斑马鱼结核性脑膜炎模型在筛选和评价抗结核性脑膜炎药物中的应用

摘要

本发明公开了斑马鱼结核性脑膜炎模型在筛选和评价抗结核性脑膜炎药物中的应用。本发明通过于受精后的斑马鱼幼鱼后脑部注射荧光标记的海分枝杆菌，成功构建一种可应用于高通量筛选和评价抗结核性脑膜炎药物的动物模型。斑马鱼感染所使用的海分枝杆菌，既能模拟结核分枝杆菌感染后宿主的病理特征，并且对人的致病性低，要求的生物安全等级也低，可在普通实验室操作；且斑马鱼感染时可使用特定荧光标记的海分枝杆菌，药物作用后，可直接在荧光显微镜下进行活体拍照，通过定量特定荧光的信号强度的差异来比较药效。本发明的动物模型可有效应用于高通量抗结核性脑膜炎药物的筛选评价，为筛选临床用药提供了一种良好的工具和方法，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及斑马鱼结核性脑膜炎模型在筛选和评价抗结核性脑膜炎药物中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

结核性脑膜炎TBM(Tuberculous meningitis)是由结核分枝杆菌Mtb(mycobacterium tuberculosis)侵入脑部造成的，目前诊断和治疗都比较困难，具有较高的致死和致残率，因此TBM成为最为致命性的肺外结核病。

动物疾病模型是研究致病机制、开发临床前治疗方案的有效手段，小鼠和新西兰大白兔是目前最为常用的TBM动物模型。常见的小鼠和家兔感染模型通过脑部后卤直接接种Mtb，但这两种实验动物养殖周期长、成本高，更为重要的是Mtb相关的动物实验研究需在生物安全3级(biosafety level-3，BSL-3)实验室才能操作。目前评估新给药方案疗效最常用的是小鼠、家兔TBM模型。对于哺乳动物模型，主要的治疗效果监测手段是：利用正电子放射断层扫描技术(Positron Emission Tomography-Computed Tomography，PET/CT)和核磁共振成像技术(Magnetic Resonance Imaging，MRI)对活体动物脑部的炎症信号、病理损伤和药物分布进行动态观察和实时追踪。但除了操作Mtb需要较高生物安全等级的实验室外，PET/CT技术所需的设备成本高昂，操作难度系数较大，使得此类实验研究的广泛开展受到限制。同时，验证Mtb是否在脑部生长，常采取脑部组织进行细菌培养的方法，培养周期通常需要28天左右，导致研究过程实验操作复杂而进度缓慢。确定模型动物脑部病变情况而采用MRI技术操作复杂，成本高，使得研究的开展受到诸多限制。

海分枝杆菌M.m(mycobacterium marinum)是一种人类的机会致病菌，与Mtb遗传背景颇为相似，平均氨基酸同源性高达85％，产生毒力均需ESX-1分泌系统的参与。操作M.m对生物安全要求低，并且M.m感染后能在斑马鱼体内形成与结核病人类似的肉芽肿典型病变。

斑马鱼个体小、发育快、产卵量高，在基因水平上87％与人类同源。斑马鱼具有与人类相似的BBB(blood brain barrier，血脑屏障)结构。斑马鱼BBB存在于脑部血液和脑组织之间，由一层紧密结合的内皮细胞构成，在受精第3天(3day-post-fertilization，3dpf)后开始发育，持续发育成熟到10dpf。斑马鱼幼鱼通体透明，便于进行药物与荧光标记的M.m分布扩散的可视化追踪。近年来，斑马鱼-M.m感染模型在宿主抗结核免疫和药物筛选等研究领域被越来越多的使用。

