标记的可特异性结合Gal-3的抗体的制备方法包括：取可特异性结合Gal-3的抗体和生物素，混匀，反应结束后去除未标记的生物素，制得所述含有生物素标记的可特异性结合Gal-3的抗体；

所述含有三联吡啶钌标记的可特异性结合Gal-3的抗体的制备方法包括：取可特异性结合Gal-3的抗体和三联吡啶钌，混匀，反应结束后去除未标记的三联吡啶钌，制得所述含有三联吡啶钌标记的可特异性结合Gal-3的抗体；

所述链霉亲和素超顺磁微球的制备方法包括：取超顺磁微球，包被链霉亲和素，制得所述链霉亲和素超顺磁微球。

在本发明的一些具体实施方案中，所述含有生物素标记的可特异性结合Gal-3的抗体的制备方法包括：取2.0mg的用于标记生物素Gal-3抗体，使用脱盐柱PD10更换缓冲液为磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)，使用超滤管浓缩后调整浓度为2.0mg/mL，加入80μg的生物素(使用DMF溶解)，混匀反应30分钟，使用脱盐柱PD10去除未标记的生物素，制得所述含有生物素标记的可特异性结合Gal-3的抗体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述含有三联吡啶钌标记的可特异性结合Gal-3的抗体的制备方法包括：取2.0mg的用于标记三联吡啶钌的Gal-3抗体，使用脱盐柱PD10更换缓冲液为磷酸盐缓冲液(PH＝7.8)，使用超滤管浓缩后调整浓度为2.0mg/mL，加入80μg的三联吡啶钌(使用DMF溶解)，混匀反应30分钟，使用脱盐柱PD10去除未标记的钌，制得所述含有三联吡啶钌标记的可特异性结合Gal-3的抗体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述链霉亲和素超顺磁微球为表面包裹带有链霉亲和素的超顺磁微球，所述磁微球的粒径在1.0～6.0微米，所述磁微粒包被物缓冲液为20mmol/L～200mmol/L磷酸盐缓冲液，PH＝7.4或20mmol/L～200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液，PH＝7.4。

本发明还提供了所述组合物在制备Gal-3检测试剂盒中的应用。

本发明还提供了试剂盒，其包括所述组合物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒包括：Gal-3试剂Ra、Gal-3试剂Rb、链霉亲和素超顺磁微球、定标品、二丁基乙醇胺清洗液、管路清洗液。

在本发明的一些具体实施方案中，所述Gal-3试剂Ra为含生物素标记的抗Gal-3单克隆抗体，每个抗体分子表面的生物素分子标记量在2～5个，缓冲液为20mmol/L～200mmol/L磷酸盐缓冲液，PH＝7.4或20mmol/L～200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液，PH＝7.4。

在本发明的一些具体实施方案中，所述Gal-3试剂Rb为含三联吡啶钌标记的抗Gal-3单克隆抗体，每个抗体分子表面的钌分子标记量在2～10个，缓冲液为20mmol/L～200mmol/L磷酸盐缓冲液，PH＝7.4或20mmol/L～200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液，PH＝7.4。

在本发明的一些具体实施方案中，所述链霉亲和素超顺磁微球为表面包裹带有链霉亲和素的超顺磁微球，所述磁微球的粒径在1.0～6.0微米，所述磁微粒包被物缓冲液为20mmol/L～200mmol/L磷酸盐缓冲液，PH＝7.4或20mmol/L～200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液，PH＝7.4。

本发明还提供了以下任意项在Gal-3检测中的应用：

(I)、所述组合物；和/或

(II)、所述试剂盒。

本发明还提供了Gal-3磁微球电化学发光检测方法，其基于如下任意项对Gal-3进行检测：

(I)、所述组合物；和/或

(II)、所述试剂盒。

本发明还提供了一种Gal-3磁微球电化学发光试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

步骤1、取待测样本15μL加入反应管中，再依次加入Gal-3试剂Ra70μL和Gal-3试剂Rb70μL，于37℃孵育9min，最后加入链霉亲和素超顺磁微球40μL，于37℃孵育9min；

