使用一体式采样富集装备和免疫磁珠孵育技术采样-捕获气溶胶中微生物的集成化方法

摘要

本发明公开了一种使用一体式采样富集装备和免疫磁珠孵育技术的采样‑捕获气溶胶中微生物的集成化方法。用一体式采样富集装备配备免疫磁珠收集并孵育气溶胶中的微生物；用纳米通道膜截留大尺寸的磁珠‑微生物结合体；用电化学传感平台表征采样及捕获效果。本发明协同免疫磁珠和一体式采样富集装备实现了气溶胶微生物的高效富集。本发明的一体式采样富集装备将微生物前处理和检测模块高度集成，兼顾了微生物的快速分离和高敏检测，此外，一体式采样装备制作简单且易批量生产。

说明书

技术领域

本发明属于纳米通道电化学分析传感技术领域，具体涉及一种使用一体式采样富集装备和免疫磁珠孵育技术的采样-捕获气溶胶中微生物的集成化方法

背景技术

气溶胶态病原体主要包括病毒和细菌(生物气溶胶)，由于气溶胶粒径小常悬浮于空气中，因此，生物气溶胶病原体容易造成呼吸道传染性疾病的大规模爆发。为此，大量的采样及检测方法已被开发用于监测并预防禽流感。生物气溶胶采样对传染性疾病的防控尤为重要，目前传统的生物气溶胶采样方法主要有自然沉降法、冲击法、撞击法、采样膜法等。生物气溶胶病原体常用检测方法主要包括细胞培养菌落计数法、免疫检测法和核酸检测法。细胞培养菌落计数法需依靠人工操作，耗时费力，细胞培养超过24h，不能实现自动化快速检测。PCR方法由于需依靠精密的仪器以精确控制温度的变化，并且由专业技术人员操作分析，很大程度上限制其在条件有限的现场检测领域的应用。传统的免疫检测法对样本的处理相对较为简便，但是复杂样本的检测，存在交叉污染等问题。一些技术，例如生物气溶胶质谱(BAMS)、表面增强拉曼光谱(SERS)、含荧光色素的流式细胞术以及其他基于荧光的技术，例如紫外线空气动力学粒度仪(UVAPS)，已被研究或用于可能的气载生物制剂实时检测。

不幸的是，这些技术中的大多数都无法进行物种级识别和/或具有较高的误报率。通过先进的生物气溶胶采样系统，qPCR、PCR和RT-PCR可以识别物种，提高空气样本中生物试剂的检测限，但它们很难作为无人值守的生物气溶胶传感系统实现自动化。例如，DNA样本的制备是一个劳动密集且繁琐的过程，检测时间可能长达数小时。这与“检测到警告”时间跨度的目标相去甚远，通常认为该时间跨度为1分钟，以便在人为生物失误事件中及时做出反应或救援。此外，这些技术无法区分死细胞和活细胞。UVAPS的使用可以基于与活性颗粒相关的还原吡啶核苷酸(例如NAD(P)H)和核黄素)发出的荧光实时产生总的活性生物气溶胶浓度，但其主要缺点是无法进行物种级区分。对于生物气溶胶质谱，背景噪声和对多个光谱峰值的分析导致了较高的误报率，这影响了其在实际环境中的使用。显然，迫切需要更新版本或新型实时生物气溶胶中微生物富集及检测技术。

富集采样装备使用虚拟撞击器，它将进入的气溶胶颗粒分为两个通道，主要和次要，取决于它们的大小。较小的颗粒跟随转向流进入较高的流道(主)，较大的颗粒由于其较大的惯性而直接进入较小的流道，其中较小的流通常占入口流量的约10％，而较大的流量则占另一个入口流量。大部分较大的颗粒可以被引导到次要流中，以增加次要流通道中的气载颗粒浓度，通常使用两个阶段增加约100倍或更大。

免疫磁珠是通过载体微球和免疫配基共价结合进行制备，原理是在直径几到几十微米的微小球体上引入金属分子，使微球可以被磁场所吸引，这样结合有抗原-抗体复合物的磁珠在磁场作用下发生移动，从而使与磁珠上的抗体(或抗原)特异性结合的抗原(或抗体)与其它物质分离从而得到分离抗原(或抗体)的效果。免疫磁分离可快速分离目标物，保护其生物活性，有效消除影响核酸扩增物质，提高检测的灵敏度，过程简单易用，无需昂贵的离心设备，是一种具有潜在浓缩和分离微生物的方法。

