基于UPLC指纹图谱和含量测定的石上柏质量控制方法

摘要

基于UPLC指纹图谱的石上柏质量控制方法，包括如下步骤：将石上柏经干燥后粉碎机进行粉碎，过中国药典60目筛，分别精确称量不同产地的石上柏5.0g，采用75%乙醇溶液回流提取3次，过滤，合并，浓缩，再经乙酸乙酯萃取，旋转蒸发仪浓缩得乙酸乙酯萃取物，用甲醇溶解定容，即得；吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪中，按色谱柱：Ascentis‑C18(250mm×4.6mm，5µm)；流动相：乙腈(A)，0.1%甲酸水溶液(B)；检测波长：330nm；柱温：25℃；流速：0.5mL/min；进样量：2μL的色谱条件进行测定记录得石上柏的指纹指纹图谱；再将所得指纹指纹图谱数据导入图谱相似度评价系统，采用中位数法，时间窗设为0.1min，经多点校正后，进行Mark峰匹配，系统生成石上柏药材的色谱叠加图和对照指纹图谱。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于UPLC指纹图谱和含量测定的石上柏质量控制方法。

背景技术

石上柏（

现代化学成分研究表明，石上柏主要含双黄酮类、生物碱类、甾醇、皂苷、氨基酸等成分。在卷柏属药用植物的化学成分研究中最有意义的是双黄酮类化学成分的发现，目前已从深绿卷柏中分离得到8种黄酮

蒋咏梅等

发明内容

本发明所要解决的是应用UPLC法建立了同时测定穗花杉双黄酮、罗波斯塔双黄酮、白果双黄酮、扁柏双黄酮、橡胶树双黄酮5个主要活性成分的含量分析方法，并成功将其应用到石上柏药材活性成分含量分析的技术问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

基于UPLC指纹图谱和含量测定的石上柏质量控制方法，包括如下步骤：

步骤一，供试品溶液的制备；

将石上柏经干燥后粉碎机进行粉碎，过中国药典60目筛，分别精确称量不同产地的石上柏5.0g，采用75%乙醇溶液回流提取3次，过滤，合并，浓缩，再经乙酸乙酯萃取，旋转蒸发仪浓缩得乙酸乙酯萃取物，用甲醇溶解定容，即得；

步骤二，测定法：吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪中，按色谱柱：Ascentis-C18(250mm×4.6mm，5µm)；流动相：乙腈(A)，0.1%甲酸水溶液(B)；检测波长：330nm；柱温：25℃；流速：0.5mL/min；进样量：2μL的色谱条件进行测定记录得石上柏的指纹指纹图谱；

再将所得指纹指纹图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，采用中位数法，时间窗设为0.1min，经多点校正后，进行Mark峰匹配，系统生成石上柏药材的色谱叠加图和对照指纹图谱。

本发明首次建立UPLC法同时测定13批中草药石上柏5种双黄酮成分（穗花杉双黄酮、罗波斯塔双黄酮、白果双黄酮、扁柏双黄酮、橡胶树双黄酮）的含量，并作了精密度、重复性、稳定性及加样回收率方面的考察。方法学考察结果表明，其各项评价指标的相对标准偏差均<2.0%，表明在该色谱条件下，仪器精密度良好，样品在24h内稳定性良好，适用于石上柏中5种双黄酮的含量测定。含量测定结果表明，5种双黄酮在石上柏中的含量分布呈现一定的规律性，即穗花杉双黄酮>罗波斯塔双黄酮>扁柏双黄酮>橡胶树双黄酮>白果双黄酮。结合主成分分析可从多角度综合判断石上柏双黄酮的质量。石上柏不同产地间5种双黄酮的含量有一定差异，可能与不同地域、不同采收时间以及不同的加工方法有关。该方法操作简便，测定准确，可用于中药石上柏的质量分析。

附图说明

图1 为不同产地石上柏指纹图谱。

图2为石上柏样品及混合标准品图。

图3为石上柏指纹图谱得分图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例一：

1.材料与方法

1.1材料与仪器

WatersAcquityUPLCH-Class超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；FA1004N型电子天平（菁海仪器公司）；KQ118型多频超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；N-1100型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；DLSB-2L/-20型低温冷却液循环泵（上海豫康科教仪器设备有限公司）；FW177型粉碎机（泰斯特仪器公司）。

穗花杉双黄酮（纯度≥99%）、罗波斯塔双黄酮（纯度≥96%）、白果双黄酮（纯度≥99%）、扁柏双黄酮（纯度≥99%）、橡胶树双黄酮（纯度≥99%）均购于上海源叶生物科技有限公司；甲醇（HPLC）、乙腈（HPLC）均购于上海迈瑞尔生化科技有限公司。