步骤2、将孵育反应完成的反应管通过吸液钢针吸入电化学流通池，并被流通池的磁铁吸附；

步骤3、吸液钢针吸取第二清洗液，未结合到超顺磁微球上的标记钌的抗体和样本被清洗后，流通池加电，在DBAE存在的条件下三联吡啶钌发光。

步骤4、光电倍增管记录发光值，根据建立的标准曲线，计算样本中Gal-3的浓度。

本发明包括但不限于取得如下有益效果：

本发明将抗体-抗原反应的高度特异性与三联吡啶钌发光的高度灵敏性结合起来，利用三联吡啶钌在DBAE下产生的光子以检测产物浓度，具有灵敏度更高、反应时间短、操作简单、抗干扰性高的特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示采用实施例7中的反应方法的线性范围；

图2示试剂瓶结构；

图3示装置结构；

图4示信号测试结果。

具体实施方式

本发明公开了用于血清半乳糖凝集素-3检测的磁微球电化学发光免疫检测试剂盒及其该试剂盒制备，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用方法为电化学发光法，采用吡啶钌作为化学发光标记物具有明显优势，主要表现在：稳定性更好，钌是金属离子，分子量小，不影响抗体的空间位阻。生产过程短，重复性好。检测范围宽，重复性好。电化学发光反应可控，降低信号采集难度。

磁微粒可以作为生物大分子的载体，抗体包被的磁微粒称为免疫磁微粒，由于其既有结合抗原的特性又有磁性的特点，因此，在从复杂样品中分离、纯化与浓集目的微生物、细胞和生物大分子等方面具有较多优势，包括快速、特异性强、操作简便、使用范围广等。纳米材料是20世纪90年代后得到迅猛发展的新材料，纳米磁微粒(粒径小于10nm～100nm)在磁结构和磁性方面与一般磁微粒有很大区别：纳米磁性颗粒，单位体积颗粒数目更多，比表面积更大；具有超顺磁性，磁相互作用很弱；它可在外加磁场作用下定向运动，使得某些特殊成份得以分离、浓集或纯化等。本发明建立的磁微粒化学发光法灵敏度高、特异性强、准确快速、检测时间短、检测结果具有更高的准确性与重复性。

本发明提供了一种Gal-3磁微球电化学发光试剂盒，包括：Gal-3试剂Ra、Gal-3试剂Rb、链霉亲和素超顺磁微球、定标品、二丁基乙醇胺清洗液、管路清洗液。

上述一种Gal-3磁微球电化学发光试剂盒，其中，Gal-3试剂Ra为含生物素标记的抗Gal-3单克隆抗体，每个抗体分子表面的生物素分子标记量在2～5个，所述的缓冲液为20mmol/L～200mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4或20mmol/L～200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH＝7.4。Gal-3试剂Rb为含三联吡啶钌标记的抗Gal-3单克隆抗体，每个抗体分子表面的钌分子标记量在2～10个，所述的缓冲液为20mmol/L～200mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4或20mmol/L～200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH＝7.4。

上述一种Gal-3磁微球电化学发光试剂盒，其中，所述链霉亲和素超顺磁微球为表面包裹带有链霉亲和素的超顺磁微球，所述磁微球的粒径在1.0～6.0微米，所述磁微粒包被物缓冲液为20mmol/L～200mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4或20mmol/L～200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH＝7.4。

上述一种Gal-3磁微球电化学发光试剂盒，其中，所述生物素标记的Gal-3抗体为单克隆抗体；

上述一种Gal-3磁微球电化学发光试剂盒的检测方法，其中，所述清洗液为浓度90mmol/L的二丁基乙醇胺，其中含浓度300mmol/L的磷酸盐缓冲液。

一种Gal-3磁微球电化学发光试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

1)取样本15μL加入反应管中，再依次加入Gal-3试剂Ra70μL和Gal-3试剂Rb70μL，于37℃孵育9min，最后加入链霉亲和素超顺磁微球40μL，于37℃孵育9min；