生物传感器是以生物活性物质为识别元件，通过特异性识别后将产生的复合物通过信号转换器变为可输出光、电信号，从而达到分析检测的目的传感器。根据信号转换方式的不同，生物传感器可以分为光学生物传感器、电化学生物传感器、质量生物传感器等。其中，电化学生物传感器是以电信号为最终检测信号的一类传感器，拥有高灵敏、免标记、检测时间短等优点。其中，纳米通道用于纳滤检测对象影响电阻变化产生电信号可以用于检测特定微生物。

发明内容

为了解决背景中的问题，本发明的目的在于提供一种使用一体式采样富集装备和免疫磁珠孵育的采样-捕获气溶胶中禽流感病毒的集成化方法。本发明将撞击式气溶胶采样器与免疫磁珠结合构建兼具采样和富集功能的病毒采样装备。本发明将撞击式气溶胶采样以及纳米通道电极结合，实现快速、高效、灵敏、低成本的气溶胶中禽流感病毒的检测。选择阳极氧化铝为基底，结合电化学传感器构建集成化和微型化的分析检测平台。

本发明方法的主要步骤为：选用含目标微生物的液体发生为气溶胶或者密闭空气作为检测对象；利用采样装备结合免疫磁珠采集气溶胶中的微生物，实现微生物的富集及纯化；吸取病毒液到纳米电极表面，抽滤后实现病毒检测；最终通过检测阻抗强度变化实现对目标微生物的定量检测。

本发明的创新在于利用设计的采样器和免疫磁珠相复合将采样、富集和分离巧妙结合，与纳米通道纳滤的信号放大进一步集成，实现分离富集，信号生成放大和信号高敏采集三模块的高度集成，操作高效、设备便携、普适性高。

本发明所采用的技术方案如下：

一、一种一体式采样富集装置

装置为由上管件和下管件上下对接组成的一体式采样富集管，上管件和下管件之间可拆卸；上管件上一体化设置有进气管和出气管；进气管呈倒L型，水平段位于管件外，竖直段底部从上管件顶部伸入管件内，并伸入至下管件底部；出气管水平设置于上管件的顶部侧面，与管件内部连通。

所述出气管连接撞击式气溶胶采样泵，以撞击式辅助微生物与免疫磁珠孵育过程；所述出气管高度高于进气管底端高度，通过倒L型进气管将气溶胶直接送入下管件底部。

一体式采样富集管材质包括但不限于石英玻璃、硅胶。

二、使用一体式采样富集装置和免疫磁珠孵育技术的采样-捕获气溶胶中微生物的集成化方法

包括以下步骤：

步骤1)在一体式采样富集管底部装入样本采集液，使出气管与撞击式气溶胶采样泵连接，然后将目标气体通过进气管导入一体式采样富集管底部；

步骤2)采样和富集气溶胶中可能存在的目标微生物：

开启撞击式气溶胶采样泵，当气溶胶中存在目标微生物时，撞击式气溶胶采样泵会对气溶胶中存在的微生物进行一定时间的采样富集，使目标气体中的微生物分散进入样本采集液，并且使存在的目标微生物与样本采集液中的功能磁珠特别结合；

步骤3)基于磁分离方法处理采样富集后的采集液，去除废液得到富集液，对富集液充分超声使富集液中磁珠重新分散；

步骤4)取步骤3)分散后的待测液滴于纳米通道电极芯片表面上，对电极芯片进行抽滤直至电极芯片表面变干，利用eis阻抗变化对电极芯片导电性进行表征，从而完成目标气体中微生物的有无及浓度结果检测。

所述步骤1)中，样本采集液含有特异识别目标微生物的功能物质，功能物质包括但不限于修饰抗体、适配体和核酸等识别元件的磁珠；其中，磁珠直径为20nm，制备磁珠的BSA浓度为1％，制备磁珠时用BSA封闭的时间为30min。

所述步骤1)中：目标气体来源包括空间气体或液体气化后的气溶胶，液体包括尿囊液、血液、唾液、拭子稀释液。

所述步骤2)中：用撞击式气溶胶采样泵进行采样富集的时间为10～30min；撞击式气溶胶采样泵的采样流量为5-15lpm。

所述步骤4)中的纳米通道电极芯片：

纳米通道的膜孔径在0.01-10μm范围内，包括单纳米孔或纳米通道阵列；

纳米通道的材料种类包括多孔阳极氧化铝膜(AAO)、嵌段共聚物自组装膜、氮化硅多孔膜、碳纳米管膜。

纳米通道表面的导电层材料种类包括但不限于银、金、铜、碳；

纳米通道电极采用双电极的连接方式。

所述步骤4)中：

在抽滤前后对纳米通道电极芯片分别进行eis阻抗变化表征；

若抽滤前后阻抗变化，表示目标气体中有微生物，将测得的阻抗变化与据预先标定获得的阻抗变化与目标微生物浓度之间拟合建立的标准曲线模型进行对照获得对应的微生物浓度结果；

