表征赤霉素含量的生物传感器、重组菌株和筛选赤霉素生产菌的方法

摘要

本发明涉及生物工程领域，公开了一种表征赤霉素含量的生物传感器、重组菌株和筛选赤霉素生产菌的方法。所述生物传感器含有P

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体地，涉及一种表征赤霉素含量的生物传感器，一种表征赤霉素含量的重组菌株和一种筛选赤霉素生产菌的方法。

背景技术

赤霉素，是调节植物生长发育不可缺少的植物激素之一，它能够调控包含种子萌发和发育在内的众多生理过程，对植物正常生长发育起着重要作用。

目前，传统的赤霉素检测方法包括酶联免疫吸附测定法和以高效液相色谱法(HPLC)为主的质谱(MS)检测法等；其中，酶联免疫吸附法以其温和的反应条件实现了被测物生物活性的保持，进而适合生物学效应研究；而质谱(MS)检测法凭借其较高的自动化程度，能够实现精确的定性定量分析。但是，酶联免疫吸附法因为需要进行半抗原和抗体的制备，所以工作量大、测定周期长，而且测定的效果不理想，重现性也较低；质谱(MS)检测法则具有赤霉素标品的购买困难且价格昂贵的缺点。因此，急需一种制备方法简单易行、测定周期短、测定效果理想的赤霉素检测方法。

微生物传感器与基因工程结合，能够对环境中的目标物质产生应答响应，进而激发一系列下游基因的表达，产生特定的能够被捕捉到的信号，从而完成检测。微生物传感器体积小，响应时间短，且其待测样品一般不需要预处理，能够大大缩短样品的测定周期；同时具有较强特异性的微生物传感器也满足了操作简单的需求。但是，目前还未有报道提供适用于赤霉素检测的微生物传感器。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的赤霉素检测方法复杂、测定周期长、测定效果不理想的问题，提供一种表征赤霉素含量的生物传感器、重组菌株和筛选赤霉素生产菌的方法，该生物传感器可实现对目标产物赤霉素的灵敏检测，使赤霉素浓度可视化，且检测方法简单易行。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种表征赤霉素含量的生物传感器，该生物传感器含有P

优选地，所述P

优选地，所述报告基因包括荧光基因。

优选地，所述荧光基因为GFP基因，所述GFP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

优选地，所述生物传感器还含有连接酶。

优选地，所述连接酶选自T4连接酶、大肠杆菌连接酶和热稳定DNA连接酶中的一种或多种。

优选地，所述生物传感器还含有载体。

优选地，所述载体为pCAMBIA3301质粒。

本发明第二方面提供一种表征赤霉素含量的重组菌株，该重组菌株含有上述的表征赤霉素含量的生物传感器。

本发明第三方面提供一种上述的重组菌株的构建方法，该构建方法包括以下步骤：

(1)将P

(2)将步骤(1)中构建的表征赤霉素含量的生物传感器导入出发菌株中。

优选地，所述出发菌株为大肠杆菌；优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明第四方面提供上述的生物传感器、上述的重组菌株和上述的方法构建得到的重组菌株中的至少一者在检测赤霉素含量和/或筛选赤霉素生产菌中的应用。

本发明第五方面提供一种高通量筛选赤霉素生产菌的方法，该方法包括以下步骤：将上述的生物传感器、上述的重组菌株和上述的方法构建得到的重组菌株中的至少一者，与待筛选菌株共包裹在同一液滴中，将所述液滴经培养后依据荧光信号分选出赤霉素产量高的赤霉素生产菌。

