氯法齐明联合antiPD1在制备治疗原发性颅内肿瘤产品中的应用

摘要

本发明涉及一种氯法齐明联合antiPD1在制备治疗原发性颅内肿瘤产品中的应用；本发明通过实验证明，通过抑制Wnt通路影响肿瘤免疫微环境，可以解除免疫抑制，增强抗肿瘤免疫反应，提高antiPD1在GBM中的治疗效果。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种氯法齐明联合antiPD1在制备治疗原发性颅内肿瘤产品中的应用。

背景技术

脑胶质瘤是指起源于脑神经胶质细胞的肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤，具有高度的侵袭性；2021年版WHO中枢神经系统肿瘤分类将脑胶质瘤分为I～IV级，I、II级为低级别脑胶质瘤，III、IV级为高级别脑胶质瘤；胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM)为IV级脑胶质瘤，具有高度的侵袭性，恶性程度高，为第一难治性肿瘤，其易复发和获得性耐药是一个重大的临床挑战；

目前肿瘤免疫治疗在多种肿瘤中均有涉及，尤其是PD1/PDL1免疫检查点抑制剂(ICB)治疗在肺癌、肾癌以及黑色素瘤中取得了非常显著的治疗效果；但是在脑胶质瘤中进行antiPD1治疗均以失败告终，主要原因是antiPD1的单克隆抗体治疗反应主要依靠肿瘤间质中浸润着大量的淋巴细胞，脑胶质瘤属于冷肿瘤，脑胶质瘤的免疫微环境中浸润的抗肿瘤免疫细胞较少；肿瘤免疫微环境(Tumor immune microenvironment，TIME)是一个极为复杂的体系，其内在的各种免疫细胞、基质细胞及细胞因子均可与肿瘤细胞相互作用，且这些免疫系统网络的调控与肿瘤存在着复杂的相互作用并对肿瘤发生发展和免疫治疗应答产生重要影响；所以，如何通过改善GBM的免疫微环境，开发新的免疫治疗方法和个性化的药物治疗方案是行业内一直在研究的重要问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种氯法齐明联合antiPD1在制备治疗原发性颅内肿瘤产品中的应用。

所述原发性颅内肿瘤为脑胶质瘤；所述氯法齐明，CAS No.：2030-63-9；所述antiPD1，CAS No.：946414-94-4。

所述产品为药品。

所述氯法齐明在处理体系中的浓度为100mg/kg，所述antiPD1在处理体系中的浓度为14.5mg/kg。

Wnt蛋白是一种富含半胱氨酸的糖蛋白，参与高等动物胚胎发育的调控；经典Wnt/β-catenin信号通路的异常激活影响细胞增殖、迁移和侵袭，与多种肿瘤的发生发展密切相关；Wnt促进GBM的生长和侵袭以及治疗耐药性，Wnt信号通路的激活也可以通过调节DC细胞、B细胞和T细胞的分化和增殖影响着免疫治疗的疗效；同时，GBM人和小鼠细胞系中均发现Wnt信号的高表达。

本发明通过实验证明，通过抑制Wnt通路影响肿瘤免疫微环境，可以解除免疫抑制，增强抗肿瘤免疫反应，提高antiPD1在GBM中的治疗效果。

附图说明

图1～图2为实施例中氯法齐明在GL261细胞系中的Wnt表达情况；从图1可以看出，氯法齐明可以靶向抑制GL261细胞系中的Wnt表达；从图2可以看出，氯法齐明可以抑制GL261细胞系中Wnt信号下游信号蛋白以及可能存在使GL261细胞发生MET现象；

图3为实施例中小鼠脑中可见肿瘤生长情况；从图中可以看出，脑胶质瘤原位成瘤模型建立成功；

图4为实施例中各组小鼠的肿瘤退缩情况，从图中可以看出，氯法齐明联合antiPD1组较其他各组具有最强的缩瘤效应；

图5为实施例中各组小鼠肿瘤组织治疗后肿瘤细胞Wnt表达情况对比图，从图中可以看出，氯法齐明联合antiPD1组对肿瘤的Wnt-3a抑制作用最明显；

图6为实施例中各组小鼠外周血淋巴亚群表达情况对比图，从图中可以看出，氯法齐明联合antiPD1对增加外周血淋巴亚群中CD3+CD8+PD1+T细胞最为明显；

图7为实施例中对照组与用药组小鼠的生存期对比；从图中可以看出，氯法齐明联合antiPD1组生存期显著延长。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例中相关主要材料来源：

细胞系：U118细胞系、GL261细胞系，购自上海瑾源生物有限公司；

动物：4周龄的C57BL/6N小鼠，购自为北京维通利华有限公司；

试剂：重组抗Wnt3a抗体(英国Abcam，ab219412)；

重组抗PDL-1抗体(英国Abcam，ab213480)；

重组抗PDL-1抗体(英国Abcam，ab213524)；

重组抗β-catenin抗体(英国Abcam，ab32572)；

重组抗Vimentin抗体(英国Abcam，ab92547)；

重组抗c-Myc抗体(英国Abcam，ab23072)；

盐酸丁螺环酮(加拿大TRC公司，纯度99.9％，批号：6-EOD-111-1)；

乙腈(色谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；

甲酸(分析纯，北京益利精细化学品有限公司)；

药物：氯法齐明购自山西立业制药有限公司，PD-1单抗：RMP1-14(BioXCell)；

仪器：LC-MS 6490液质联用仪(Agilent Technologies)，Waters ACQUITY UPLCBEH C18 Column(2.1mm×100mm，1.7μm)，超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-500E)，涡旋振荡器(德国艾卡公司，型号：VORTEX 2S025)，桌上离心机(北京五洲东方科技发展有限公司，型号：3K15)。

