包含2′-岩藻糖基乳糖的用于改善心脑血管疾病的食品组合物及用于预防或治疗心脑血管疾病的药物组合物

摘要

本发明涉及具有改善、预防或治疗由血栓形成引起的多种心脑血管疾病的效果的含有2′‑岩藻糖基乳糖的食品组合物及药物组合物，本发明的2′‑岩藻糖基乳糖(2'‑fucosyllactose，2'‑FL)对作为血小板激动剂的胶原相关肽(CRP，collagen‑related peptide)、胶原表现出拮抗(抑制)作用，可以用来抑制由血小板的非正常作用引起的血栓的形成。

说明书

技术领域

本发明涉及包含2′-岩藻糖基乳糖的用于改善、预防或治疗由血栓形成引起的心脑血管疾病的组合物，更具体地，涉及在由血栓形成引起的例如血液循环障碍、动脉硬化、血栓病、高血压、心肌梗塞、心绞痛及脑卒中等多种心脑血管疾病中具有改善效果的含有2′-岩藻糖基乳糖的食品组合物及含有2′-岩藻糖基乳糖的药物组合物。

背景技术

由于饮食习惯、生活方式的西式化以及老龄人口的增加，以血液循环障碍为病因的心脑血管系统疾病的发病大幅增加，根据2018年死亡原因统计资料，在十大死亡原因中，心脏疾病、脑血管疾病、高血压疾病分别占据第二、第四、第十位，已经成为严重的社会问题。

与血液相关的因子大体分为血细胞和血液凝固因子，为了防止因血管损伤引起出血的血小板凝聚、血栓形成引起的止血作用以及在病态生理状态下因血小板的非正常过度激活引起的血栓形成及血管栓塞是引起血管疾病的重要病因。

因此，需要持续摄取或给药能够清除血栓或抑制血栓形成的食品或药品，现有的与血液循环改善相关的药品具有胃肠障碍、血压上升等副作用，因此难以服用。因此，需要开发能够在副作用小、对人体安全且能够通过抑制血栓形成从根本上改善血液循环障碍的产品。

另一方面，人类母乳中含有200种以上具有独特结构的人乳寡糖(human milkoligosaccharides，HMO)，其浓度(5～15g/L)明显高于其他哺乳动物的乳汁。据报告，人乳寡糖(HMO)提供帮助肠内乳酸菌繁殖的益生元(prebiotic)效果、预防病原菌感染、调节免疫系统以及给大脑发育等幼儿的成长和健康带来积极影响等多种生物学活性。

人乳寡糖由D-葡萄糖(Glc)、D-半乳糖(Gal)、N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)、L-岩藻糖(L-fucose，Fuc)以及唾液酸(sialic acid)(Sia；N-乙酰神经氨酸(N-acetyl neuraminic acid，Neu5Ac))构成。人乳寡糖的结构非常多样且复杂，因此约200种与其他残基具有糖苷键的异构体能够以互不相同的聚合度(DP 3-20)存在。然而，虽然结构复杂，但人乳寡糖具有几种共同的结构。大部分人乳寡糖在还原末端具有乳糖(Galβ1-4Glc)残基。乳糖的Gal可以通过α-(2,3)-和α-(2,6)-键分别唾液酸化为3-唾液乳糖(3-sialyllactose)或6-唾液乳糖(6-sialyllactose)的形态，或者通过α-(1,2)-和α-(1,3)-键分别岩藻糖基化(fucosylation)为2′-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyllactose，2-FL)或3-岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose，3-FL)的形态。

在母乳中发现约200种复合寡糖，包含含量最高的三种寡糖的137种被岩藻糖基化，比例接近77％，其余寡糖大部分被唾液酸化(39种)，约占28％。其中，据报告，尤其以2′-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖为与前面所述的多种生理学活性相关的主要人乳寡糖。

在本发明中，欲利用被认证为安全的源自人类母乳的人乳寡糖，开发能够用来改善、预防或治疗由血栓引起的心脑血管疾病的材料。

发明内容

技术问题

在本发明中，利用人乳寡糖开发并提供在由血栓形成引起的例如血液循环障碍、动脉硬化、血栓病、高血压、心肌梗塞、心绞痛及脑卒中等多种心脑血管疾病中具有改善效果的食品组合物以及具有预防或治疗效果的药物组合物。

技术方案

本发明提供包含2′-岩藻糖基乳糖的用于改善由血栓引起的心脑血管疾病的食品组合物。

在本发明的用于改善心脑血管疾病的食品组合物中，优选地，上述血栓可以为由血小板引起的血液凝固发生的血栓。

在本发明的用于改善心脑血管疾病的食品组合物中，上述由血小板引起的血液凝固可以为因作为血小板激动剂(agonist)的胶原相关肽(CRP，collagen-related peptide)或胶原(collagen)的作用而发生的血液凝固。