若抽滤前后阻抗没有变化，表示目标气体中没有微生物。

本发明的有益效果是：

本发明将撞击式采样系统与免疫磁珠相结合，捕获、富集并分离气溶胶中的微生物，通过电极芯片的纳米通道“纳滤”快速分离游离磁珠而截留磁珠-微生物复合物，随后基于双电极系统平台实现微生物的简单高敏检测。本发明方法提供了一种使用一体式采样富集装备和免疫磁珠孵育技术的采样-捕获气溶胶中微生物的集成化方法，其与现有方法相比的积极效果是：

(1)本发明方法能够在特定空间内收集各种尺寸的代表性生物颗粒，而不会损失微生物状态和微生物的物理采集。采样器还应与随后的微生物分析兼容快速性(或高采样流速)、便携性和采集能力；

(2)本发明方法基于采样装备和检测装备高度集成了捕获、富集、分离、检测模块，可实现病毒的采样、分离、检测一体化，操作简便高效、设备便携低廉且易制备，避免了繁琐耗时的处理步骤及多种昂贵仪器的使用；

(3)本发明方法结合免疫磁珠孵育的高效性和纳米通道电极截留抗原抗体复合物产生化学信号，可显著提高微生物检测灵敏度，实现气溶胶中痕量目标菌的高敏检测；

(4)本发明方法具有较好的普适性，通过更换抗体便可实现不同微生物的检测；采样装备和检测装备还能拆分，富集的微生物通过简单的磁分离后——即纯化以后，可以用于其他的病毒研究；

(5)本发明方法有望与便携式电化学工作站结合，具备现场快速分析气溶胶微生物存在的潜力，展现出良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明的设计图，a为一体式采样富集管，b为磁分离方法，c为纳米通道-电极芯片。

图2为一体式采样富集管的细节图。图中：1进气管，2出气管，3上管件，4螺纹、5下管件。

图3为电极的SEM图，其中(a)为裸电极(孔径500nm)表面图；(b)为病毒截留在电极(孔径20-30nm)表面的形态；(c)为免疫磁珠-病毒复合物截留在电极(孔径500nm)表面的形态。

图4为不同物质对同一电极抽滤后的电阻变化。

图5为不同亚型，不同滴度的禽流感病毒采样检测后的电阻变化。

图6为不同物质对同一电极的抽滤后的电阻变化(eis图)。

图7为同一亚型的禽流感病毒抽滤后的eis图。

具体实施方式

为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图与实施例对本发明提供的方法进行详细描述。以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

如图1和图2所示，一体式富集采样管由上管件和下管件上下对接组成，上管件3和下管件5之间可拆卸。上管件和下管件之间通过螺纹4密封连接，上管件适配15mL螺旋口下管件，可根据实际需要设计为更大尺寸的口径。

上管件3上一体化设置有进气管1和出气管2。出气管开口位于顶部，避免采样液倒吸；出气管高度高于进气管底部高度，以倒“L”型将气溶胶直接送入离心管底部，以撞击式辅助微生物与免疫磁珠孵育过程。

进气管1水平段的端口：内径0.5cm,外径0.8cm；进气管1竖直段的端口：内径0.3cm,外径0.7cm；出气管2端口：内径0.4cm,外径0.6cm。下管件5底部放置100μL免疫磁珠溶液。

本发明实施例如下：

(1)MNPs-Ab的制备

羧基化的MNPs按照已报道的方法进行制备。MNPs用MEST缓冲液离心分离(10min,12000rpm,下同)并去除上清液，重复3次后，重悬于含有10mM EDC和15mM的NHSS的MEST缓冲液中，并在室温下孵育30分钟以活化MNPs表面的羧基。然后，将MNPs用BST缓冲液进行离心分离和去除上清液(同上步骤)，清洗3次后重悬于含有17μg mL Anti-St的BST缓冲液中，并在室温下孵育2.5h以偶联抗体。将抗体修饰的MNPs与含有20mg mL-1BSA的PBST缓冲液孵育1h，以封闭残留的反应位点。将上述MNPs用PBST缓冲液进行离心分离和去除上清液，清洗3次后最终分散于PBST缓冲液中，获得MNPs-Ab。

(2)气溶胶病毒采样及富集

使用TK-3微生物气溶胶发生器产生气溶胶中的病毒。先将雾化器储液罐插入三脚架的圆环内。再用气管连接主机出气口-雾化器储液罐进气口。往储液罐中加入2mL的AIV尿囊液，根据后面检测的需要可以进行梯度的稀释。其中添加0.5％(w/v)BSA。(每次加样前用血凝试验标定该次检测的病毒液的TCID50)。