2014年，荷兰学者Lisanne M.van Leeu等人开始将斑马鱼-M.m模型用于构建TBM的实验动物模型。在他们的工作中，通过腹腔注射M.m证实了M.m可以成功感染具有发达免疫系统与BBB的斑马鱼成鱼。此外，在被感染的斑马鱼成鱼的脑膜和脑膜下间隙发现了肉芽肿，在肉芽肿周围的脑实质组织中发现了淋巴细胞炎症和神经胶质细胞增生与严重的脑膜和脑实质血管充血，以此证明了斑马鱼-M.m感染模型是研究TBM的有效实验动物模型。在斑马鱼幼鱼的TBM模型构建研究方面：显微注射接种M.m至2dpf斑马鱼后脑、总主静脉、尾静脉均可以发现M.m在大脑中传播。使用激光共聚焦显微镜拍摄和HE染色等手段观察研究了细胞成分，明确定义：斑马鱼脑部形成了肉芽肿结构。同时在后脑注射感染M.m 5天后的斑马鱼脑部发现：脑膜形成的肉芽肿会挤压脑实质造成脑组织损失。BBB已经发育成熟的21-25dpf斑马鱼在总主静脉注射接种M.m后同样发现了TBM的发生。在该模型构建成功后，参考引用该模型构建方式，科研工作者还构建了斑马鱼幼鱼的肺炎链球菌脑膜炎模型，阐明了脑膜炎中肺炎链球菌穿过斑马鱼BBB的机制。

目前，世界卫生组织推荐的TBM治疗方案和肺结核的常规药物治疗方案基本一致，采用短期化疗中的四联方案：两个月的异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇四药强化治疗阶段，紧接着10个月的异烟肼和利福平持续用药。BBB的存在是抗结核药物被成功递送到到脑部发挥功效的最大障碍。在四种抗结核药物中：异烟肼在临床作为首选抗结核药物，蛋白结合率低，易通过血脑屏障，但耐药率居高不下；吡嗪酰胺易穿过血脑屏障，与异烟肼联合使用时，在细胞内具有明显的协同作用，在口服后可广泛分布至全身，血药浓度维持较长时间；利福平属于利福霉素类半合成光谱抗菌药物，杀菌效果好，但透过血脑屏障效率低；乙胺丁醇作用则为抑制结核分枝杆菌细胞壁合成，不可通过血脑屏障。尽管异烟肼和吡嗪酰胺比较容易透过血脑屏障和脑脊液，但利福平和乙胺丁醇的穿透能力却不尽如人意。

因此，目前急需一种可高效用于高通量筛选和评价抗结核性脑膜炎(TBM)药物的动物模型。

发明内容

本发明的目的是：为了解决目前常用的结核性脑膜炎哺乳动物模型个体都比较大，不适合进行高通量药物筛选的应用的技术问题，本发明提供一种可高效用于高通量药物筛选和药物评价的斑马鱼结核性脑膜炎模型，斑马鱼个体小，发育快，结合特定的光学显微技术，可有效应用于高通量抗结核性脑膜炎药物的筛选评价。

为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种斑马鱼结核性脑膜炎模型在筛选和评价抗结核性脑膜炎药物中的应用，所述斑马鱼结核性脑膜炎模型是通过在斑马鱼后脑部注射海分枝杆菌构建而成。

优选地，所述斑马鱼为受精后的幼鱼。

优选地，所述斑马鱼品系为转基因斑马鱼品系Tg(Fli1:GFP)。

优选地，所述海分枝杆菌为荧光标记的海分枝杆菌。

优选地，所述评价抗结核性脑膜炎药物的应用是通过斑马鱼结核性脑膜炎模型总主静脉注射抗结核药物的方式进行药物评价。

优选地，所述筛选抗结核性脑膜炎药物的应用是通过斑马鱼结核性脑膜炎模型浸泡给药的方式进行药物筛选。

本发明还提供了一种评价抗结核性脑膜炎药物的方法，包括：受精2天后的斑马鱼幼鱼通过后脑部位注射携带绿色荧光标记的海分枝杆菌Mm：wasabi构建斑马鱼结核性脑膜炎模型，模型构建成功后通过总主静脉注射待评价药物，给药一定时间后使用高内涵荧光显微镜对鱼全身进行绿色荧光通道下扫描，然后利用Image J软件对脑部绿色荧光信号强度进行定量分析比较，评价不同药物对海分枝杆菌的作用效果。

