钙依赖蛋白激酶基因GhCCAMK在植物抗黄萎病中的应用

摘要

本发明公开了钙依赖蛋白激酶基因GhCCAMK在植物抗黄萎病中的应用。属于基因工程技术领域。本发明利用GhCCAMK基因构建VIGS植物表达载体转化陆地棉TM‑1，获得的转基因棉花，在接种棉花黄萎病菌V991后表现出对黄萎病的抗性，说明GhCCAMK基因与棉花黄萎病的抗性高度相关。本发明为黄萎病抗性的分子机制研究、新的抗黄萎病植物新品种培育奠定了应用基础，同时也为新的抗病基因筛选及抗性植物培育提供了新的借鉴和参考。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及钙依赖蛋白激酶基因GhCCAMK在植物抗黄萎病中的应用。

背景技术

棉花黄萎病是由土壤丝状真菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的一种土传病害，因其发病迅猛，治愈困难，也被称为棉花的“癌症”。90年代以来，我国黄萎病蔓延迅速，在我国各棉区均有发生，常年造成我国棉花减产10％～20％，部分棉区减产可达70％，损失巨大，是制约我国棉花高产稳产的主要障碍之一。实践证明，培育棉花抗病品种是制约黄萎病蔓延的有效经济策略。由于现有品种资源普遍不抗病，种质资源匮乏，广谱性差等原因，育种家目前还没有培育出对棉花黄萎病具有优良抗性的栽培品种。近年来，以基因工程为基础的棉花抗黄萎病候选基因的发掘已经成为缓解黄萎病侵害的另一种策略，目前已经报道了GhSINAs、GhVLN2、GhSWEET42和GhTIFY9等一系列基因。

钙离子是植物细胞信号转导过程中的重要第二信使。当植物受到外界逆境胁迫时，细胞中的钙信号通过钙感应蛋白，如钙调素、类钙调素和钙依赖蛋白激酶(CDPK)等传递到下游成分，从而调节相关基因的表达。在植物中，细胞质中钙离子浓度的调节可以是对各种内源和外源信号的响应，包括激素水平的变化，非生物胁迫(如干旱、高、低温或光等)，生物胁迫(如病原体和致病微生物等)。植物中的钙离子传感器有五种，包括钙模式(CAM)、钙调制蛋白(CML)、钙离子B蛋白(CBL)、钙/钙调素依赖性蛋白激酶(CCAMK)和钙依赖蛋白激酶(CDPK)。Ca

CCAMK参与响应植物非生物胁迫过程。在拟南芥中，过表达TaCCAMK降低了种子萌发时期对ABA的敏感性，并且提高了种子萌发时期对盐胁迫的耐受性。在玉米中，ZmCCAMK通过磷酸化ZmNAC84进而参与ABA诱导的抗氧化防护过程。近期的研究发现，过表达ZmCCAMK和水稻CCAMK增强了植株的抗氧化防护能力，正调控玉米和水稻植株对干旱及氧化胁迫的耐受性。

综上，如何提供一种调控棉花黄萎病抗性的钙依赖蛋白激酶基因是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了钙依赖蛋白激酶基因GhCCAMK在植物抗黄萎病中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

钙依赖蛋白激酶基因GhCCAMK在调控植物抗黄萎病中的应用，所述基因GhCCAMK的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