构建具有采样及富集功能的撞击式气溶胶采样器。为了富集最大化，选用15mL离心管作为盛液瓶，加入100μL免疫磁珠溶液用于捕获及富集病毒。上方配备同螺纹的采样管，保证气密性。用橡胶管连接雾化器储液罐出气口-采样管进气口以及采样管出气口-撞击式气溶胶采样泵。同时开启气溶胶发生器和气溶胶采样器。设置采样流量为20L/min，采样10min，进行气溶胶中病毒的快速捕获。转而调整为5L/min采样20min进行剩余病毒的捕获以及免疫磁珠与病毒的孵育，获取MNPs-Ab-AIV悬浮液。将MNPs-Ab-AIV悬浮液磁分离并弃去上清液，重悬于200uL PBST。经过三轮上述洗涤步骤后，将最终的沉淀物分散于50μLPBST中。以MNPs-Ab悬浮液作为对照，每次采样结束先用0.01％十二烷基硫酸钠(SDS)发生气溶胶5min，以冲走病毒气溶胶。接着用去离子水发生气溶胶25min清洗储液罐，橡胶管，采样管以冲走SDS残留物。

(3)病毒的电化学检测

将100μL MNPs-Ab与1mL病毒尿囊液(10-1-10-3TCID50)在室温下混合并孵育45min，利用抗原抗体特异性捕获禽流感病毒，得到MNPs、Ab和St的复合物(MNPs-Ab-St)。将MNPs-Ab-AIV悬浮液磁分离并弃去上清液，重悬于200uL PBST。经过三轮上述洗涤步骤后，将最终的沉淀物分散于50μL PBST中。以MNPs-Ab悬浮液作为对照，用10uL MNPs-Ab-AIV悬浮液进行过滤和电化学测试并收集EIS曲线。目标物的信号为EIS测试结果中病毒样品和对照组的电荷转移电阻(Rct)之差。

本发明方法对气溶胶中的禽流感病毒具有高灵敏度，这主要得益于两点：(1)自设计的气溶胶采样装备基于撞击式气溶胶采样原理，采样能力强，不会破坏病毒结构。同时选用免疫磁珠可以捕获和富集更多的病毒。(2)禽流感病毒粒径100nm左右，免疫磁珠本身粒径20nm，AAO孔径500nm，免疫磁珠虽然粒径小但会水合团聚，可以轻易通过AAO通道，而与病毒结合后还有团聚现象，粒径更大，会被截留在电极表面。细微的变化带来阻抗的变化，从而达到灵敏检测。

病毒的粒径普遍在nm级别，本发明选取的检测对象——禽流感病毒可以延伸到其他可以通过气溶胶传播的病毒，如传染性支气管炎病毒，传染性法氏囊病毒等。只需将免疫磁珠上的抗体替换成其他抗体。

由上述实施案例可见，本发明提出的使用一体式采样富集装备和免疫磁珠孵育技术的采样-捕获气溶胶中微生物的集成化方法通过采样装备富集空气中的禽流感病毒；通过免疫磁珠捕获禽流感病毒，同时可以实现快速磁分离纯化病毒；利用纳米通道“纳滤”快速分离干扰磁珠，富集信号分子；同时结合电极芯片输出可读电化学信号，整个步骤耗时仅约1h。本发明方法操作简单、快速、特异性高、灵敏度好、普适性强，且采样装备、功能磁珠和集成电极制备简单易批量生产。因此，本发明方法有望成为一种现场快速检测手段，展现良好的发展前景。

如图3所示，a是500nm纳米通道电极芯片的表面孔径的SEM图，b展示了20nm孔径的纳米通道电极芯片表面截留的病毒形态的SEM图，c是纳米通道电极芯片抽滤免疫复合物后展示表面截留状态的SEM图。

如图4所示，对同一电极先后进行(1)BSA封闭；(2)小分子物质抽滤；(3)免疫磁珠抽滤；(4)免疫磁珠-病毒结合物抽滤后进行eis检测记录了抽滤前后的电阻变化。从中可以看出免疫磁珠-病毒结合物抽滤后Rct变化值最大。

如图5所示，不同亚型，不同滴度的禽流感病毒采样检测后电阻均发生变化，表明该免疫磁珠可以识别多个病毒亚型，拥有广谱性。

如图6所示，对同一电极先后进行BSA封闭，免疫磁珠抽滤以及免疫复合物，检测初始eis电阻，以及以上各步操作后的eis电阻，eis曲线在BSA封闭以及免疫磁珠抽滤后基本重合，在免疫复合物抽滤后曲线半圆增大。

如图7所示，是使用气溶胶采样器采集不同浓度(依次从×1到×10

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。