一种自身免疫性肝炎小鼠模型的创建方法及应用

摘要

本发明公开了一种自身免疫性肝炎小鼠模型的创建方法及应用，涉及医学研究领域，解决了现有技术中，自身免疫性肝炎小鼠模型创建成功率低、创建步骤复杂的问题，其技术方案要点是：一种自身免疫性肝炎小鼠模型的创建方法，包括单次向小鼠体内注射AAV8‑CYP2D6腺相关病毒的步骤。达到操作简单，感染效率高，造模成功率高的目的。

说明书

技术领域

本发明涉及医学研究领域，更具体地说，它涉及一种自身免疫性肝炎小鼠模型的创建方法及应用。

背景技术

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)是由自身免疫反应介导的慢性进行性肝脏炎症性疾病，在欧美国家更为多见，我国AIH的发病率尚无具体统计数据，但近年报道的病例数量显著增多。AIH的发病机制尚未完全阐明，缺乏理想的动物模型是不可忽视的原因之一。1992年，Tiegs等首次利用刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)在小鼠中成功建立了T细胞依赖的实验性肝损伤动物模型。但此模型是一个急性肝损伤模型，小鼠体内未能出现自身抗体和肝脏纤维化，故并不能模拟AIH发病的慢性过程。细胞色素P450 2D6(cytochrome P450 2D6,CYP2D6)是人自身免疫性肝炎的一个已知的自身抗原。识别CYP2D6的抗体是抗LKM-1抗体(AIH患者体内的一种标志性抗体)。2008年Holdener等人采用人CYP2D6的腺病毒表达载体(Ad-CYP2D6)建立小鼠AIH模型(J Exp Med.2008；205(6):1409-1422)，但由于腺病毒的不稳定性以及单次注射的脱靶效应导致此模型重复性不高，代表性欠缺，尚有争议(JAutoimmun.2017Mar；78:39-45)。目前国内外尚无理想的慢性AIH动物模型。专利202111553602.6公开了一种自身免疫性肝炎动物模型的创建方法，采用多次注射CYP2D6裸质粒的方式，诱导小鼠产生自身免疫性肝炎，但该方式要求多次频繁注射质粒，易诱发小鼠心衰导致造模失败，且CYP2D6的表达可能在小鼠体内的任意部位，因此模型创建的不确定性因素较多。

发明内容

本发明的目的是提供一种自身免疫性肝炎小鼠模型的创建方法，采用AAV8-CYP2D6腺相关病毒感染小鼠，单次注射即可实现建模。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种自身免疫性肝炎小鼠模型的创建方法，包括向小鼠体内注射AAV8-CYP2D6腺相关病毒的步骤；所述注射次数为1次。

进一步的，所述AAV8-CYP2D6腺相关病毒基因序列中包含肝脏特异性启动子。

进一步的，所述肝脏特异性启动子为ApoE/hAAT或TBG。

进一步的，所述的注射方式为尾静脉注射。

进一步的，所述AAV8-CYP2D6腺相关病毒滴度不低于1×10

进一步的，所述小鼠为6至8周雄性C57/BL6小鼠。

本发明还提供了一种上文所述的创建方法获得的自身免疫性肝炎小鼠模型在筛选、预防或治疗自身免疫性肝炎的药物中的应用。

有益效果：

1、采用AAV8作为病毒载体，其靶向肝脏转染，感染效率较高，可以增加模型构建的成功率。

2、仅需一次注射即可有较高的成功率构建小鼠模型，无须频繁地进行注射操作，减少了小鼠注射相关并发症例如叠加急性肝炎或因注射所致小鼠心衰死亡，减轻了科研人员的工作量。

3、将AAV8-CYP2D6腺相关病毒加入肝脏特异性启动子，可以使CYP2D6锚定肝脏持续稳定地表达，造模成功率高，试验难度低。也可以防止其他组织表达对肝脏炎症本身的干扰。