实施例中无特殊说明的实验材料，本领域内技术人员均可从公开商业途径获得。

实施例中无特殊说明的检测/操作方法，均为本领域内技术人员熟知的常规方法。

实验方法：

(1)GL261细胞系Wnt蛋白表达情况检测；

选择人源脑胶质母细胞瘤细胞系U118、鼠源脑胶质母细胞瘤细胞系GL261作为研究细胞系；利用Western Blot技术检测；配制蛋白裂解液(PMSF:RIPA＝1:100)；适量加入蛋白裂解液，震荡摇匀，冰上静置30min，4℃条件下12000g离心30min；离心沉淀后收集上清液；BCA蛋白浓度测定法检测样品的蛋白浓度，计算上样量；取40mg蛋白与5×上样缓冲液混合(1:4)，煮沸5min变性；配制分离胶及4％浓缩胶，将已变性蛋白加入10％不等的SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；电压80V，电流150mA，100min转膜；配制5％脱脂牛奶封闭2h；用一抗稀释液以一定比例稀释相关抗体，封一抗，4℃冷房过夜；次日(12-16h后)TBST洗10min，3次，加相应二抗，室温下摇床上孵育1.5-2h；ECL发光，照相，image pro plus软件定量分析。

(2)氯法齐明抑制Wnt蛋白的最佳有效浓度确定；

配置不同氯法齐明药物浓度(0μM、20μM、40μM、60μM、80μM和100μM)处理3-4天后Western Blot技术检测Wnt蛋白表达情况，筛选氯法齐明抑制Wnt蛋白的最佳有效浓度。Western Blot方案同前述。

(3)氯法齐明在GL261中PDL1、EMT表达的影响；

给予氯法齐明100μm进行干预，利用qPCR技术和Western Blot技术检测PDL1、E-cad、Vim、c-myc基因蛋白表达情况。

(4)建立小鼠原位种植GL261细胞成瘤技术；

培养GL261细胞，并按照5×10

(5)观察颅内原位成瘤小鼠氯法齐明联合antiPD1治疗后对肿瘤的影响；

建立小鼠原位成瘤技术后，对60只C57BL/6N小鼠进行实验，并分成了4组(每组15只)，分别为：空白对照组，氯法齐明100mg/kg/d组，antiPD1单药组，antiPD1联合氯法齐明100mg/kg/d组，每组各15只小鼠，其中氯法齐明喂药从第10天开始连续喂药2周后停药，于第17天，第24天及第31天各取材10只，随机5只用于记录肿瘤大小、石蜡包埋HE染色确定细胞形态及镜下肿瘤面积，免疫组化法检测各组Wnt-3a蛋白表达情况，计算阳性率，另外5只取脑组织匀浆上清夜样本，使用液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)内标法检测各组脑组织中的氯法齐明药物浓度；其余小鼠观察到自然死亡，并记录各只存活时间，绘制kaplan-meier(KM)生存曲线图。

(5.1)首先离体肿瘤测量，之后石蜡包埋切片、HE染色后，在显微镜下观察细胞形态、肿瘤范围大小及个数，观察与对照组相比，各组肿瘤的生长情况。

(5.2)Wnt3a免疫组化法检测步骤：

(5.2.1)备片：将选好的石蜡切片，厚度约4u m，于温箱中60℃烤片3h。

(5.2.2)免疫组化En Vision法染色步骤：

a)石蜡切片脱蜡至水化：二甲苯脱蜡3次各10分钟，，梯度酒精水化各10分钟；

b)3％H

c)抗原修复：将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液(PH＝6.0)中，高压热修复2分钟；

d)滴加一抗：滴加Wnt3a抗体(1：200))，37℃孵育1小时，PBS(PH＝6.0)洗3次，每次3分钟；

e)滴加二抗：滴加辣根过氧化物酶标记的二抗(PV-6000)工作液，37℃孵育30分，PBS洗3次，每次3分钟；

f)DAB显色：每张切片滴加约100μl，显色时间控制在3-15分钟，显微镜下观察显色情况，适时终止；

g)苏木素复染：苏木素染色30秒，自来水洗涤；盐水酒精分化2秒，自来水洗涤；氨水反蓝1秒，自来水洗涤；

h)脱水透明：75％，90％，100％酒精各5分钟，二甲苯3次各10分钟；

i)中性树胶封片；

j)在显微镜下观察；每次实验均以PBS代替一抗作为阴性对照。

(5.2.3)结果判断:使用Image J软件进行免疫组化阳性率定量分析。

(5.3)内标法检测实验组小鼠口服氯法齐明后脑组织中的药物浓度。

1.5mL EP管中加入组织匀浆上清液样本(血清)100μL，加入内标溶液(3.13μg/mL丁螺环酮)100μL，加入乙腈200μL，涡流2min后在4℃下13200r/min离心10min，取150μL上清液进行LC-MS/MS分析，进样10μL；内标法药物浓度计算：Con