石上柏药材分别购自不同产地的药材市场，并经遵义医科大学生药学教研室张副教授鉴定为石上柏，样品信息如表1。

表1石上柏样品信息

1.2.1对照品溶液的制备

精密称取穗花杉双黄酮、罗波斯塔双黄酮、白果双黄酮、扁柏双黄酮、橡胶树双黄酮适量，至容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，超声溶解，得各对照品储备液，质量浓度分别为0.340mg/mL的穗花杉双黄酮、0.324mg/mL的罗波斯塔双黄酮、0.344mg/mL的白果双黄酮、0.308mg/mL的扁柏双黄酮、0.362mg/mL的橡胶树双黄酮对照品溶液。

1.2.2供试品溶液的制备

石上柏经干燥后粉碎机进行粉碎，过中国药典60目筛，分别精确称量不同产地的石上柏5.0g，采用75%乙醇溶液回流提取3次，过滤，合并，浓缩，再经乙酸乙酯萃取，旋转蒸发仪浓缩得乙酸乙酯萃取物，用甲醇溶解定容，即得。

1.2.3色谱条件

色谱柱：Ascentis-C18(250mm×4.6mm，5µm)；流动相：乙腈(A)，0.1%甲酸水溶液(B)；检测波长：330nm；柱温：25℃；流速：0.5mL/min；进样量：2μL。

表2UPLC色谱条件

1.2.4指纹图谱的建立

穗花杉双黄酮在各样品图谱中分离度好，峰面积较高，稳定性好，故将其作为色谱参照峰，以计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。

13批石上柏药材按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“1.2.3”项下色谱条件进行测定，记录各样品色谱图。将所得色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，以S1为参照图谱，采用中位数法，时间窗设为0.1min，经多点校正后，进行Mark峰匹配，系统生成石上柏药材的色谱叠加图和对照指纹图谱。

1.2.5线性考察

分别精密吸取穗花杉双黄酮、罗波斯塔双黄酮、白果双黄酮、扁柏双黄酮、橡胶树双黄酮对照品溶液1、2、3、4、5mL，分别置于5mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，得系列对照品溶液，按“1.2.3”项下的色谱条件，分别进样2μL，测定峰面积。

1.2.6稳定性考察

取S1样品的供试品溶液，按“1.2.3”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24h进样，计算各个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果显示样品的各共有峰的相对保留时间的RSD小于0.61%，相对峰面积的RSD小于2.0%，表明供试品溶液在24h内稳定。

1.2.7精密度考察

取S1样品的供试品溶液，按“1.2.3”项下色谱条件，连续进样6次，计算各个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果显示样品的各共有峰的相对保留时间的RSD小于0.40%，相对峰面积的RSD小于2.0%，表明仪器精密度良好。

1.2.8重复性考察

取S1样品的粉末6份，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“1.2.3”项下色谱条件进行测定，计算各个共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD。结果显示样品的各共有峰的相对保留时间的RSD小于0.44%，相对峰面积的RSD小于2.1%，表明试验重复性良好。

1.2.9 加样回收试验

取S1样品的粉末精密称定，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，加入一定量的穗花杉双黄酮、罗波斯塔双黄酮、白果双黄酮、扁柏双黄酮、橡胶树双黄酮标准品溶液，再按“1.2.3”项下色谱条件进行测定，计算回收率。

1.2.10不同产地石上柏中5种双黄酮的含量

取13个产地的石上柏5.0g，按“1.2.3”方法测定5种双黄酮的峰面积，计算它们的提取得率。不同产地产品中双黄酮提取得率计算

式中：C为石上柏中不同双黄酮的浓度，mg/mL；V为石上柏提取液体积，mL；m为石上柏药材总质量，g。

2. 结果

2.1指纹图谱的建立

标定了10个共有峰，并经与对照品的PDA光谱图及保留时间对比，指认出5个色谱峰，分别为穗花杉双黄酮（1号峰）、罗波斯塔双黄酮（2号峰）、白果双黄酮（3号峰）、扁柏双黄酮（9号峰）、橡胶树双黄酮（10号峰）。13批石上柏样品UPLC图及石上柏药材对照指纹图谱见图1、图2。

2.2相似度分析

将13批石上柏药材图谱与对照图谱进行相似度评价，相似度评价结果见表3。各批石上柏药材的相似度结果为0.989~0.999，相似度均高于0.98，表明所建立的指纹图谱方法可用于石上柏药材的整体质量控制。