2)将孵育反应完成的反应管通过吸液钢针吸入电化学流通池，并被流通池的磁铁吸附；

3)吸液钢针吸取第二清洗液，未结合到超顺磁微球上的标记钌的抗体和样本被清洗后，流通池加电，在DBAE存在的条件下三联吡啶钌发光。

4)光电倍增管记录发光值，根据建立的标准曲线，计算样本中Gal-3的浓度。

2、统计及计算模型

这样的评估通常不会对所有(即100％)待鉴定的受试者是正确的。然而可以鉴定到有统计学显著意义的受试者(例如，在人群研究中的一个群组)。是否有统计学显著性可以由本领域技术人员使用各种已知的统计学评估工具确定，如置信区间、P-值、斯氏t检验、Mann-Whitney检验等，详情可参考Dowdy和Wearden的《StatisticsforResearch(用于研究的统计学)》(John Wiley&Sons公司，纽约，1983)。置信区间可以设置为90％，至少95％，至少97％，至少98％或至少99％。p值可以设定为0.1、0.05、0.01、0.005或0.000l。群体可以设置为至少60％，至少70％，至少80％或至少90％的受试者可以通过本发明的方法正确鉴定。

优点和积极效果

1)电化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、快速、准确、重复性好并安全无毒无污染等优点。鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物是最早使用的一类化学发光物质，但其应用于化学发光免疫分析，需要使用催化剂和增强剂，这将导致背景发光增强，从而限制了这一技术的灵敏度和它的应用及发展。吖啶酯发光体系简单，不需要催化剂，置于H

电化学发光标记物吡啶钌性质非常稳定，其发光效率不受温度、pH、离子强度等因素的影响。电化学发光试剂信号值与新鲜试剂相比信号值下降在3％以内。开瓶效期为三个月，2～8℃可稳定15个月以上。

电化学标记反应迅速，整个反应只需半小时。标记效率达到70％。标记的比例可以通过投料比进行控制，提高产能50％以上。钌的分子量小(800D)空间位阻小，抗体活性好。455nm的吸收峰，可以控制投料比来控制批间差。

链霉亲和素与生物素具有高特异性的结合能力，链霉亲和素与生物素标记的高纯度抗体非共价键特异性结合，具有级联放大的作用，其反应呈高度专一性。因此，在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰，而且结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。

本发明将抗体-抗原反应的高度特异性与三联吡啶钌发光的高度灵敏性结合起来，利用三联吡啶钌在DBAE下产生的光子以检测产物浓度，具有灵敏度更高、反应时间短、操作简单、抗干扰性高的特点。

2)磁微粒选择，灵敏度高。

3)携带污染率低，灵敏度以及准确度高。

4)效期长和开瓶效期长。

5)特殊的试剂瓶弯口设置(图3、图4)，可有效防止漏液及试剂蒸发，提高试剂效期和开瓶效期。

使用的设备为北京联众泰克科技有限公司生产的全自动化学发光免疫分析仪(型号UD90DT)。

如无特殊说明，本发明提供的用于血清半乳糖凝集素-3检测的磁微球电化学发光免疫检测试剂盒及其该试剂盒制备中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1磁微粒的选择

①实验材料

②仪器

③实验地点：

地点：公司研发实验室

④实验过程：

实验方法：

TSH(夹心法)、T4(竞争法)的具体实验步骤：

TSH(夹心法)：

第1步：样本50μL、含生物素化的TSH特异性单克隆抗体的Ra60μL和含钌(Ru)复合物标记的TSH特异性单克隆抗体Ra50μL一起孵育，形成抗原抗体免疫复合物。

第2步：加入含有包被链霉亲和素的磁珠微粒的磁分离试剂40μL进行孵育，让上述形成的免疫复合物通过生物素与链霉亲和素间的相互作用结合到磁珠微粒上。

第3步：孵育结束后将反应混和液吸到测量池中，磁珠微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定获得发光值。

主曲线信息通过试剂条码扫描入仪器后，扫描定标品信息卡，将定标品的信息和浓度扫入仪器，对主曲线进行校正获得校准曲线，软件自动通过校准曲线进行计算得到检测结果。

T4(竞争法)：

总甲状腺素(TT4)测定采用竞争法，其检测步骤如下：

第1步：样本15μL、含钌(Ru)复合物标记的T4抗体的Ra75μL一起孵育；样本中与结合蛋白结合的T4经ANS作用而释放。

第2步：加入含生物素化的T4的Rb75μL和含包被链霉亲和素的磁珠微粒的磁分离试剂30μL，生物素化的T4与未结合的标记抗体结合，形成抗体-半抗原复合物，上述形成的免疫复合物通过生物素与链霉亲和素间的相互作用结合到磁珠微粒上。

第3步：孵育结束后将反应混和液吸到测量池中，磁珠微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定获得发光值。