实验结果：

(1)氯法齐明可抑制GL261中Wnt表达水平；

不同浓度的氯法齐明处理小鼠GL261脑胶质瘤细胞系和人源U118脑胶质瘤细胞系，观察两种细胞系在不同氯法齐明浓度下Wnt-3a蛋白及基因表达水平是否有变化，如图1所示，在20μm浓度氯法齐明处理下，无论是GL261细胞系还是U118细胞系，Wnt-3a蛋白及基因的表达均明显降低，同时，随着氯法齐明浓度的增加，Wnt-3a蛋白及基因呈阶梯型下降；说明氯法齐明可以对脑胶质瘤细胞中的Wnt-3a蛋白靶向抑制。

(2)100μm浓度氯法齐明可以抑制GL261细胞系中Wnt下游信号通路；

验证了100μm浓度氯法齐明可以降低GL261细胞系中Wnt信号通路下游主要的活性蛋白β-catenin、c-myc蛋白的表达；由于Wnt信号通路中β-catenin、C-myc的活化表达是Wnt下游信号通路中发挥作用的关键，而100μm浓度的氯法齐明对β-catenin蛋白抑制作用也非常的明显，说明氯法齐明不光可以靶向抑制脑胶质瘤细胞系GL261中的Wnt蛋白，同时还能减少Wnt信号通路下游主要发挥活性作用的β-catenin、c-myc蛋白的表达，如图2所示，氯法齐明可使E-cad水平升高，V-min水平降低，促进细胞发生MET现象。

(3)小鼠原位成瘤模型建立成功；

如图3所示，GL261细胞系注入C57BL/6N小鼠颅内额叶，于D9、D13、D21取材，成瘤率100％，随时间延长，肿瘤体积逐渐增大，脑胶质瘤原位成瘤模型建立成功。

(4)GL261颅内成瘤小鼠中，氯法齐明可进入血脑屏障，且氯法齐明联合antiPD1治疗可提高antiPD1疗效。

GL261颅内成瘤小鼠口服100mg/kg氯法齐明2周后，可在脑组织中检测到氯法齐明药物浓度(0.550201ug/ml)，说明该药物可进入血脑屏障；如图4～5所示，在4组小鼠中，antiPD1联合氯法齐明100mg/kg/d组的小鼠肿瘤退缩最明显，用药1周后联合组肿瘤几乎完全退缩；氯法齐明单药组及antiPD1单药组较空白对照组均有缩瘤效应，其中氯法齐明组虽较antiPD1单药组肿瘤体积大，但镜下可见明显肿瘤组织粘液样变、坏死的治疗后反应，第31天后联合治疗组Wnt-3a在脑肿瘤中的表达水平最低，较氯法齐明组及antiPD1组明显抑制Wnt-3a表达(P<0.01)，氯法齐明组对Wnt-3a的抑制又强于antiPD1单药组(P<0.01)；提示氯法齐明可以使肿瘤凋亡，但不能影响肿瘤的侵袭。

(5)氯法齐明应用后使得肿瘤凋亡，释放更多的新抗原，增加外周血杀伤性T细胞比例，增加抗肿瘤免疫反应；

GL261颅内成瘤小鼠100mg/kg氯法齐明2周后，收集小鼠外周血，分离单个核细胞，通过流式细胞分选特定T淋巴亚群，观察氯法齐明联合antiPD1对外周血淋巴亚群的影响，如图6所示，在4组小鼠中，相比对照组，无论应用单药氯法齐明和antiPD1还是联合用药，均能增加外周血CD3+CD8+PD1+T细胞的比例，而氯法齐明联合antiPD1组增加外周血CD3+CD8+PD1+T细胞的比例在所有组里最为明显(P<0.01)；同时，我们观察了用药对于外周血主要免疫抑制细胞Treg的影响，结果所示相比对照组，单药氯法齐明和antiPD1以及联合组外周血的Treg均明显减少，提示氯法齐明可以增加外周血杀伤性T细胞的比例，减少抑制性免疫细胞Treg的比例；而氯法齐明联合antiPD1治疗后对抗肿瘤免疫反应影响最大，扩大了抗肿瘤免疫反应。

(6)antiPD1联合氯法齐明可以明显延长GL261颅内成瘤小鼠生存期；

如图7所示，4组内，联合组小鼠生存期最长，可达79天，较对照组增加延长54天(P<0.01)，氯法齐明组较antiPD1组延长12天(47天vs 35天，P＝0.03)；各治疗组小鼠体重较对照组无明显差别(P＞0.05)。

综上，本发明从细胞水平和动物水平，证明氯法齐明联合antiPD1治疗可改善抗肿瘤免疫活性并提高治疗效果，为GBM治疗提供新靶点。