ATGGGACAAGATAAAGCGAAACTAGTAGAAGAATACGAAATCCTAGATATACTAGGACGAGGTGGATTCTCAGTCGTAAGAAAAGGTATAAAAAGAAAGAACGGATCAGATCATGAGAAAACACAAGTCGCCATTAAAACACTGAAACGATTCGGAACGACGCCGTCACCAGCTCGAGTCGAGAAAACAATTGCTTCGATGGCGGCGTTATTGCCGACGCGTAACCAGGTTTCCATCTCTGACGCGCTGTTGACGAACGAGATCCTCGTCATGAGGAAGATCGTCGAGAACGTTTCGCCGCATCCGAACGTGATCGATCTCTACGACGTTTACGAAGATCAAGCCGGGGTTCATTTGGTGCTGGAATTGTGCTCCGGCGGGGAGTTGTTCGATCGGATAGTGGCGGAAACACGGTACTCGGAAGCCGGTGCGGCAGCGGTGGTACGGCAGATCGCGGGAGGATTAGCGGCGATCCATAAGGCGAACATTGTTCATAGAGATCTGAAACCGGAGAACTGCTTGTTCTTGAATAAAAATAAAGATTCAACGTTGAAGATCATGGACTTTGGATTGAGTTCGGTGGAAGAATTTACGGATCCGGTTATCGGGTTGTTTGGATCCATAGATTATGTTTCACCTGAGGCGCTTTCTCAGGGGCAAATCACAGCAAAGAGCGATATGTGGTCTTTGGGTGTCATCTTATTCATCTTGCTTTCGGGGTATCCACCATTTATTGCTCAATCTAATCGTCAGAAACAACAGATGATAATGGCTGGAGAATACAATTTCGATGAGAGGACATGGAAAAACATTTCTTCATCAGCAAAGCATTTGATTTCTAATCTGTTGCAAGTTGATCCTGATAGAAGACCTAGTGCTGAACAACTTCTAGCTCATCCATGGGTCATCGGGGATTCAGCAAAGCAAGAACAAATAGATGCGGAGGTTGTTTCCAGATTGCAGAGTTTTAACGCGCGTCGTAAGCTACGTGCTGCCGCCATAGCCAGTGTGTTGAGCAGCAAGGTTTTACTAAGGACGAAGAGGTTAAGAAGTTTGCTTGGCTCCCATGACCTTTCAAAGGACGAAATTGATAACCTCAAGTCGAACTTTAAGAAAATATGTGCTAACGGTGACAATGCTACTTTACCCGAATTTGAGGAGGTGCTAAAAGCAATGAACATGTCTTCACTACTTCCTTTGGCTACTCGTATCTTTGACCTATTCGATAGCAATCGAGATGGTACTGTTGATATGAGAGAAATTGTGTGTGGATTTTCCAGTCTTAAGAATTCTAAAGGAGATGACGCTCTTCGCCTGTGCTTCGAGATGTATGATACAGATCGATCTGGATGCATTACTAAAGAAGAACTAGCATCAATGTTAAGAGCATTGCCCGATGACTGTCTTCCACCAGATATTACAGAACCTGGAAAGTTAGATGAAATATTCGATCGAATGGATGCAAACAGTGATGGGAAGGTTACGTTCGAAGAATTTAAGGATGCCATGCAAAGAGACAGCTCTCTCCAAGACGTAGTCCTCTCTTCTCTTCGACAACAGTAA，SEQ ID NO：1。

蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质在植物抗黄萎病中的应用，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

MGQDKAKLVEEYEILDILGRGGFSVVRKGIKRKNGSDHEKTQVAIKTLKRFGTTPSPARVEKTIASMAALLPTRNQVSISDALLTNEILVMRKIVENVSPHPNVIDLYDVYEDQAGVHLVLELCSGGELFDRIVAETRYSEAGAAAVVRQIAGGLAAIHKANIVHRDLKPENCLFLNKNKDSTLKIMDFGLSSVEEFTDPVIGLFGSIDYVSPEALSQGQITAKSDMWSLGVILFILLSGYPPFIAQSNRQKQQMIMAGEYNFDERTWKNISSSAKHLISNLLQVDPDRRPSAEQLLAHPWVIGDSAKQEQIDAEVVSRLQSFNARRKLRAAAIASVLSSKVLLRTKRLRSLLGSHDLSKDEIDNLKSNFKKICANGDNATLPEFEEVLKAMNMSSLLPLATRIFDLFDSNRDGTVDMREIVCGFSSLKNSKGDDALRLCFEMYDTDRSGCITKEELASMLRALPDDCLPPDITEPGKLDEIFDRMDANSDGKVTFEEFKDAMQRDSSLQDVVLSSLRQQ*，SEQID NO：2。