在本发明的用于改善心脑血管疾病的食品组合物中，优选地，上述心脑血管疾病可以为选自血液循环障碍、动脉硬化、血栓病、高血压、心肌梗塞、心绞痛及脑卒中中的任一种。

并且，本发明提供包含2′-岩藻糖基乳糖的用于预防或治疗由血栓引起的心脑血管疾病的药物组合物。

在本发明的用于预防或治疗心脑血管疾病的药物组合物中，优选地，上述血栓可以为由血小板引起的血液凝固发生的血栓。

在本发明的用于预防或治疗心脑血管疾病的药物组合物中，上述由血小板引起的血液凝固可以为因作为血小板激动剂的胶原相关肽或胶原的作用而发生的血液凝固。

在本发明的用于预防或治疗心脑血管疾病的药物组合物中，上述心脑血管疾病可以为选自血液循环障碍、动脉硬化、血栓病、高血压、心肌梗塞、心绞痛及脑卒中中的任一种。

发明的效果

通过本发明确认到，本发明的2′-岩藻糖基乳糖对于作为血小板激动剂的胶原相关肽(CRP)、胶原表现出拮抗(抑制)作用，可以用来抑制由血小板的非正常作用引起的血栓形成。因此，在坚持摄取或给药本发明的2′-岩藻糖基乳糖的情况下，可以改善如血液循环障碍、动脉硬化、血栓病、高血压、心肌梗塞、心绞痛及脑卒中等由血栓形成引起的心脑血管疾病。

另一方面，确认到本发明的2′-岩藻糖基乳糖只对作为血小板激动剂的胶原相关肽、胶原表现出拮抗(抑制)作用，对在紧急状况下用来止血的凝血酶没有抑制作用。对于凝血酶没有抑制作用在临床上具有非常重要的意义，这是因为在因事故等发生出血时要紧急给药凝血酶。若本发明的2′-岩藻糖基乳糖除胶原相关肽、胶原以外还对凝血酶具有抑制效果，那么发生事故时即使给药凝血酶也无法实现止血，若如此，则持续给药2′-岩藻糖基乳糖就可能带来危险。但惊人的是，本发明的2′-岩藻糖基乳糖不妨碍凝血酶的作用，因此，即使平时持续给药，也不会给发生事故时通过给药凝血酶进行的止血诱导带来任何问题。

附图说明

图1示出在本发明的实验中使用的低聚果糖(fructooligosaccharide，FOS)、2′-岩藻糖基乳糖及3-岩藻糖基乳糖的结构。

图2示出人乳寡糖的血小板凝集力抑制效果。

图3确认了人乳寡糖的血小板激活抑制机制。

图4为通过细胞增殖与毒性分析(CCK assay)测定人乳寡糖的细胞毒性的结果。

图5为在动物模型中确认人乳寡糖的血栓病抑制功效的结果。

图6为在动物模型中确认人乳寡糖的止血作用功效的结果。

具体实施方式

本发明提供包含2′-岩藻糖基乳糖的用于改善由血栓引起的心脑血管疾病的食品组合物。并且，本发明提供包含2′-岩藻糖基乳糖的用于预防或治疗由血栓引起的心脑血管疾病的药物组合物。在此情况下，上述心脑血管疾病可以为选自血液循环障碍、动脉硬化、血栓病、高血压、心肌梗塞、心绞痛及脑卒中中的任一种。

在本发明的用于改善心脑血管疾病的食品组合物及用于预防或治疗心脑血管疾病的药物组合物中，优选地，上述血栓可以为由血小板引起的血液凝固发生的血栓。在此情况下，优选地，上述由血小板引起的血液凝固可以为因作为血小板激动剂的胶原相关肽或胶原的作用而发生的血液凝固。

在本发明的用于改善心脑血管疾病的食品组合物及用于预防或治疗心脑血管疾病的药物组合物中，优选地，本发明的2′-岩藻糖基乳糖可以抑制作为血小板激动剂的胶原相关肽或胶原血小板激动剂作用。即，可以推论为本发明的2′-岩藻糖基乳糖通过作用于“以糖蛋白VI(GPVI，Glycoprotein VI；一种胶原的糖蛋白受体(a glycoprotein receptorfor collagen))为媒介的血小板凝集信号传导通路”来抑制血小板的激活。

在上述本发明的用于改善心脑血管疾病的食品组合物及用于预防或治疗心脑血管疾病的药物组合物中，优选地，上述2′-岩藻糖基乳糖可以不抑制作为血小板激动剂的凝血酶对血小板的激动剂作用。即，可以推论为本发明的2′-岩藻糖基乳糖对于“以G蛋白偶联受体(GPCR，G-protein coupled receptor)信号传导通路为媒介的血小板激活”没有表现出抑制效果。