主曲线信息通过试剂条码扫描入仪器后，扫描定标品信息卡，将定标品的信息和浓度扫入仪器，对主曲线进行校正获得校准曲线，软件自动通过校准曲线进行计算得到检测结果。

用两个厂家的链霉亲和素磁珠(1、ThermoFisherScientificInc；2、JSRLifeSciences)检测TSH(夹心法)和T4(竞争法)低值血清和高值血清的信号值，比较本底信号值以及信噪比。血清的浓度值由罗氏诊断的“cobase411”及配套试剂定值，磁珠稀释液采用罗氏磁珠稀释液。

⑤实验结果

表1TSH(夹心法)

表2T4(竞争法)

⑥实验结论：

从结果(表1、表2)可以看出：可见不同粒径的链霉亲和素磁珠信噪比差距明显，信噪比越大，意味着灵敏度越高，决定采用粒径3.0μm的链霉亲和素磁珠。统计学P值大于0.05，符合正态分布。

实施例2携带污染率的检测

清洗液1配方：(1L)

聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚     1.0g/L

聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚        10g/L

Proclin950                         75g/L

清洗液2配方：(1L)

氢氧化钠                            120g/L

氯化钠                              87.75g/L

次氯酸钠溶液                        25g/L

清洗液3配方：(1L)

聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚     1.0g/L

聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚        10g/L

氢氧化钾                           9.856g/L

清洗液4配方：(1L)

携带污染率的测试流程：

携带污染率分析中需要得到三种信号值，本底测值(简称ProCellRef，为设备使用清洗液清洗并测试的本底发光值)，携带污染率高浓度测试值(简称ProCellSAP，为测试高剂量钌(浓度为1nmol/L)的发光值)，携带污染率低浓度测试值(简称ProCellCo，为高剂量钌使用后经过清洗液清洗，再次测试本底的发光值)。测试中按照清洗液(5次)、高剂量钌(3次)、清洗液(3次)放在全自动化学发光免疫分析仪(型号UD90DT)的测试位，启动测光程序。分别得到的5个ProCellRef，3个ProCellSAP，3个ProCellCo值。测定的发光值用于计算carryover，在相同的高剂量钌情况下，计算的值越小，说明清洗效果更好。

这四个清洗液(第二清洗液)的使用可以减小测量池的交叉污染率从而提高Gal-3检测的准确度以及灵敏度。

携带污染率的计算公式如下：

改善前：

根据上述公式计算得到Carryover＝93.06

改善后：

根据上述公式计算得到Carryover＝30.96

从上面携带污染检测数据可以看出这四个清洗液的联合使用显著(P＜0.05)降低了测试的携带污染率，携带污染率的降低意味着更高的灵敏度以及准确度。

实施例3效期和开瓶效期

我们在试剂组分中加入一种复合稳定剂，该稳定剂可以显著延长Gal-3试剂的储存效期以及开瓶效期。

该稳定剂配方如下：

合格标准：空白限需满足≤60pg/mL；线性相关系数r需满足≥0.99；准确度需满足偏差在±10％以内；精密度需满足：CV≤10％。

表3Gal-3稀释液未添加稳定剂时试剂的实时稳定性数据

表4Gal-3稀释液添加稳定剂(5％v/v)后试剂的实时稳定性数据

从以上数据可以看出：在未添加稳定剂之前，在第15个月，Gal-3试剂出现了线性相关系数小于0.99，且准确度偏差＞10％，表明试剂此时已经不稳定，相关性能低于了既定指标。当加入稳定剂后，无论是第15个月还是第18个月，Gal-3试剂性能均符合既定指标，可以看出稳定剂的加入，对试剂稳定性的提升有明显的作用。

表5Gal-3稀释液未添加稳定剂时试剂的开瓶稳定性数据

表6Gal-3稀释液添加稳定剂(5％v/v)后试剂的开瓶稳定性数据

以上数据可以看出：在未添加稳定剂之前，在第12周，Gal-3试剂出现了线性相关系数小于0.99，且准确度偏差＞10％，表明试剂此时已经不稳定，相关性能低于了既定指标。当加入稳定剂后，无论是第12周还是第24周，Gal-3试剂性能均符合既定指标，可以看出稳定剂的加入，对试剂开盖稳定性的提升有明显的作用。