上述基因GhCCAMK或上述蛋白质相关的生物材料在植物抗黄萎病中的应用，所述生物材料为以下任意一种：

A：核苷酸序列如上述的核酸分子或编码上述蛋白质的核酸分子；

B：含有A所述核酸分子沉默的表达盒；

C：含有A所述核酸分子的表达载体、或含有B所述表达盒的重组载体；

D：含有A所述核酸分子的重组微生物、或含有B所述表达盒的重组微生物、或含有C所述重组载体的重组微生物。

术语“表达盒”是指能够在宿主细胞中表达上述应用中所述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动蛋白编码基因转录的启动子，还可包括终止蛋白编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

进一步的，上述基因GhCCAMK或上述蛋白质相关的生物材料在选育黄萎病抗病性增强或减弱的植物品种中的应用。

进一步的，上述基因GhCCAMK或上述蛋白质相关的生物材料在植物育种中的应用。

进一步的，所述植物为棉属植物。

进一步的，所述植物为棉花。

进一步的，所述植物为陆地棉TM-1。

一种提高植物抗黄萎病的方法，通过沉默或抑制植物中上述基因GhCCAMK的表达或上述蛋白质的活性来提高植物抗黄萎病的能力。

上述沉默或抑制植物中所述蛋白编码基因的表达量可采用现有技术中的任何方式实现，以使基因产生缺失突变、插入突变或碱基变换突变，进而实现基因功能降低或丧失。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明利用GhCCAMK基因序列信息扩增该基因，并构建VIGS植物表达载体转化陆地棉TM-1，获得的转基因棉花，在接种棉花黄萎病菌V991后表现出对黄萎病的抗性，说明GhCCAMK基因与棉花黄萎病的抗性高度相关。本发明为黄萎病抗性的分子机制研究、新的抗黄萎病植物新品种培育奠定了应用基础，同时也为新的抗病基因筛选及抗性植物培育提供了新的借鉴和参考。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例1中GhCCAMK基因PCR产物电泳图，其中Marker为2000bpLadderMarker；

图2附图为本发明实施例2中GhCCAMK基因在不同棉花组织(根、茎、叶、花瓣、苞片、萼片)中表达量的qRT-PCR结果；

图3附图为本发明实施例2中信号分子(茉莉酸JA、水杨酸SA、H

图4附图为本发明实施例2中黄萎病菌V991浸染诱导GhCCAMK基因表达模式的qRT-PCR分析结果；

图5附图为本发明实施例3中注射VIGS载体后的陆地棉TM-1植株表型图，其中：A为注射GhCLA1基因的VIGS载体2周后植株表型；B为陆地棉TM-1的TRV:00(对照)和TRV:GhCCAMK用蘸根法接种黄萎病菌V991孢子液(10

图6附图为本发明实施例3中GhCCAMK基因在陆地棉TM-1的TRV:00和TRV:GhCCAMK植株三叶期叶片中表达量的qRT-PCR结果；

图7附图为本发明实施例3中转基因陆地棉TM-1接种黄萎病菌后的病情指数统计结果；

图8附图为本发明实施例3中VIGS干扰陆地棉TM-1植株对黄萎病菌的抗性分析结果之沉默植株和对照植株棉花茎秆纵切图；

图9附图为本发明实施例3中VIGS干扰陆地棉TM-1植株对黄萎病菌的抗性分析结果之沉默植株与对照植株表面消毒的茎段进行真菌恢复实验结果比较；

图10附图为本发明实施例3中VIGS干扰陆地棉TM-1植株对黄萎病菌的抗性分析结果之沉默植株与对照植株的棉花黄萎病菌复原率统计结果；

图11附图为本发明实施例3中VIGS干扰陆地棉TM-1植株对黄萎病菌的抗性分析结果之沉默植株与对照植株的棉花茎段黄萎病菌DNA相对丰度。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