优选地，所述液滴采用微流控芯片形成，所述微流控芯片的内相为含有所述重组菌株和所述待筛选菌株的混合液，外相为含有表面活性剂的氟化油。

优选地，所述微流控芯片由玻璃毛细管、载玻片、盖玻片、点样针头和速干胶组装而成，其中，玻璃毛细管由外相毛细管和内相毛细管同轴嵌套组装而成。

通过上述技术方案，本发明的有益效果为：

本发明基于基因工程构成生物传感器，利用赤霉素受体蛋白(由GID1基因编码)能在体外与赤霉素进行特异性结合的特性，与受体蛋白基因GID1结合赤霉素后会抑制阻遏因子DELLA相配合，以使得报告基因的表达水平与赤霉素浓度相关联，通过共培养的液滴中报告基因信号由强转弱，不仅实现对目标产物赤霉素的灵敏检测，而且使赤霉素浓度检测结果可视化，检测过程简单易行。

进一步地，本发明提供的含有生物传感器的重组菌株，配合微流控芯片和便携化的荧光检测系统，即可通过检测重组菌株表达的绿色荧光蛋白的荧光信号，实现对目标产物赤霉素的灵敏检测，微流控芯片制备方法简单易行，测定周期短且测定效果理想。

本发明采用微流控检测芯片在检测腔室内固定含有生物传感器的重组菌株，通过扩大培养重组菌株可实现完成信号放大，增强了检测信号的强度，为利用荧光信号成像进行更加精准的检测分析提供基础。

附图说明

图1是本发明中微流控芯片的一种具体实施方式的实物图。

附图标记说明

a载玻片；          b点样针头；

c外相毛细管；      d内相毛细管。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供一种表征赤霉素含量的生物传感器，该生物传感器含有P

本发明利用赤霉素受体蛋白(由GID1基因编码)能在体外与赤霉素进行特异性结合的特性，与受体蛋白基因GID1结合赤霉素后会抑制阻遏因子DELLA相配合，而基于报告基因的启动子为P

本发明中，P

本发明中，所述报告基因可以为发光基因、荧光基因、显色基因等，也可以为荧光蛋白或酶等。优选地，所述报告基因包括荧光基因。

进一步优选地，所述荧光基因为GFP基因，所述GFP基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。发明人发现，在该优选的实施方式下，生物传感器包含受体蛋白基因GID，阻遏因子DELLA以及绿色荧光蛋白GFP，通过GFP基因的荧光强度变化，更加直观地反映赤霉素的浓度，有利于进一步提高对赤霉素检测的灵敏度。

根据本发明，优选地，所述P

根据本发明，为了便于将生物传感器导入重组菌株中进行转录表达，优选情况下，所述生物传感器还含有载体。所使用的“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选的表达载体为pCAMBIA3301质粒。重组载体构建可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶(如对于pCAMBIA3301质粒，可用Bam HI和Sma I等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段(含有P

根据本发明，优选地，所述生物传感器还含有连接酶。进一步优选地，所述连接酶选自T4连接酶、大肠杆菌连接酶和热稳定DNA连接酶中的一种或多种。发明人发现，在该优选的实施方式下，有利于提高生物传感器在检测过程中的表达稳定性，提高对赤霉素检测的准确性。

第二方面，本发明提供一种表征赤霉素含量的重组菌株，该重组菌株含有上述的表征赤霉素含量的生物传感器。

本发明提供的重组菌株的出发细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌，更优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌，比如可以为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明提供的重组菌株可以通过培养基培养的方式进行增殖，获得大量的重组菌株。示例性地，可将所述重组菌株先接种至含有卡那霉素的种子培养基I进行种子培养I得到种子液I，然后将所述种子液I接种至含有卡那霉素的发酵培养基I中进行发酵培养I得到发酵液I。

本发明中，接种至种子培养基I中的所述重组菌株可以选自新鲜制备的所述重组菌株或低温冻存的所述重组菌株(例如在甘油冻存管中冻存于-80℃冰箱中的重组菌株)。

本发明对种子培养I的方法没有特别的限制，只要通过该方法可以使所述重组菌株进行活化增殖即可。优选的情况下，重组菌株的种子培养基I可以采用含有40-60mg/L卡那霉素的LB液体培养基(LB液体培养基的组分为：胰蛋白胨8-12g/L，酵母提取物4-6g/L，NaCl 8-12g/L)。种子培养I所采用的温度、pH、转速、时间等参数，可以是本领域内的常规设置；优选地，所述种子培养I的条件包括：温度为35-40℃，转速为200-250rpm，时间为10-15h。

