秦皮乙素在新生隐球菌感染性疾病中的应用

摘要

本发明涉及秦皮乙素在新生隐球菌感染性疾病中的应用。本发明通过体内体外实验证实了秦皮乙素体外能抑制新生隐球菌的活性、还能抑制新生隐球菌胞内增殖以及新生隐球菌泰坦细胞的形成，还发现秦皮乙素可降低新生隐球菌感染小鼠肺部载菌量，其治疗效果与两性霉素B相当，可为治疗肺部感染性疾病提供新的药物选择。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是关于秦皮乙素在新生隐球菌感染性疾病中的应用。

背景技术

肺隐球菌病是由经呼吸道吸入隐球菌菌体或孢子导致的侵袭性真菌感染疾病，感染病原体为新生隐球菌或格特隐球菌。隐球菌病好发于免疫抑制患者中，是晚期HIV感染患者常见的机会性感染，发病率/致死率高。目前临床上用于治疗真菌感染的药物主要是多烯类、唑类、烯丙胺类、氟嘧啶类和棘白菌素，例如两性霉素B、氟康唑、5-氟胞嘧啶和卡泊芬净等。两性霉素B自上世纪50年代以来进入临床使用，一直是治疗隐球菌病的黄金标准。然而其具有严重的宿主毒性，这限制了其在临床上的应用。5-氟胞嘧啶是临床上有效的抗肿瘤药物，具有显著的肝毒性和骨髓毒性，并且单独使用会出现耐药现象。卡泊芬净治疗隐球菌感染无效，而唑类药物不能彻底杀死真菌，应用前景受限。近年来，临床分离的新生隐球菌对氟康唑的耐药性逐渐增加。

隐球菌可以形成异常大的多倍体巨大细胞，即泰坦细胞(Titancells)，以更好的适应宿主环境，促进在宿主体内的散播。与典型细胞相比，泰坦细胞对氟康唑的耐受性更高，并且泰坦细胞产生的子细胞对氟康唑的耐药性增加。有研究报道，经氟康唑处理的泰坦细胞所产生的子代正常细胞几乎都存在染色体加倍情况，并且氟康唑对子代细胞的最小抑菌浓度(MIC)均高于亲代细胞。泰坦细胞致密且高度交联的荚膜组织能够有效阻止抗真菌药物渗透到细胞膜，提高新生隐球菌对抗真菌药物的耐药。泰坦细胞难以被抗真菌药物清除，导致隐球菌反复感染，迁延不愈，再加上目前全球隐球菌病的发病率和死亡率居高不下，治疗药物匮乏，为世界经济造成了极大的负担。因此，目前迫切需要深入研究新的抗隐球菌药物，从而降低隐球菌病带来的健康威胁及经济负担。

秦皮乙素是秦皮药材质量控制的指标性成分，其中秦皮是常用的中药材，具有清热燥湿，收涩止痢，止带，明目的功效，其中香豆素类化合物是秦皮的主要活性成分。文献(聂安政,林志健,张冰.秦皮化学成分和药理作用研究进展[J].中草药,2016,47(18):3332-3341)中对秦皮化学成分及药理作用研究进展进行了综述，提示其具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等作用，但实际上关于秦皮的研究和开发还处于起步阶段，活性成分的研究还不够系统，药理作用的研究也不够深入，探索其新用途具有重要意义。

中文专利CN108042528A，公开日2018.05.18，公开了秦皮乙素在制备治疗和预防眼部疾病药物或保健品中的应用。本发明首次明确并发现了秦皮乙素抗氧化作用对眼部细胞的保护作用。对于包含了氧化损伤致病因素的眼部疾病具有显著抗凋亡治疗功效，是一个具有开发前景的化合物，为临床治疗涉及眼部氧化损伤及凋亡的疾病提供了一种新的药物。

而目前关于秦皮乙素在新生隐球菌感染性疾病中的应用还未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种秦皮乙素的应用。

本发明的第二个目的是，提供一种药物组合物。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

秦皮乙素在制备治疗新生隐球菌感染性疾病药物中的应用。

作为一个优选例，所述新生隐球菌感染性疾病为肺部新生隐球菌感染性疾病。

更优选地，所述的秦皮乙素每次应用的有效剂量为30-60mg/kg。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种治疗新生隐球菌感染性疾病的药物组合物，所述的药物组合物以秦皮乙素为活性成分。