本发明还提供了一种高通量筛选抗结核性脑膜炎药物的方法，包括：受精2天后的斑马鱼幼鱼通过后脑部位注射携带绿色荧光标记的海分枝杆菌Mm：wasabi构建斑马鱼结核性脑膜炎模型，模型构建成功后通过浸泡给药的方式给予不同的待筛选药物；给药一定时间后使用高内涵荧光显微镜对鱼全身进行绿色荧光通道下扫描，然后利用Image J软件对脑部绿色荧光信号强度进行定量分析比较，从而筛选出有效的抗结核性脑膜炎药物。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

目前常用的结核性脑膜炎动物模型，包括老鼠、兔子、黑猩猩等感染使用的都是结核分枝杆菌，需要在P3实验室中进行，要求的生物安全等级较高，且实验成本较高，操作也比较难；而斑马鱼感染所使用的海分枝杆菌，既能模拟结核分枝杆菌感染后宿主的病理特征，并且对人的致病性低，要求的生物安全等级也低，可在普通实验室操作；目前常用的结核性脑膜炎哺乳动物模型，在检测药物治疗效果时，金标准之一是取相应的动物组织匀浆后涂布固体平板检测克隆形成单位(CFU，colony forming unit)，操作复杂且实验周期长；而斑马鱼感染时可使用特定荧光标记的海分枝杆菌，药物作用后，可直接在荧光显微镜下进行活体拍照，通过定量特定荧光的信号强度的差异来比较药效。

附图说明

图1为通过在斑马鱼后脑部显微注射海分枝杆菌成功构建斑马鱼结核性脑膜炎模型；A:黑色箭头表示海分枝杆菌显微注射感染的部位(后脑)；B:斑马鱼后脑部感染1-4天后(dpi，days post infection)分别使用高内涵荧光显微镜对斑马鱼全身进行绿光和红光的扫描拍摄的代表性荧光图(图为1条鱼的代表性图)；C:统计1-4天感染后脑部有菌和脑部之外有菌分布的比率(总共20条鱼)；

图2为测定抗结核药物利福平(Rifampicin)和异烟肼(Isoniazide)体外对海分枝杆菌的最低抑菌浓度；A:采用微孔板有限稀释法测定抗结核药物利福平和异烟肼的MIC值的肉眼观察结果；B:测定结果：利福平的MIC为0.4μg/ml，异烟肼的MIC为50μg/ml；

图3为主总静脉给药测试抗结核药物利福平(Rifampicin)和异烟肼(Isoniazide)对斑马鱼脑部感染的海分枝杆菌杀伤效果的评比；A:实验流程示意图；B：受精5天后(药物作用两天后)各处理组鱼的代表性荧光图(右下角白色标记是药物的使用终浓度)；C:使用Image J软件对每条鱼脑部区域绿色荧光信号(绿色代表海分枝杆菌，菌量与信号强度成正比)进行定量分析，比较不同药物及不同药物浓度下对脑部细菌载量的影响；

图4为浸泡给药测试抗结核药物利福平(Rifampicin)和异烟肼(Isoniazide)对斑马鱼脑部感染的海分枝杆菌杀伤效果的评比；A:实验流程示意图；B：受精6天后(药物作用三天后)各处理组鱼的代表性荧光图(右下角白色标记是药物的使用终浓度)；C:使用ImageJ软件对每条鱼脑部区域绿色荧光信号(绿色代表海分枝杆菌，菌量与信号强度成正比)进行定量分析，比较不同药物及不同药物浓度下对脑部细菌载量的影响。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

实施例

(一)斑马鱼结核性脑膜炎模型的构建及结果评估

使用绿色荧光标记血管的转基因斑马鱼品系Tg(Fli1:GFP)(实验中共20条鱼)，通过后脑部位感染红色荧光标记的海分枝杆菌Mm：Tdtomato，感染1-4天后(dpi，days postinfection)分别使用高内涵荧光显微镜对所有感染的鱼全身进行绿光和红光的扫描拍摄，并统计1-4天感染后脑部有菌和脑部之外有菌分布的比率；注射部位如图1A箭头所示，图1B显示了显微镜拍摄的斑马鱼后脑显微注射海分枝杆菌后脑部海分枝杆菌动态变化情况，图1C显示了海分枝杆菌的分布情况，结果表明，感染后海分枝杆菌大部分局限在斑马鱼脑部区域，此模型方便用于后续药物作用后效果的评估。