本发明中，所述发酵培养I的条件没有特别的限制，只要通过发酵培养I的过程可以使所述重组菌株大量增殖即可。优选地，重组菌株的发酵培养基I可以采用含有40-60mg/L卡那霉素的LB液体培养基(LB液体培养基的组分为：胰蛋白胨8-12g/L，酵母提取物4-6g/L，NaCl 8-12g/L)；通过发酵培养I使得发酵液I的OD控制在0.6左右，加入0.4-0.6mM IPTG诱导重组菌株中的赤霉素受体GID1的表达用以响应赤霉素，发酵10-50h得到发酵液I。

第三方面，本发明提供一种上述的重组菌株的构建方法，该构建方法包括以下步骤：

(1)将P

(2)将步骤(1)中构建的表征赤霉素含量的生物传感器导入出发菌株中。

本发明中，可采用本领域的常规方法将所述生物传感器导入出发菌株中，例如但不限于显微注射、基因枪、转化(例如电转化)、感染或转染。上述显微注射、基因枪、转化、感染或转染均为本领域常规操作。例如，转化是指通过采用分子生物学和基因工程中的一些已知方法处理细胞，使经处理后的细胞处于感受态，并由此与外源DNA接触，从而使外源DNA进入处于感受态的细胞中。常用的转化方法包括原生质体转化法、化学转化法和电穿孔转化法，转染是指通过CaCl

根据本发明，优选地，所述出发菌株为大肠杆菌；优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

第四方面，本发明提供上述的生物传感器、上述的重组菌株和上述的方法构建得到的重组菌株中的至少一者在检测赤霉素含量和/或筛选赤霉素生产菌中的应用。

本发明提供的生物传感器可以将赤霉素浓度与报告基因的信号强度联系起来，实现对赤霉素浓度的表征，通过联合荧光信号成像等方式，对报告基因的信号强度进行定性或者定量，进而实现对赤霉素浓度的定性或定量检测。

第五方面，本发明提供一种筛选赤霉素生产菌的方法，该方法包括以下步骤：将上述的生物传感器、上述的重组菌株和上述的方法构建得到的重组菌株中的至少一者，与待筛选菌株共包裹在同一液滴中，将所述液滴经培养后依据荧光信号分选出赤霉素产量高的赤霉素生产菌。

根据本发明，优选地，所述液滴采用微流控芯片形成，所述微流控芯片的内相为含有所述重组菌株和所述待筛选菌株的混合液，外相为含有表面活性剂的氟化油。

根据本发明，优选地，参见图1，所述微流控芯片包括玻璃毛细管组件、载玻片a和点样针头b，玻璃毛细管组件包括外相毛细管c和内相毛细管d，内相毛细管d的一端嵌套在外相毛细管c的一端内，外相毛细管c固定在载玻片a上；外相毛细管c与内相毛细管d的连接处与点样针头b密封连接，以使得点样针头b能够向外相毛细管c内输入外相。该微流控芯片为一种水包油O/W单乳液微流控芯片，使用时，外相从点样针头b输入外相毛细管c内，内相从内相毛细管d远离外相毛细管c的一端输入外相毛细管c内，形成外相包裹内相以封装单孢子的液滴。

本发明中，外相毛细管c固定在载玻片a上可以采用速干胶等胶体进行组装固定。为了进一步提升微流控芯片形成液滴的均匀性，优选情况下，将内相毛细管d与外相毛细管c进行同轴嵌套连接。