棉花材料包括：

陆地棉TM-1，由中国农业科学院棉花研究所提供；

植物VIGS沉默表达载体：

黄萎病菌V991：本实验室保存，公众可以从新疆农业科学院核技术生物技术研究所(新疆维吾尔自治区生物技术研究中心)获得；

引物序列：均由上海生工合成提供；

其他生物材料包括：大肠杆菌菌种DH5α、农杆菌菌种GV3101、BP反应入门载体、VIGS干涉技术载体pTRV1和pTRV2等均属于商品化菌株或载体，不再赘述；

实验试剂：质粒提取试剂盒、oligo(dT)18、RNAase抑制剂、dNTP、pMD18-T Vector、T4-DNA连接酶、内切酶EcoRI和KpnI、ExTaq酶、PCR产物回收试剂盒等均为TaKaRa公司产品，荧光定量PCR试剂盒为TOYOBO公司产品；

荧光定量PCR专用板为Labwares公司产品；

RNA提取试剂盒购自TIANGEN(Beijing，China)公司；

所用培养基及溶液：LB液体(固体)培养基、YEP液体(固体)培养基、察氏(Czapek)培养基、PDA培养基、50×TAE Buffer(Na

其他未描述的抗生素、激素类等试剂均为本领域常用试剂，不再赘述。

实施例1

陆地棉GhCCAMK基因的获得

种植陆地棉TM-1，提取棉花幼苗叶片的RNA，并进行反转录获得cDNA；

RNA提取步骤参考TIANGEN植物RNA快速提取试剂盒，反转录体系如表1：

表1反转录体系

执行程序：42℃30min，85℃5s。

以CottonFGD网站(https://cottonfgd.org)中ID号为Gh_D06G1869基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)的cDNA为模板，设计引物并进行基因的扩增，引物序列为：

GhCCAMK-F:5’-ATGGGACAAGATAAAGCGAAAC-3’，SEQ ID NO：3；

GhCCAMK-R:5’-TTACTGTTGTCGAAGAGAAGAGAG-3’，SEQ ID NO：4。

PCR扩增体系如表2：

表2PCR扩增体系

PCR扩增程序：95℃2min；95℃20s，56℃30s，72℃120s，35个循环；72℃7min。

对PCR电泳产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。从图1中可以看出，基因GhCCAMK大小约为1563bp。

实施例2

1、自然条件下GhCCAMK基因的组织表达模式

分别在棉花盛花期取棉花的叶片、根、茎、花、萼片、苞片，提取其RNA，并使用反转录试剂盒获得cDNA，采用如下定量PCR引物进行qPCR扩增：

QRT-PCR-GhCCAMKF:5’-GGCGATCCATAAGGCGAACA-3’，SEQ ID NO：5；

QRT-PCR-GhCCAMKR:5’-CTCTTTGCTGTGATTTGCCCC-3’，SEQ ID NO：6。

内参基因选用泛素蛋白7(Ubiquitin7，UB7)，引物序列设计如下：

UBQ7F:5’-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3’，SEQ ID NO：7；

UBQ7R:5’-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3’，SEQ ID NO：8。

qRT-PCR是在ABI 7500Real-time PCR序列检测系统和软件(AppliedBiosystems，USA)上进行的。

20μL反应体系设计如下：

反应体系为10μLSYBR Green Realtime PCR Master Mix，1μL cDNA产物，上下游引物各0.4μL(10μM)，Nuclease-free Water补充至反应总体积为20μL。每个基因4个技术重复。