附图说明

图1～图13是小鼠模型自身免疫性肝炎发生的验证结果。

图14是GV651载体图谱。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1：

如图1所示，本实施例提供了一种自身免疫性肝炎小鼠模型的创建方法。利用腺相关病毒(AAV)作为载体，嵌入肝细胞启动子序列的人细胞色素P4502D6(cytochrome P4502D6，CYP2D6)基因，通过尾静脉注射的方式，实现锚定肝细胞过表达CYP2D6基因，使之在肝脏持续过表达，动态检测小鼠血清转氨酶、自身抗体以及肝脏病理情况，结果显示：1、模型鼠血清中转氨酶ALT、AST升高；2、7周时模型小鼠血清中出现自身抗体；3、7周时模型鼠肝脏切片HE染色可见界面性慢性炎症、玫瑰花环、淋巴细胞穿入等AIH特征性病理改变；4、小鼠肝脏炎症呈慢性并随着时间进展逐渐加重；5、8周时小鼠肝脏出现明显的纤维化。这些结果表明，此动物模型可以模拟AIH体内的发生发展过程，具有明确的组织学和血清学特征、炎症持久、且发生进行性的肝纤维化，故可以模拟AIH体内的发生发展过程，能够作为AIH的新型有效研究工具，解决当今AIH研究无动物模型的瓶颈问题。

具体步骤如下：

1、取6-8周雄性C57/BL6小鼠尾静脉注射AAV8-CYP2D6腺相关病毒。病毒滴度为1×10

C57/BL6小鼠采购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

AAV8-CYP2D6腺相关病毒采购于上海吉凯基因科技有限公司。该AAV8-CYP2D6腺相关病毒基因序列中包含ApoE/hAAT肝脏特异性启动子。在其他可能的实施例中基因序列中包含的肝脏特异性启动子为TBG。

2、从注射之日开始算起，3周牺牲小鼠，取小鼠肝脏组织避光冰冻切片，免疫荧光显微镜下观察冰冻组织切片eGFP荧光亮度。如图2所示提示CYP2D6成功转入肝细胞内表达。

3、从注射之日开始算起，3周牺牲小鼠，取小鼠肝脏组织研磨，提取RNA及蛋白质，PCR(图3)验证mRNA层面，Western blot(图4)验证蛋白层面转染效率。转染效率好，mRNA及蛋白水平均高于正常对照组2-3倍。

4、注射之日开始算起，7周、8周、9周牺牲小鼠取小鼠血清，免疫大鼠肝脏组织，观察自身抗体产生，7周时小鼠血清内出现自身抗体，随着时间延长自身抗体表达量逐步增加(图5)。间接Elisa法检测自身抗体滴度变化，显示自身抗体滴度随着时间进展逐渐升高(图6)。

5、注射之日开始算起，7周、8周、9周牺牲小鼠，取小鼠血清，试剂盒检测表明小鼠血清转氨酶AST(图7)，ALT(图8)升高，提示肝细胞破坏，肝脏炎症产生。

6、注射之日开始算起，7周、8周、9周牺牲小鼠，取小鼠肝脏组织切片石蜡包埋：HE染色鉴定AIH特征性病理(玫瑰花环、淋巴细胞侵入、界面性肝炎)(图9)的产生；随着时间推移肝脏淋巴细胞浸润逐渐增多，肝脏炎症逐渐加重(图10、图11)。

7、注射之日开始算起，8周时AIH小鼠肝脏天狼猩红染色可见明显散在红色胶原纤维，提示轻中度纤维化的发生；9周时AIH小鼠肝脏天狼星红染色可见显著红色胶原纤维增生，提示肝脏纤维化的进一步进展(图12、图13)。

本申请所述的方法可以成功建立稳定且可重复的AIH动物模型，该AIH小鼠模型通过一次尾静脉注射腺相关病毒，可产生自身抗体，并具有明确的组织学和血清学特征、炎症持久且发生进行性的肝纤维化，故可以模拟人体AIH体内的发生发展过程，能够作为AIH的有效研究工具，可以说从根本上解决了目前AIH领域缺乏可靠慢性动物模型的难题。