根据本发明，通过改变外相毛细管c与内相毛细管d的内径，或者通过改变内相与外相的流速，可以实现调节液滴和微球的大小。本发明中外相毛细管c与内相毛细管d可以商购获得，也可以利用乙炔喷灯拉制两种所需不同尺寸的玻璃毛细管。为了能够经微流控芯片形成尺寸较为均一的液滴，优选地，所述外相毛细管c的内径为300-400μm，所述内相毛细管d的内径为30-70μm。

根据本发明，优选地，所述外相的流速为3-8mL/h，所述内相的流速为0.1-0.5mL/h。外相与内相可以分别通过液泵(例如蠕动泵)以一定的流速泵入微流控芯片中，便于控制外相与内相的流速。

根据本发明，优选地，所述外相毛细管c采用经过疏水处理的玻璃管，所述疏水处理的疏水剂为三氯十八烷基硅烷(OTS)，以使得外相毛细管c的内壁具有疏水性，避免对液滴的形成产生不利的影响。具体地，可以采用蒸镀疏水方法对外相毛细管c进行疏水处理，示例性地，疏水过程为：将二氯甲烷和三氯十八烷基硅烷(OTS)按体积比100:1的比例混合配成疏水剂，将外相毛细管c与疏水剂共同放置在密闭容器中，随后置于65℃左右的烘箱中2h，重复此操作3-5次，将外相毛细管c干燥。对外相毛细管c进行充分疏水处理能够减少液滴与外相毛细管c的玻璃管壁间的粘性，提高液滴生成和长时间培养的稳定性。

根据本发明，优选地，所述表面活性剂为含氟表面活性剂；优选为Pico-SurfinFC40、FS-Kryjeff D900、EA表面活性剂和FS-008中的至少一种。在该优选的实施方式下，有利于提升外相对内相的包裹效果，且能够更好地与内相配合，提高液滴的形态稳定性。本发明中所述表面活性剂可以商购获得。

根据本发明，优选地，所述氟化油中所述表面活性剂的浓度为2-5wt％。在该优选的实施方式下，液滴在较长时间孵育中不易融合，有利于进一步提高液滴的稳定性。

本发明中，所述液滴的培养条件适于重组菌株和待筛选的赤霉素生产菌生长，优选情况下，赤霉素生产菌采用藤仓赤霉菌，所述液滴的培养条件包括：温度为28-32℃，时间为90-100h。

本发明中，待筛选的藤仓赤霉菌可以通过先接种到种子培养基II中进行种子培养II得到种子液II，再将种子液II按8-12体积％的接种量接种到发酵培养基II中进行发酵培养II得到发酵液II。其中，种子培养基II和发酵培养基II的组分可以分别含有：葡萄糖15-25g/L、蛋白胨15-25g/L和酵母膏8-12g/L，例如分别采用YPD培养基；种子培养II的条件包括：转速为200-250rpm，温度为25-30℃；发酵培养II的条件包括：转速为200-250rpm，温度为28-32℃。

本发明中，将上述重组菌株的发酵液I与藤仓赤霉菌的发酵液II进行混合，得到共混发酵液，作为所述微流控芯片的内相形成所述液滴。

根据本发明中筛选赤霉素生产菌的方法一种特别优选的具体实施方式，包括以下步骤：

(1)利用乙炔喷灯拉制两种不同尺寸的玻璃毛细管作为外相毛细管c和内相毛细管d，内相毛细管d的内径为30-70μm，外相毛细管c的内径为300-400μm，利用三氯十八烷基硅烷(OTS)采用蒸镀疏水方法对外相毛细管c作疏水处理(将二氯甲烷和三氯十八烷基硅烷(OTS)按体积比100:1的比例混合配成疏水剂，将该玻璃管和疏水剂共同放置在密闭容器中，随后置于65℃左右的烘箱中2h，重复此操作4次)，将内相毛细管d的一端同轴嵌套在外相毛细管c的一端内，外相毛细管c采用速干胶固定在载玻片a上，外相毛细管c与内相毛细管d的连接处与点样针头b密封连接，形成微流控芯片；