表3相似度评价结果

2.3线性考察

以对照品峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，分别得到穗花杉双黄酮、罗波斯塔双黄酮、白果双黄酮、扁柏双黄酮、橡胶树双黄酮的线性回归方程、相关系数、线性范围，由表4可知，其相关系数均>0.999，表明5种双黄酮分别在3.342-250.32、1.534-15.34、1.694-43.36、1.644-30.48、3.016-124.92μg/mL浓度范围内线性关系良好。

表4 5种双黄酮标准品的线性关系

2.4 精密度、稳定性、重复性试验结果

根据测试结果计算穗花杉双黄酮、罗波斯塔双黄酮、白果双黄酮、扁柏双黄酮、橡胶树双黄酮的RSD（n=6），结果见表5，由表5可知，其RSD均<2.0%，表明仪器的精密度良好，供试品溶液在8h内稳定性良好，该方法稳定性良好。

表5 5种双黄酮精密度、稳定性、重复性试验结果

2.5 加样回收试验

结果穗花杉双黄酮、罗波斯塔双黄酮、白果双黄酮、扁柏双黄酮、橡胶树双黄酮的平均加样回收率分别为98.26%、99.13%、98.56%、97.88%、98.66%。

2.613个产地石上柏中5种双黄酮的含量

计算各样品中穗花杉双黄酮（X1）、罗波斯塔双黄酮（X2）、白果双黄酮（X3）、扁柏双黄酮（X4）、橡胶树双黄酮（X5）成分的含量，利用SPSS18.0进行描述统计分析，得到石上柏样品中各成分含量极小值、极大值、均值、标准差，结果见表6，结果显示穗花杉双黄酮的含量在0.096%~0.309%，罗波斯塔双黄酮的含量在0.031%~0.135%，白果双黄酮的含量在0.005%~0.029%，扁柏双黄酮的含量在0.008%~0.069%，橡胶树双黄酮的含量在0.003%~0.043%。结果表明不同产地石上柏的5种双黄酮化合物的含量有一定的差异，可能与不同地域、不同采收时间以及不同的加工方法有关。

表6不同产地石上柏含量测定

2.7主成分分析

通过SPSS18.0软件中的因子分析对原始数据进行标准化处理，主成分的特征根及贡献率是选择主成分的依据。经过计算，前3个成分A1，A2及A3的特征值大于1，即4.939，1.770，1.340，对总方差的累积贡献率达80.481%，故选择A1，A2及A3为第一、第二、第三主成分，结果见表7。

表7主成分特征值与贡献率

旋转后的公共因子载荷矩阵见表8，可以得出1，2，3，4，5，7，8，9，10号色谱峰在主成分1中有明显的正相负荷，表明第一主成分的信息主要来自于这9个峰，而其他的色谱峰对第一主成分的影响相对较小。第二主成分的信息主要来自于4，5，6，7，8，10号色谱峰，而其他的色谱峰对第二主成分的影响相对较小。第二主成分的信息主要来自于2，3，6，7，9，10号色谱峰，而其他的色谱峰对第二主成分的影响相对较小。

表8旋转后的公共因子载荷矩阵

对公共因子载荷矩阵进行主成分分析，以第一、第二主成分为变量得到二维投影。通过图3可看出不同产地供试品的内在相互关系可较好地表现出来，进而实现不同样品之间的分类，从图中可以看出10批不同产地的石上柏药材被分为6类，第一类为福建产地的石上柏，第二类为海南产地的石上柏，第三类为湖北产石上柏，第四类为贵州产石上柏，第五类为云南产石上柏，第六类为广西产石上柏。

3. 结论

本研究首次建立UPLC法同时测定13批中草药石上柏5种双黄酮成分（穗花杉双黄酮、罗波斯塔双黄酮、白果双黄酮、扁柏双黄酮、橡胶树双黄酮）的含量，并作了精密度、重复性、稳定性及加样回收率方面的考察。方法学考察结果表明，其各项评价指标的相对标准偏差均<2.0%，表明在该色谱条件下，仪器精密度良好，样品在24h内稳定性良好，适用于石上柏中5种双黄酮的含量测定。含量测定结果表明，5种双黄酮在石上柏中的含量分布呈现一定的规律性，即穗花杉双黄酮>罗波斯塔双黄酮>扁柏双黄酮>橡胶树双黄酮>白果双黄酮。结合主成分分析可从多角度综合判断石上柏双黄酮的质量。石上柏不同产地间5种双黄酮的含量有一定差异，可能与不同地域、不同采收时间以及不同的加工方法有关。该方法操作简便，测定准确，可用于中药石上柏的质量分析。

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