对应的程序为：

定量程序为94℃30s；95℃5s，57℃15s，72℃31s，40个循环。

40个循环后扩增产物的特异性用溶解曲线分析检测。每个反应都包括了至少三个重复。用单一模板稀释至不同浓度，通过模板稀释倍数的log值对每个稀释样品的Ct值作图检测引物扩增效率。

检测结果如图2所示，分析表明GhCCAMK基因在棉花所有组织中均有表达，但转录水平存在显著差异，其中该基因在叶和苞片中的表达高于其它组织，其次是茎；在根、花和萼片中的表达水平显著低于其它组织，花中的转录水平略高于根和萼片。

2、受信号分子胁迫(茉莉酸JA、水杨酸SA、H

将TM-1棉花种子水中浸泡24h后播种于营养土中，12h光照/12h黑暗，温度为26～28℃光照培养。湿度保持在60％及以上，4～5d浇一次水，在幼苗两叶一心时选取长势及大小一致的棉苗，分别用200μM茉莉酸、2mM水杨酸、1mM H

qRT-PCR分析相关引物及PCR反应程序同本实施例第1部分“自然情况下基因GhCCAMK的组织表达模式”。

qRT-PCR的检测结果如图3所示，GhCCAMK的表达量在JA和H

3、黄萎病菌浸染情况下GhCCAMK的表达模式

选取两叶一心的陆地棉TM-1进行伤根，所用的黄萎病菌V991分生孢子液浓度为1×10

qRT-PCR分析相关引物及PCR反应程序同本实施例第1部分“自然情况下基因GhCCAMK的组织表达模式”。

qRT-PCR的检测结果如图4所示，黄萎病菌V991分生孢子液处理后，GhCCAMK的表达量在接种黄萎病病原菌2h后，显著性下调，48h后表达量趋于最低。水处理时在0.5小时后，显著性下调。此结果表明，在陆地棉TM-1的根系被黄萎病菌浸染后，基因GhCCAMK的表达量变化明显。

实施例3

利用VIGS技术构建VIGS干涉载体，使基因GhCCAMK沉默。观察基因沉默后棉花对黄萎病菌浸染时的表型变化，进一步证明，基因GhCCAMK与黄萎病抗性高度相关。

1、重组表达载体的构建

(1)引物设计和PCR扩增

在基因GhCCAMK的非保守区段设计引物，引物设计原则为：在上游引物加上限制性酶EcoRI的酶切位点和保护碱基，在下游引物加上限制性酶KpnI的酶切位点和保护碱基，设计的引物如下：

GhCCAMK-1F:5’-CGGAATTCTTGGTGCTGGAATTGTGCTC-3’，SEQ ID NO：9；

GhCCAMK-1R:5’-GGGGTACCCTTTGCTGTGATTTGCCCCT-3’，SEQ ID NO：10。

提取陆地棉TM-1的总RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用引物GhCCAMK-1F和引物GhCCAMK-1R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR扩增体系如表3：

表3PCR扩增体系

PCR扩增程序：95℃2min；95℃20s，52℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。

PCR扩增目标序列(约318bp)；扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

(2)测序后获得重组表达载体

胶回收PCR扩增产物，与pEASY-Blunt Zero Cloning Kit(克隆载体)连接，用GhCCAMK-1F/R引物经PCR鉴定后的阳性转化子送测序。

选择测序成功的阳性转化子提取质粒，将质粒和空载体pTRV2，分别用酶EcoRI和酶KpnI在37℃水浴的条件下进行双酶切，酶切体系如表4：

表4酶切体系

酶切程序：37℃1h；80℃10min。

酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并利用T4 DNA连接酶进行连接，植物表达载体重组质粒TRV2-GhCCAMK转化农杆菌GV3101，用GhCCAMK-1F/R引物经PCR筛选鉴定后，获得VIGS干涉载体TRV2:GhCCAMK。