作为一个优选例，所述的药物组合物还包括还包含药学上可接受的载体或赋形剂。

更优选地，所述药学上可接受的载体或赋形剂选自溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、矫味剂、矫嗅剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、pH调节剂、稳定剂、表面活性剂或防腐剂中的一种或几种。

更优选地，所述剂型为固体制剂、半固体制剂或液体制剂。

更优选地，所述固体制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂和/或丸剂；所述半固体制剂包括凝胶剂、栓剂和/或膏剂；所述液体制剂包括乳剂、合剂、混悬剂和/或溶液剂。

本发明优点在于：提供了一种新的抗隐球菌药物，从而降低隐球菌病带来的健康威胁及经济负担。

附图说明

图1为巨噬细胞胞内增殖实验(AmB：两性霉素b)。

图2为秦皮乙素体外对新生隐球菌泰坦细胞形成的影响。

图3为新生隐球菌感染C57BL/6小鼠肺部载菌量。

图4为新生隐球菌感染C57BL/6小鼠肺组织HE染色结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下述实施例中，所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得，涉及的实验方法，检测方法若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1细胞实验

1、秦皮乙素体外具有抑制新生隐球菌的活性

方法：

秦皮乙素的体外药物敏感性实验采用美国临床实验室标准化协会(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CLSI)CLSI-M27A3和M38A2文件所推荐的微量液基稀释法(BrothMicrodilution)。取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI1640培养液200μL作空白对照；每排3-12号孔各加RPMI1640培养液100μL；每排2号孔加入RPMI1640培养液180μL和5mg/ml秦皮乙素溶液20μL，充分混匀，2-11号孔两倍比稀释，12号孔不含药物，作阳性对照，重复三排。96孔板上秦皮乙素的终浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125μg/mL，保证每孔中DMSO含量小于1％。过夜培养的新生隐球菌H99转接到新鲜YPD培养基中，30℃、200rpm/min活化4h后，用无菌PBS洗三次，用RPMI1640重悬菌体。使用血细胞计数板将菌悬液浓度调整至1×10

结果：

秦皮乙素在单独使用时具有抑制新生隐球菌的活性，其最小抑菌浓度(MIC)为31.25μg/mL。

2、秦皮乙素抑制新生隐球菌胞内增殖

方法：

将培养16h后的H99菌液离心，弃去上清。用PBS反复3次洗涤菌株。最后用DMEM培养基重悬，用血球计数仪将菌液浓度调至2×10

结果：

我们使用J774A.1巨噬细胞吞噬新生隐球菌实验来验证秦皮乙素在巨噬细胞胞内清杀新生隐球菌的效应。我们分别使用2倍MIC(62.5μg/mL)秦皮乙素和2倍MIC(1μg/mL)的两性霉素B处理吞噬新生隐球菌的巨噬细胞24h。结果显示(图1)，与对照组相比，2倍MIC(62.5μg/mL)秦皮乙素能够抑制巨噬细胞胞内新生隐球菌的增殖，说明秦皮乙素能够抑制新生隐球菌在巨噬细胞胞内的增殖。

3、秦皮乙素能够抑制新生隐球菌泰坦细胞的形成

方法：

新生隐球菌在10mLYPD中30℃过夜培养。使用MM诱导培养基(15mM D-葡萄糖，10mM硫酸镁，29.4mM磷酸二氢钾，13mM甘氨酸以及3μM硫胺素)洗三遍，用血球计数器计数细胞浓度，以1×10

结果：

在体外检测了秦皮乙素对新生隐球菌泰坦细胞形成的影响。体外使用MM培养基诱导3-4天后，显微镜检测泰坦细胞形成比例。根据文献报道，细胞直径超过10μm即为泰坦细胞，结果显示，使用1倍和2倍MIC浓度的秦皮乙素处理新生隐球菌后，泰坦细胞形成比例减少至25.5％(p<0.05)和17.5％(p<0.0001)，具有统计学差异(图2)。

实施例2秦皮乙素降低新生隐球菌感染小鼠肺部载菌量

方法：

使用气管吸入的方式感染小鼠，每只感染剂量为2.5×10

结果：

结果显示，与模型组对比，30mg/kg和60mg/kg的秦皮乙素能够显著降低小鼠肺部载菌量，且与两性霉素B效应相当(图3)。肺组织HE染色显示，新生隐球菌感染后肺组织形成明显的肉芽肿病变且伴有严重的肺泡结构破坏，给予两性霉素B和秦皮乙素治疗后，肺泡结构破坏明显改变，肉芽肿病变区域明显缩小、较为局限(图4)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。