实施例4生物素标记Gal-3抗体和试剂Ra的制备

用于标记生物素的Gal-3抗体购自北京缘田馨野科技有限公司，货号为YT-Gal-3-002，克隆号为6E9。

取2.0mg的用于标记生物素Gal-3抗体，使用脱盐柱PD10更换缓冲液为磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)，使用超滤管浓缩后调整浓度为2.0mg/mL，加入80μg的生物素(使用DMF溶解)，混匀反应30分钟，使用脱盐柱PD10去除未标记的生物素，收集的抗体使用BCA法测定蛋白浓度，使用的试剂盒为Thermo的商品化试剂盒，货号为23225。使用含1％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)稀释标记生物素的Gal-3抗体到1mg/L，作为Gal-3试剂Ra。

实施例5钌标记Gal-3抗体和试剂Rb的制备

用于标记三联吡啶钌的Gal-3抗体购自北京缘田馨野科技有限公司，货号为YT-Gal-3-003，克隆号为5H4。

取2.0mg的用于标记三联吡啶钌的Gal-3抗体，使用脱盐柱PD10更换缓冲液为磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)，使用超滤管浓缩后调整浓度为2.0mg/mL，加入80μg的三联吡啶钌(使用DMF溶解)，混匀反应30分钟，使用脱盐柱PD10去除未标记的钌，收集的抗体使用BCA法测定蛋白浓度，使用的试剂盒为Thermo的商品化试剂盒，货号为23225。。使用含1％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)稀释标记钌的Gal-3抗体到1mg/L，作为Gal-3试剂Rb。

实施例6夹心法测定Gal-3

Gal-3测定采用夹心法，其检测原理如下：

1)取样本15μL加入反应管中，再依次加入实施例4中制备的Gal-3试剂Ra70μL和实施例5中制备的Gal-3试剂Rb70μL，于37℃孵育9min，最后加入链霉亲和素磁微球40μL，于37℃孵育9min；

2)将孵育反应完成的反应混合液管通过吸液钢针吸入电化学流通池，并被流通池的磁铁吸附；

3)吸液钢针吸取第二清洗液，未结合到超顺磁微球上的标记钌的抗体和样本被清洗后，流通池加电，在DBAE存在的条件下三联吡啶钌发光。

4)光电倍增管记录发光值，根据企业提供的曲线使用定标品的发光值进行校正后建立的标准曲线，计算样本中Gal-3的浓度。

第1步：取样本15μL加入反应管中，再依次加入实施例4中制备的Gal-3试剂Ra70μL和实施例5中制备的Gal-3试剂Rb70μL，于37℃孵育9min，和形成抗原抗体免疫复合物。

第2步：加入包被链霉亲和素的磁珠微粒进行孵育，让上述形成的免疫复合物通过生物素与链霉亲和素间的相互作用结合到磁珠微粒上，形成反应混合液。

第3步：将上述形成的反应混合液吸到测量池中，加入第二清洗液后，结合的复合物通过磁铁吸附复合物中的磁珠微粒被吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定获得发光值。

主曲线信息通过试剂条码扫描入仪器后，扫描定标品信息卡，将定标品的信息和浓度扫入仪器，对主曲线进行校正获得校准曲线。上述测得的发光值通过校准曲线软件自动进行计算得到检测结果。

效果例1空白限测试

以实施例7中反应方法，用零浓度稀释液作为样本，得到20次测量结果的RLU值(相对发光值)，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，同时相邻浓度的样品重复测试2次，根据零浓度稀释液和相邻低浓度样品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的RLU值代入上述方程中，求出对应的浓度值即为空白限(表7，表10)。

表7实施例7中反应方法空白限

效果例2线性范围的验证

以实施例7中反应方法，将接近线性范围上限(114ng/mL)的高值样品按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值浓度的样品须接近2ng/mL。对每一浓度的样品均重复检测2次，计算其平均值，即为实测浓度，将稀释浓度和实测浓度用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r，r不小于0.99。稀释浓度与实测浓度的直线拟合结果如图1、表8所示。

表8实施例7中反应方法空白限

R

对比例1反应体系的对比

目前市面上电化学发光免疫分析方法大多采用吡啶钌复合物和三丙胺(TPA)的反应体系，比如罗氏诊断，本发明电化学发光免疫分析方法选择了吡啶钌复合物和2-N-二丁氨基乙醇(DBAE)的反应体系。其优点如下：