2、转基因棉花的获得

(1)菌液培养

将pTRV1、TRV2-GhCCAMK分别转化农杆菌，在含卡那霉素(50μg·mL

(2)重悬液获得

4000rpm离心5min收集菌体细胞，以适当体积的重悬液(配方：10mmol·L

含有pTRV1载体的重悬液和含有目的基因片段的重组质粒TRV2-GhCCAMK的重悬液按体积比1:1混匀为TRV:GhCCAMK溶液注射棉花子叶，用于获得基因沉默转化株；含有pTRV1载体的重悬液和含有GhCLA1基因片段的TRV2-GhCLA1载体的重悬液按体积比1:1混匀为TRV:GhCLA1溶液注射棉花子叶，用于检测基因沉默体系是否正确；含有pTRV1载体的重悬液和含有pTRV2空载体的重悬液按体积比1:1混匀为TRV:00溶液注射棉花子叶，用于做遗传转化对照株。

(3)受体培养

TM-1棉花种子水中浸泡24h后播种于营养土中，12h光照/12h黑暗，温度为26～28℃光照培养。湿度保持在60％及以上，4～5d浇一次水，待两片子叶平展开且真叶尚未发育时即可用于VIGS操作。

(4)GhCCAMK基因沉默转化株的获得

先用注射器针头轻轻刺破子叶背面造成微伤口，用去针头的注射器从伤口处注入上述(2)中准备好的按照体积比1:1混匀的重悬液，获得棉花GhCCAMK基因沉默转化株。避光24h，12h光照/12h黑暗，温度为26～28℃光照培养。

用类似的方法获得GhCLA1基因沉默检测株和pTRV2空载体遗传转化对照株。

农杆菌VIGS具体方法参考文献：Gao,X.,Shan,L.Functional genomic anal ysisofcotton genes with agrobacterium-mediated virus-induced genesilencing.Methods Mol Biol,2013,975:157-165.

3、VIGS遗传转化体系的检测

(1)2周后观察不同处理棉花的表型，采用陆地棉GhCLA1基因(cloroplastosalterados 1gene)为标记基因进行VIGS体系检测。该基因参与叶绿体发育过程，编码1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase蛋白，进化中高度保守，GhCLA1基因沉默后棉株有明显的白化表型，是易于识别的标记性状。如图5所示，VIGS侵染2周后，注射TRV1和TRV2-GhCLA1的植株真叶几乎完全白化(图5A)，而注射空载体pTRV1和pTRV2为对照(TRV:00)的叶片没有任何变化(图5B TRV:00)。说明在陆地棉TM-1中成功建立了TRV介导的VIGS体系。

(2)荧光定量Real time-PCR检测

取处理棉花叶片提取RNA(最好是新长的真叶)，然后进行qRT-PCR，检测目标基因是否被降低表达，并检测目的基因的表达情况。对每种材料处理30个单株。

利用RNA提取试剂盒提取VIGS浸染棉花植株叶片的总RNA。以棉花UBQ7为内参基因，通过荧光定量Real time-PCR检测沉默后GhCCAMK基因的被干扰沉默的表达情况。

qRT-PCR分析相关引物及PCR反应程序参考实施例2第1部分“自然情况下基因GhCCAMK的组织表达模式”。

qRT-PCR结果如图6所示，与空载体(TRV:00)对照相比，在随机选取的GhCCAMK基因VIGS浸染植株中，GhCCAMK基因的表达量显著的下降，沉默效果明显。

4、棉花抗黄萎病接种及抗性鉴定

(1)接种棉花黄萎病菌

将保存的黄萎病致病菌大丽轮枝菌菌株V991在PDA培养基上进行活化。挑取的菌体于Czapek培养液中，25℃，200rpm，培养3～5d。将病原菌培养液用4层纱布过滤，利用血球计数板统计病原菌浓度，用灭菌双蒸水调整终浓度至1.0×10

(2)黄萎病发病情况统计

待真叶开始出现变黄、萎蔫时调查统计黄萎病发病情况，采用0～4级方法统计病级。对每种材料处理30个单株。设3个生物学重复。

病级指数统计参考文献：徐理,朱龙付,张献龙.棉花抗黄萎病机制研究进展.作物学报,2012,38:1553–1560；Xu L,Zhu L F,Zhang X L.Research on resistancemechanism ofcotton to Verticillium wilt.ActaAgron Sin,2012,38:1553–1560.