(二)测定抗结核药物利福平(Rifampicin)和异烟肼(Isoniazide)体外对海分枝杆菌的最低抑菌浓度(MIC，minimum inhibition concentration)

采用微孔板有限稀释法测定抗结核药物利福平和异烟肼对海分枝杆菌(Mm：Wasabi菌株，表达绿色荧光)对海分枝杆菌的最低抑菌浓度，即MIC值，作用7天后肉眼观察无明显可见沉淀的最低药物浓度即为该药物的MIC值；测定结果为：利福平的MIC为0.4μg/ml，异烟肼的MIC为50μg/ml；结果如图2所示。体外MIC的测定为后续两种药物在体内作用的效果比较作为参考。

(三)主总静脉给药测试抗结核药物利福平(Rifampicin)和异烟肼(Isoniazide)对斑马鱼脑部感染的海分枝杆菌杀伤效果的评比

实验流程如图3A所示，受精2天后(dpf，days post fertilization)的幼鱼通过后脑部位感染海分枝杆菌Mm：wasabi(携带绿色荧光标记)，受精3天后幼鱼通过总主静脉注射抗结核药物利福平(RIF，rifampicin)和异烟肼(INH，Isoniazide)，受精5天后(药物作用两天后，药物剂量5～20μg/g是指每1g体重的鱼给药5～20μg)使用高内涵荧光显微镜对鱼全身进行绿色荧光通道下扫描，然后利用Image J软件对脑部绿色荧光信号强度进行定量分析比较；图3B为受精5天后(药物作用两天后)各处理组鱼的代表性荧光图(右下角白色标记是药物的使用终浓度)；图3C为使用Image J软件对每条鱼脑部区域绿色荧光信号(绿色代表海分枝杆菌，菌量与信号强度成正比)进行定量分析，比较不同药物及不同药物浓度下对脑部细菌载量的影响。

图3的结果表明，同等剂量作用条件下，异烟肼对脑部海分枝杆菌的杀伤能力显著高于利福平处理组，且异烟肼对海之分枝杆菌的MIC更高，说明要达到更好的杀菌效果，异烟肼需要更好的能够穿过血脑屏障进入脑部而发挥作用，这与临床的经验相一致(异烟肼可以更好的透过血脑屏障，而利福平进入脑部的能力较差)。表明斑马鱼海分枝杆菌脑部感染模型可以有效评估测定药物进入脑部发挥的能力。

(四)浸泡给药测试抗结核药物利福平(Rifampicin)和异烟肼(Isoniazide)对斑马鱼脑部感染的海分枝杆菌杀伤效果的评比

实验流程如图4A所示，受精2天后(dpf，days post fertilization)的幼鱼通过后脑部位感染海分枝杆菌Mm：wasabi(携带绿色荧光标记)，受精3-5天后幼鱼通过浸泡给药的方式予以抗结核药物利福平(RIF，rifampicin)和异烟肼(INH，Isoniazide)处理(每天换水并重新添加对应浓度的药物，药物浓度信息见右下角，如RIF 10μg/ml 25×MIC，指该处理组为RIF用药，终浓度10μg/ml，对应于25倍的MIC值)；受精6天后(药物作用三天后)使用高内涵荧光显微镜对鱼全身进行绿色荧光通道下扫描，然后利用Image J软件对脑部绿色荧光信号强度进行定量分析比较；图4B为受精6天后(药物作用三天后)各处理组鱼的代表性荧光图(右下角白色标记是药物的使用终浓度)；图4C为使用Image J软件对每条鱼脑部区域绿色荧光信号(绿色代表海分枝杆菌，菌量与信号强度成正比)进行定量分析，比较不同药物及不同药物浓度下对脑部细菌载量的影响。

图4的结果表明，同等MIC倍比浓度作用条件下，异烟肼对脑部海分枝杆菌的杀伤能力均显著高于利福平处理组，说明异烟肼能够更好的透过血脑屏障进入脑部而发挥作用，这与临床的认知相一致。表明斑马鱼海分枝杆菌脑部感染后通过浸泡给药可以高通量筛选可有效透过血脑屏障进入脑部发挥作用的潜在药物。

上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。