(2)选择添加Pico-Surfin FC40的氟化油(氟化油中Pico-Surfin FC40的含量为2-5wt％)作为外相，将含有重组菌株与待筛选的赤霉素生产菌的混合液作为内相；用注射器分别吸取内相、外相各1mL，外相的注射器安装在外相蠕动泵上，并通过聚乙烯管与点样针头b连接，将外相以3-8mL/h的流速从点样针头b输入外相毛细管c中，内相的注射器安装在内相蠕动泵上，并通过聚乙烯管与内相毛细管d远离外相毛细管c的一端连接，将内相以0.1-0.5mL/h的流速从内相毛细管d输入外相毛细管c中，对重组菌株与待筛选的赤霉素生产菌进行包埋形成液滴；

(3)将步骤(2)中的液滴收集于盛有过量上述外相的玻璃瓶中，随后在温度为28-32℃下静置培养90-100h，定时观察液滴内菌丝的生长状态，待生长状态适宜后进行以荧光强度为依据进行高通量筛选。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

下述实施例中，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。

以下实施例中，藤仓赤霉菌(Fusarium fujikuroi)NJtech 02由南京工业大学纪晓俊教授课题组提供，保藏编号为CCTCC NO:M 2015614，已在专利申请CN105441340A中公开；

YPD液体培养基的组分为：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L和酵母膏10g/L；

LB液体培养基的组分为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L。

实施例1生物传感器的构建

从藤仓赤霉菌(Fusarium fujikuroi)NJtech 02基因组进行PCR扩增得到P

重组载体pCAMBIA3301-Ptrc-GID1-P

PCR鉴定的反应体系：2×Taq Master Mix10μL，10mmol/L的正、反向引物(核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示)各1μL，100ng/μLDNA模板1μL，补ddH

PCR鉴定的程序设置：95℃5min，95℃30s；49℃30s，72℃1min，40个循环；72℃10min；

重组载体pCAMBIA3301-Ptrc-GID1-P

1BR-F：GTGGCATCGACTTCCTATA(SEQ ID NO：4)；

1BR-R：TAATTGCGGGACTCTAATC(SEQ ID NO：5)；

PCR鉴定为阳性则表明重组载体pCAMBIA3301-PtrcGID1-P

实施例2生物传感器对赤霉素的响应测试

将实施例1得到的重组大肠杆菌BL21(DE3)-pCAMBIA3301-Ptrc-GID1-P

标准工作液的配制：称取赤霉素标准品(购自深圳市安提生物科技有限公司，产品编号为AT01GAAg)0.35mg于100mL容量瓶中，用PBS溶解，定容到刻度线，并且超声10min，得到标准溶液；吸取上述10mL标准溶液至100mL容量瓶中，用PBS稀释至刻度得到混合中间液，以得到浓度梯度为10

将2mL重组大肠杆菌发酵液分别与100μL各个浓度的赤霉素标准工作液混合形成混合工作液，然后用多功能酶标仪测定各个混合工作液的荧光强度，设定激发波长为488nm、发射波长为520nm；将荧光强度与重组大肠杆菌发酵液的OD

结果显示，赤霉素浓度-荧光强度的关系曲线为y＝-115196.329x+689.74634，该生物传感器可在赤霉素浓度为30nM-100μM范围下表现良好的线性关系，随着赤霉素浓度的增加，含有该微生物传感器具有相应减弱的荧光强度。

实施例3

(1)将藤仓赤霉菌于YPD液体培养基中培养48h后，取OD

(2)利用乙炔喷灯拉制两种不同尺寸的玻璃毛细管作为外相毛细管c和内相毛细管d，内相毛细管d的内径为50μm，外相毛细管c的内径为350μm，利用三氯十八烷基硅烷(OTS)采用蒸镀疏水方法对外相毛细管c作疏水处理(将二氯甲烷和三氯十八烷基硅烷(OTS)按体积比100:1的比例混合配成疏水剂，将该玻璃管和疏水剂共同放置在密闭容器中，随后置于65℃左右的烘箱中2h，重复此操作4次)，将内相毛细管d的一端同轴嵌套在外相毛细管c的一端内，外相毛细管c采用速干胶固定在载玻片a上，外相毛细管c与内相毛细管d的连接处与点样针头b密封连接，形成微流控芯片；