病情指数＝[(各级病株数×相应病级)/调查总株数×发病最高病级(4)]×100

试验结果统计：对VIGS侵染2周后的TRV:GhCCAMK的沉默植株相比空载体的对照(TRV:00)植株，接种大丽轮枝菌菌株V991，21d后黄萎病的发病情况。由附图5B可见，对照(TRV:00)植株与GhCCAMK基因沉默株相比叶片出现浅黄色斑块更多且面积更大，叶缘向下卷曲程度更明显。通过3次生物学重复观察统计分析，病情指数结果如图7所示，注射空载体的对照植株，其平均病情指数达72％，而GhCCAMK基因沉默后的植株抗病性显著增强，其平均病情指数为56％。表明GhCCAMK基因参与了黄萎病诱导的过敏反应。在陆地棉TM-1中沉默GhCCAMK基因后，在受到黄萎病病菌浸染时，棉花的发病率和病指明显降低，说明GhCCAMK基因的沉默提高了棉花对黄萎病的抗性。

(3)GhCCAMK基因参与黄萎病诱导的过敏反应的验证

为了验证上述表型结果的准确性，本发明继续做了黄萎病菌恢复培养实验、病植剖杆处理和植株黄萎病菌DNA相对丰度检测。

黄萎病菌恢复培养实验方法为：用剪刀将经黄萎病处理后21d的棉花幼苗距子叶6cm处的茎剪成1cm长的片段，用75％酒精浸泡1min，再用30％双氧水浸泡30min后用无菌水冲洗4～5次，最后将处理后的棉花茎片段放置于PDA培养基上25℃条件下培养3d，即可观察黄萎病菌恢复培养的生长状况。

病植剖杆处理方法为：取若干经黄萎病菌接种后21d的棉花茎秆，用锋利刀片对其进行纵切，暴露出其纵切面，观察茎秆的维管束组织的表型，若茎秆维管束组织为褐色即表示已感染黄萎病菌并发病，若茎秆维管束组织无褐色而表型正常即表示未发病。

植株黄萎病菌DNA相对丰度方法为：提取黄萎病处理后的棉花幼苗的茎的RNA，反转为cDNA后进行qPCR扩增。

所用引物为：

ITS1-F:5’-AAAGTTTTAATGGTTCGCTAAGA-3’，SEQ ID NO：11；

ST-VE1-R:5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’，SEQ ID NO：12。

反转录及qPCR反应程序条件和程序参考实施例2第1部分“自然情况下基因GhCCAMK的组织表达模式”。

实验结果如图8～图11所示，茎秆纵切后发现，注射空载体的对照植株的茎秆维管束变成淡褐色，而GhCCAMK基因沉默后的植株的茎秆维管束为正常色，TRV:GhCCAMK植株材料的剖杆材料褐化程度要低于注射空载体的TRV:00对照植株材料(图8)；TRV:GhCCAMK植株材料在PDA培养基中培养出来的黄萎病菌菌落要少于TRV:00植株材料(图9)；TRV:00对照植株的黄萎病菌复原率达83％，而TRV:GhCCAMK基因沉默后的植株黄萎病菌复原率达27％(图10)；TRV:00植株黄萎病菌DNA相对丰度为TRV:GhCCAMK基因沉默后的植株的3倍左右(附图11)。

这些结果同样表明在沉默GhCCAMK基因后，棉花对黄萎病菌的抗性提高，表明GhCCAMK基因参与调控黄萎病的抗性。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。