一种从桑叶中获得1-脱氧野尻霉素的制备方法

摘要

本发明公开了一种从桑叶中获得1‑脱氧野尻霉素的制备方法，主要解决的是现有技术只考虑产品含量而忽略收率的问题，包括以下步骤：(1)将桑叶干燥品进行粉碎，加水打浆，调节PH后加入维生素C，搅拌均匀后提取，过滤离心，得离心液；(2)将离心液过两级OSN有机膜纯化，得截留膜液；(3)将截留膜液依次流过5根以上串联的阳离子树脂交换柱中，先用1‑3％ml/100g的氨水洗脱，再用4‑5.5％ml/100g的氨水洗脱，收集第二根到倒数第二根的洗脱液浓缩至无氨水得浸膏；(4)将浸膏装进混合离子树脂交换柱中，用纯水洗脱，收集药液；(5)将所述药液透过反渗透膜，得截留液，浓缩，真空干燥。本发明提供的方法减少了生产工序和成本，在提高产品含量的同时保证了回收率。

说明书

技术领域

本发明涉及桑叶中有效成分的提取技术领域，更具体地说，它涉及一种从桑叶中获得1-脱氧野尻霉素的制备方法。

背景技术

桑叶含多种功能性成分。1-脱氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin，DNJ)为主要的功能活性物质之一。现代药理研究证明，DNJ对小肠中的α-葡糖苷酶活性具有强竞争性抑制作用和抗肿瘤、抗病毒等药理活性，成为蚕桑综合利用的一个研究热点。植物源DNJ的含量偏低，且其他次生代谢干扰物的存在增加了提取技术的难度。目前，这一技术仍在不断的改进和完善中。1-脱氧野尻霉素可通过热回流提取法、大孔树脂法、超声辅助提取法、微波辅助提取法等提取得到；分离纯化只是利用阳离子树脂进行粗分离，其后还需要用有机溶剂处理，含量一般都在小于20％。而化学合成的1-脱氧野尻霉素副产物较多且分离纯化困难，其合成工艺成本高，合成路线长、技术要求高、DNJ产量偏低等问题暂无法实现大规模生产。所以要获得1-脱氧野尻霉素样品主要还是从天然植物中提取，但目前针对1-脱氧野尻霉素的提取工艺研究仍处于初期阶段。

专利号201910660067.0公开了一种从桑枝中提取1-脱氧野尻霉素的方法，通过将原料粉碎过筛40目、用醇水溶液提取、用大孔树脂梯级洗脱和纯化、浓缩干燥、再提纯和浓缩干燥等步骤来提取1-脱氧野尻霉素，该专利的操作简单，成本较低，适合大规模生产。但是也存在着一定的缺陷：提取过程中使用了有机溶剂，既不环保也不安全；还是使用的大孔树脂层析，此步骤能耗大，操作复杂；虽然说收集到的1-脱氧野尻霉素的含量≥95％，但是其未考虑到回收率。

专利号201210411230.8公开了一种从桑叶中提取制备1-脱氧野尻霉素的工艺方法，通过将原料粉碎过筛10-30目、用水回流提取、加醇过滤离心、浓缩、用大孔树脂脱色及纯化、浓缩、用阳离子树脂吸附、脱色、浓缩至干固体状、加入甲醇溶解过滤再加入硅胶至干粉状、加入乙二胺或三乙胺进行梯度洗脱和用薄层色谱法检测等步骤来提取制备1-脱氧野尻霉素，该专利所得产品的含量≥70％，也能大规模生产，但是提取过程中用了较多的有机溶剂，其是先加入多种有机溶剂进行分离提纯，之后再进行回收再利用，是比较环保，但操作繁琐。而且工艺中用到的如乙二胺或三乙胺等有机溶剂是有毒的、易燃的，虽然是也提高了产品含量但未考虑1-脱氧野尻霉素的回收率。

专利号201511020693.1公开了桑叶中1-脱氧野尻霉素的提取方法，包括粉碎、微波提取、离心分离、水提醇沉、浓缩干燥、膜分离、干燥等步骤来提取1-脱氧野尻霉素，利用微波萃取技术提高提取效率并且保证1-脱氧野尻霉素的分子结构不受破坏，使得产品的药用价值更高，但是产品的含量＜10％，而且不能量产。

综上所述，现有技术操作繁琐，使用了较多有机溶剂且只考虑产品含量而忽略了收率，所以需要提供一种全程没有使用有机溶剂，对环境污染少的，在提高产品含量的同时也保证了回收率的方法来提取1-脱氧野尻霉素。

发明内容

本发明的目的是提供一种从桑叶中获得1-脱氧野尻霉素的制备方法，减少了生产工序和成本，在提高产品含量的同时也保证了回收率，本发明能够得到含量＞50％且回收率＞90％的1-脱氧野尻霉素，并且全程没有使用有机溶剂，对环境污染少，满足市场对桑叶提取物的规格要求。