选择AAV作为过表达的载体具有如下优势：

高水平表达，且无致病性，已通过欧盟和FDA许可用作基因治疗药物的载体。

适合于本模型的表达，排除病毒本身对肝脏致病性的干扰。

AAV8为肝脏、肌肉、眼、神经系统的特异性血清型，为实现肝脏特异性过表达人源性CYP2D6抗原，避免其他器官组织的影响提供了可能。

选择ApoE/hAAT作为肝脏特异性启动子整合到构建的载体中，实现了锚定肝细胞过表达人CYP2D6，避免肝脏其他非实质细胞受影响的目的，构建自身免疫性肝炎模型，真正意义上实现肝细胞过表达自身抗原，促使免疫系统针对自身抗原进行连锁反应。

实施例2

本实施例提供了一种AAV8-CYP2D6腺相关病毒的构建方法。包括如下步骤：

步骤1、载体的构建

利用限制性内切酶消化获得线性化载体。PCR扩增制备目的基因片段。所用扩增引物在设计时需在其5’端添加同源重组序列，使用该引物扩增目的基因片段，扩增产物5’和3’最末端的序列分别与线性化克隆载体两末端序列完全一致。以线性化载体和目的基因扩增产物配制反应体系，进行重组反应，实现线性化载体和目的基因片段的体外环化。重组产物直接进行转化，挑取平板上的单克隆进行PCR鉴定，对阳性克隆进行测序及结果分析。将正确克隆菌液扩大培养、抽提，获得高纯度质粒。

上述步骤中，所述目的基因为：

基因名称：CYP2D6

基因编号为：NM_000106

基因物种为：Human

工具载体为：GV651；其载体图谱如图12所示。

载体编号：GV651

元件顺序：pAAV-ApoE/hAATp-MCS-EGFP-3Flag-SV40 PolyA

荧光标记：EGFP

克隆位点：NcoI/NcoI

载体购买于：上海吉凯基因科技有限公司

该载体带有ApoE/hAATp肝脏特异性启动子，可以目的基因锚定在肝脏内表达。

上述步骤中，所述扩增引物如序列SEQ ID：1和SEQ ID：2所示；其酶切位点为“CCATG”。

重组质粒其基因序列如SEQ ID：3所示。测序结果与目标序列完全一致。

步骤2、AAV腺相关病毒的包装和测定

所述AAV腺相关病毒从上海吉凯基因科技有限公司购买。

第1步：将步骤1中的重组表达质粒同pHelper(携带腺病毒来源的基因)和pAAV-RC(携带AAV复制和衣壳基因)共转染进AAV-293细胞(提供AAV复制和包装所需的反式作用因子)。转染2到3天后重组AAV在包装细胞中组装完成。

第2步：从被感染AAV-293细胞中收集AAV病毒颗粒，一般AAV颗粒会富集在包装细胞中，所以收集细胞而后裂解释放AAV颗粒到上清中可以回收大部分的AAV颗粒。这一步得到的病毒上清液随后用于各种哺乳动物类细胞系的感染实验。同时上清中的病毒也可以浓缩保留。

第3步：浓缩并纯化第三步的病毒上清液，原上清液里面包含了许多细胞蛋白分子和碎片，通过2次CsCl密度梯度离心和1次超滤可以去除绝大部分的细胞蛋白和残留的CsCl离子。动物实验都需要纯化后的病毒才能够进行，否则会达不到所需剂量并引起副作用。感染宿主细胞后，基因表达前，单链病毒必须转发成双链病毒。这个转发是重组基因表达的限制步骤，可以通过腺病毒双重感染或依托泊苷(喜树碱或丁酸钠)来加速。然而，加速基因表达的试剂对目标细胞是有毒的，如果残留到细胞上会杀死目标细胞。因此依托泊苷只能短期使用或为了提高病毒滴度时使用。

第4步：用定量PCR法测定所得到病毒的滴度，这种方法可以得到被包装到颗粒中的AAV基因组的物理滴度值。AAV的感染滴度值因感染细胞、AAV外壳蛋白和测试条件不同有较大差异，并且体外的实验数据不能反映体内的感染情况，所以在比较AAV时，定量PCR得到的物理滴度值是一个更客观的数值。

本具体实施例仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。