(3)选择添加Pico-Surfin FC40的氟化油(氟化油中Pico-Surfin FC40的含量为3wt％)作为外相，将100μL实施例2中得到的重组大肠杆菌发酵液与900μL步骤(1)得到的藤仓赤霉菌突变体库菌株的培养液混合形成混合液作为内相；用注射器分别吸取内相、外相各1mL，外相的注射器安装在外相蠕动泵上，并通过聚乙烯管与点样针头b连接，将外相以5mL/h的流速从点样针头b输入外相毛细管c中，内相的注射器安装在内相蠕动泵上，并通过聚乙烯管与内相毛细管d远离外相毛细管c的一端连接，将内相以0.3mL/h的流速从内相毛细管d输入外相毛细管c中，对重组菌株与待筛选的赤霉素生产菌进行包埋形成液滴；

(4)将步骤(3)中的液滴收集于盛有过量上述外相的玻璃瓶中，随后在温度为30℃下静置培养96h，定时观察液滴内菌丝的生长状态，待生长状态适宜后，以多功能酶标仪测定荧光强度为依据进行高通量筛选，将获得的荧光强度与实施例2中绘制的赤霉素浓度-荧光强度的关系曲线进行对照，得出赤霉素浓度，以此筛选出高产赤霉素的菌株，命名为Fusarium fujikuroi MT162，其赤霉素的积累能力为2.8g/L，与未突变菌株相比较提高7倍以上。

通过上述实施例表明，本发明设计构建的生物传感器在高产菌株筛选中具有较好应用潜力，通过结合随机诱变和高通量筛选策略，可以快速高效的筛选获得赤霉素高产菌株。

对比例1

采用实施例3中步骤(1)得到的藤仓赤霉菌突变体库菌株的培养液以及实施例3中步骤(2)得到的微流控芯片进行赤霉素生产菌的筛选，将步骤(3)和步骤(4)替换为：

(3)选择添加Pico-Surfin FC40的氟化油(氟化油中Pico-Surfin FC40的含量为3wt％)作为外相，将50μM赤霉素化学检测剂(ELISA试剂盒，无锡市东林科技发展有限责任公司)与1mL步骤(1)得到的藤仓赤霉菌突变体库菌株的培养液混合形成混合液作为内相；用注射器分别吸取内相、外相各1mL，外相的注射器安装在外相蠕动泵上，并通过聚乙烯管与点样针头b连接，将外相以5mL/h的流速从点样针头b输入外相毛细管c中，内相的注射器安装在内相蠕动泵上，并通过聚乙烯管与内相毛细管d远离外相毛细管c的一端连接，将内相以0.3mL/h的流速从内相毛细管d输入外相毛细管c中，对重组菌株与待筛选的赤霉素生产菌进行包埋形成液滴；

(4)将步骤(3)中的液滴收集于盛有过量上述外相的玻璃瓶中，随后在温度为30℃下静置培养96h，定时观察液滴内菌丝的生长状态，待生长状态适宜后，以多功能酶标仪测定荧光强度为依据进行高通量筛选，将获得的荧光强度曲线，与赤霉素浓度-荧光显色剂的荧光强度的关系曲线(y＝228635x+3453)进行对照，得出赤霉素浓度，以此筛选出高产赤霉素的菌株，其赤霉素的积累能力为1.6g/L，与未突变菌株相比较提高约4倍，与实施例3获得的高产赤霉素的菌株Fusarium fujikuroi MT162相比，赤霉素产量降低42.8％。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。