实现本发明目的的技术方案是：一种从桑叶中获得1-脱氧野尻霉素的制备方法，包括以下步骤：

(1)将桑叶干燥品通过超微粉碎至≥200目，加入纯水打浆，用柠檬酸调节PH后加入维生素C，搅拌均匀后提取，过滤离心，得离心液；

(2)将离心液过两级OSN有机膜纯化，得截留膜液；

(3)将截留膜液依次流过5根以上串联的阳离子树脂交换柱，流出液检测到1-DNJ含量＞0.1％停止进药，用氨水进行分级洗脱，先用1-3％ml/100g的氨水洗脱，再用4-5.5％ml/100g的氨水洗脱，收集第二根到倒数第二根的洗脱液浓缩至无氨水得浸膏；

(4)将浸膏装进混合离子树脂交换柱中，用纯水洗脱后收集药液；

(5)将所述药液透过反渗透膜，得截留液，浓缩，真空干燥，即得。

所述步骤(3)中，阳离子树脂型号为SQD-65、002SC NA、SQ66、001×7MB、D110和D001TR中的任意一种。作为本发明的一个实施方式，阳离子树脂型号为SQD-65，每根交换柱装300g树脂，直径和高的比为1:8-10。

所述步骤(3)中，用氨水进行分级洗脱前先用水洗至流出液呈无色澄清。

所述步骤(1)中，纯水与粉碎后桑叶的重量比为3-5:1；柠檬酸的浓度为2-5％；调节PH到4.0-4.5；维生素C的添加量为0.1-1.0‰。

所述步骤(1)中，所述提取温度为2-6℃，提取时间为3-4h，提取次数为1次。

所述步骤(1)中，所述离心采用台式离心机进行分级离心，先经过1200r/min蝶式离心60min，再经过12000r/min管式离心2.5h。

所述步骤(2)中，所述两级OSN有机膜纯化为先经过800-1200道尔顿的有机膜，再经过150-250道尔顿的有机膜。

作为本发明的一个实施方式，先经过的有机膜进膜压力为290-870PSi，后经过的有机膜进膜压力为500-850PSi。

所述步骤(4)中，所述混合离子树脂交换柱上层为阴离子交换树脂，下层为阳离子交换树脂，阴离子交换树脂与阳离子交换树脂的质量比为5-8:0.5-1。作为本发明的实施方式，阴离子交换树脂型号为SQ-70A、D945、D296、D330和D918的任意一种；阳离子交换树脂型号为D113、D110和D111中的任意一种。

所述步骤(5)中，反渗透的压力为0.8-1MPa，透过原液后，继续加入4倍原液的纯水进行加透，得到截留液。

有益效果

1.本发明利用串联的阳离子树脂，加上氨水的分级洗脱，获得了高含量的1-DNJ，回收率也提高。采用混合离子树脂交换柱兼顾了脱色、纯化和中和PH三方面的效果，减少了生产的工序，提高了生产效率。

2.本发明利用超微粉碎过筛≥200目，提高了溶解率，从而大大提高提取液中的1-DNJ含量，只需提取一次，提取率高，方法快速高效。

3.本发明利用有机膜的组合方式代替以往的大孔树脂层析脱色纯化，其操作方便能耗少，同时兼顾脱色效果，降低生产成本，提高生产效率。

4.本发明提供的方法，减少了生产工序和成本，简单好控制且稳定性好，在提高产品含量的同时保证了回收率，适合大规模生产。生产出的产品，溶剂残留少，品质好，全程没有用到有机溶剂，对环境污染少。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的1-DNJ的高效液相色谱(HPLC)图；

图2为本发明实施例2制得的1-DNJ的高效液相色谱(HPLC)图；

图3为本发明实施例3制得的1-DNJ的高效液相色谱(HPLC)图。

其中，1-DNJ含量检测结果取色谱图中14min的那个峰。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

(1)取桑叶干燥品1000g(总含量为0.12％)超微粉碎到200目以上，加5000g的纯水打浆，用5％柠檬酸调节PH到4.0，加入1‰的维生素C搅拌均匀，在6℃的温度下提取4h，提取时一直搅拌，提取一次即可，提取完成后过200目的滤布，采用台式离心机进行分级离心，先经过1200r/min蝶式低速离心60min，再经12000r/min管式高速离心2.5h，得离心液。

(2)将离心液过两级OSN有机膜纯化，先经过1000道尔顿的有机膜，进膜压力为870PSi，全部过完后再经过200道尔顿的有机膜，进膜压力为850PSi，得脱色截留膜液。