1、DBAE水溶解度更好，20℃时溶解度约为4g/L；三丙胺(TPA)20℃时的溶解度约为2.6g/L；如果采用三丙胺(TPA)的反应体系，三丙胺的工作浓度约为26g/L，是其溶解度的10倍，为了增加三丙胺的(TPA)的溶解度，就需要添加表面活性剂和磷酸，此外还需要满足一定的搅拌时间和搅拌速度，大大增加生产工艺的难度。

2、三丙胺(TPA)毒性分级为高毒，DBAE毒性分级为中毒，使用DBAE能减小底物液的毒性，对检验工作者健康以及环境更为友好。

3、DBAE和吡啶钌的反应体系发光效率更高，分别使用2g/L的DBAE缓冲液以及2g/L的三丙胺(TPA)进行信号测试结果如图4所示：

同等浓度的DBAE的发光强度大约是同等浓度三丙胺(TPA)的6倍。

4、此外在研究中我们还发现使用吡啶钌和DBAE的反应体系能够提高测试的灵敏度，我们分别用这两个体系检测了血清半乳糖凝集素-3(Gal-3)灵敏度，以空白限作为反应灵敏度的指标，测试方法如下：用零浓度稀释液作为样本，得到20次测量结果的RLU值(相对发光值)，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，同时相邻浓度的样品重复测试2次，根据零浓度稀释液和相邻低浓度样品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的RLU值代入上述方程中，求出对应的浓度值即为空白限。吡啶钌复合物和三丙胺(TPA)反应体系灵敏度如表9所示，吡啶钌复合物和二丁基乙醇胺(DBAE)反应体系灵敏度如表10、表7所示。

表9吡啶钌复合物和三丙胺(TPA)反应体系灵敏度

表10吡啶钌复合物和二丁基乙醇胺(DBAE)反应体系灵敏度

由此可见专利中声明的方法比常规方法具有更高的灵敏度。

5、由于采用DBAE和吡啶钌的反应体系，26g/L的DBAE与吡啶钌反应产生的信号是26g/LTPA与吡啶钌反应产生信号的3倍，所以需要更少量的抗体就能检测到信号。

基于实施例5中方法收集的抗体使用BCA法测定蛋白浓度，使用的试剂盒为Thermo的商品化试剂盒，货号为23225。

由此可见专利中声明的方法比常规方法具更节约抗体。

对比例2试剂盒的情况对比

如实施例7所述，Gal-3磁微球电化学发光试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

1)取样本15μL加入反应管中，再依次加入Gal-3试剂Ra70μL和Gal-3试剂Rb70μL，于37℃孵育9min，最后加入链霉亲和素超顺磁微球40μL，于37℃孵育9min；

2)将孵育反应完成的反应管通过吸液钢针吸入电化学流通池，并被流通池的磁铁吸附；

3)吸液钢针吸取第二清洗液，未结合到超顺磁微球上的标记钌的抗体和样本被清洗后，流通池加电，在三丙胺或DBAE存在的条件下三联吡啶钌发光。

4)光电倍增管记录发光值，根据建立的标准曲线，计算样本中Gal-3的浓度。

酶联免疫吸附实验方法(试剂盒为R&Dsystem公司的HumanGalectin-3Immunoassay(目录号DGAL30))：

1)取用需要的反应孔，加入100μL的稀释液，然后加入血清(使用稀释液1：20稀释)、标准品50μL，在室温孵育120min；

2)去掉孵育的液体，使用含表面活性剂的清洗液体清洗4次后，加入200μL的Gal-3的辣根酶抗体试剂，在室温孵育120min；

3)去掉孵育的液体，使用含表面活性剂的清洗液体清洗4次后，加入底物200μL，避光室温孵育30分钟后加入50μL终止液。

4)使用酶标仪，选择450nm滤光片，测试每个样品孔的OD值。

根据标准品建立的标准曲线，计算样本中Gal-3的浓度。

表11汇总对比的试剂盒的情况

上述步骤表明，本发明采用的夹心法的反应模式，利用磁微球电化学的原理，定量检测人血清或血浆样品中的Gal-3含量，确保了检测的灵敏度。并适合用于全自动设备使用。加大了检测速度和检测通量，提高了检测效率，同时避免了人为操作导致的误差。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。