(3)将脱色截留膜液依次流过5根串联的阳离子树脂交换柱，型号为SQD-65，每根装300g树脂，直径与高比为1:10，以流出液检测到1-DNJ含量＞0.1％后停止进药，先用水洗到树脂流出液为无色澄清，再用3％ml/100g氨水洗脱，洗脱量为每根树脂的4倍柱体积，最后用5％ml/100g氨水洗脱，收第二根到倒数第二根的洗脱液浓缩至无氨水得到浸膏。

(4)将浸膏直接放进混合离子交换树脂中，树脂量为900g，混合离子树脂交换柱上层为阴离子交换树脂SQ-70A 800g，下层为阳离子交换树脂D113 100g，阴离子交换树脂与阳离子交换树脂的质量比为8:1，进完后用1800g的纯水洗脱，合并收集流出液和水洗液，以流出的液体中检测到1-DNJ含量＞0.1％DNJ开始收集药液，待用。

(5)将药液在1MPa的压力下透过原液，加入4倍原液的纯水加透，得到截留液。将截留液浓缩后真空干燥，可以得到产品2.1g，经HPLC检测(如图1所示)1-DNJ含量为51.5％，回收率为90.13％。

实施例2

(1)取桑叶干燥品1000g(总含量为0.12％)超微粉碎到200目以上，加4000g纯水打浆，用4％柠檬酸调节PH到4.0，加入0.5‰维生素C搅拌均匀，在4℃的温度下提取3.5h，提取时一直搅拌，提取一次即可，提取完成后过200目的滤布，利用台式离心机分级离心，先经过1200r/min蝶式低速离心60min，再经过12000r/min管式高速离心2.5h，得离心液。

(2)将提取离心液过两级OSN有机膜纯化，先经过1200道尔顿的有机膜，进膜压力为800PSi，全部过完后再经过250道尔顿的有机膜，进膜压力为780PSi，得脱色截留膜液。

(3)将脱色截留膜液依次流过5根串联的阳离子树脂交换柱，型号为SQD-65，每根装300g树脂，直径与高比为1:9，以流出液检测到有1-DNJ含量＞0.1％停止进药，先用水洗到树脂流出液为无色澄清，再用2％ml/100g氨水洗脱，洗脱量为每根树脂的4倍柱体积，最后用4.5％ml/100g氨水洗脱，收第二根到倒数第二根的洗脱液浓缩至无氨水得到浸膏。

(4)将浸膏直接放进混合离子交换树脂中，树脂量为900g，混合离子树脂交换柱上层为阴离子交换树脂SQ-70A 700g，下层为阳离子交换树脂D113 50g，阴离子交换树脂与阳离子交换树脂的质量比为7:0.5，进完后用1800g的纯水洗脱，合并收集流出液和水洗液，以流出液检测到有1-DNJ含量＞0.1％DNJ开始收集药液，待用。

(5)将药液在0.9MPa的压力下透过原液，加入4倍原液的纯水加透，得到截留液。将截留液浓缩后真空干燥，可以得到产品2.11g，经HPLC检测(如图2所示)1-DNJ含量为51.22％，回收率为90.06％。

实施例3

(1)取桑叶干燥品1000g(总含量为0.12％)，超微粉碎到200目以上，加3000g的纯水打浆，用3％柠檬酸调节PH到4.0，加入0.2‰维生素C搅拌均匀，在2℃的温度下提取3h，提取时一直搅拌，提取一次即可，提取完成后过200目的滤布，利用台式离心机分级离心，先经过1200r/min蝶式低速离心60min，再经过12000r/min管式高速离心2.5h，得离心液。

(2)将提取离心液过两级OSN有机膜纯化，先经过800道尔顿的有机膜，进膜压力为700PSi，全部过完后再经过150道尔顿的有机膜，进膜压力为680PSi，得脱色截留膜液。

(3)将脱色截留膜液依次流过5根串联的阳离子树脂交换柱中，型号为SQD-65，每根装300g树脂，直径与高比为1:8，以流出液检测到有1-DNJ含量＞0.1％停止进药，先用水洗到树脂流出液为无色澄清，再用1％ml/100g氨水洗脱，洗脱量为每根树脂的4倍柱体积，最后用4％ml/100g氨水洗脱，收第二根到倒数第二根的洗脱液浓缩至无氨水得到浸膏。

(4)将浸膏直接放进混合离子交换树脂中，树脂量为900g，混合离子树脂交换柱上层为阴离子交换树脂SQ-70A 600g，下层为阳离子交换树脂D113 50g，阴离子交换树脂与阳离子交换树脂的质量比为6:0.5，进完后用1800g的纯水洗脱。合并收集流出液和水洗液，以流出液检测到有1-DNJ含量＞0.1％DNJ开始收集药液，待用。

(5)将药液在0.8MPa的压力下透过原液，加入4倍原液的纯水加透，得到截留液。将截留液浓缩到后真空干燥，可以得到产品2.12g，经HPLC检测(如图3所示)1-DNJ含量为51.38％，回收率为90.77％。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些都不会影响本发明实施的效果和实用性。