健康人的血液在血管中不发生凝固，但在因血管损伤、血液停滞、凝固性提高等情况发生的病灶中形成凝固的团块，即，形成“血栓”。

血栓的形成与血细胞之一的血小板有关，血小板为从骨髓内的巨核细胞中脱落的细胞质形成的直径为2μm～3μm的细胞块，在血液的凝固中起到重要作用。

在抑制出血的正常过程中，如上所述的血液凝固作用是生存所必需的，但除出血以外，即使是其他原因引起的血栓形成或者出血引起的正常过程，但若产生过多的血栓，则该处血管会变窄或阻塞，从而妨碍或阻挡血液的流动。如上所述的非正常的血栓形成成为妨碍血液流动，即，妨碍血液循环的因素，可诱发血液循环障碍、动脉硬化、血栓病、高血压、心肌梗塞、心绞痛及脑卒中等多种心脑血管疾病。

由血小板引起的血液凝固通过激动剂来诱导，血小板激动剂有胶原相关肽、胶原、凝血酶(thrombin)、血栓素A2类似物(thromboxane A2 analogue，U46619)等。胶原相关肽、胶原在以糖蛋白VI(GPVI)为媒介的血小板凝集信号传导通路中在血小板凝集中起到重要作用。并且，凝血酶、血栓素A2类似物在以G蛋白偶联受体(GPCR)信号传导通路为媒介的血小板凝集中起到重要作用。

在下述本发明的实验中，以上述4种激动剂为对象，确认了作为人乳寡糖的2′-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖以及作为阳性对照物的低聚果糖(FOS)是否有拮抗(抑制)作用。但奇特的是，可以确认只有2′-岩藻糖基乳糖对4种激动剂中的胶原相关肽、胶原表现出拮抗作用。而结构与2′-岩藻糖基乳糖非常相似的3-岩藻糖基乳糖却未表现出拮抗效果。并且，确认到2′-岩藻糖基乳糖只对激动剂中的胶原相关肽、胶原具有拮抗作用，对凝血酶没有拮抗作用。

对凝血酶没有抑制作用在临床上具有非凡的意义，这是因为在因事故等发生出血时要紧急给药凝血酶。若本发明的2′-岩藻糖基乳糖除胶原相关肽、胶原以外还对凝血酶具有抑制效果，那么发生事故时即使给药凝血酶也无法实现止血，若如此，则持续给药2′-岩藻糖基乳糖就可能带来危险。但惊人的是，本发明的2′-岩藻糖基乳糖不妨碍凝血酶的作用，因此，即使平时持续给药也不会给发生事故时通过给药凝血酶进行的止血诱导带来任何问题。

并且，在动物模型中进行有关颈动脉血栓病及止血作用的实验时，本发明的2′-岩藻糖基乳糖浓度依赖性地示出颈动脉血栓病抑制效果，确认到这是可与现有的血栓治疗剂阿司匹林比肩的功效。并且，确认到其不给现有合成药物的副作用——止血作用带来影响，由此确认到其具有可以替代现有血栓治疗剂阿司匹林的副作用的功效。因此，可以确认上述2′-岩藻糖基乳糖能够在生物体内用作改善血液循环的保健功能食品或治疗材料。

另一方面，本发明的食品组合物的剂型不受特别限制，作为一例，可以为肉类、谷类、咖啡因饮料、普通饮料、巧克力、面包类、小食品类、饼干类、披萨、果冻、面类、口香糖类、冰淇淋类、酒精饮料、酒、维生素复合剂，此外，还可以为选自丸、片、颗粒等保健辅助食品类中的任一种。

可以在食品中以0.01重量百分比～99重量百分比的比例添加2′-岩藻糖基乳糖来组成，例如，对于保健辅助食品组合物中含有的2′-岩藻糖基乳糖的浓度，以制备成1600mg的片剂为基准，优选地，可以含有100mg～1000mg，以一天一次的方式长期摄取为佳。

另一方面，除2′-岩藻糖基乳糖以外，本发明的药物组合物还可以包含药剂学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。可接受的载体、赋形剂或稀释剂有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油，可以使用它们中的一种以上。并且，还可以包含填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂或防腐剂等。

另一方面，本发明药物组合物的剂型可以根据使用方法制备为优选的形态，尤其以选择本发明所属技术领域中公知的方法配制来在向哺乳动物给药后能够迅速、持续或延迟释放活性成分为佳。具体剂型的例可以为选自硬膏剂(PLASTERS)、颗粒剂(GRANULES)、乳液(LOTIONS)、擦剂(LINIMENTS)、柠檬水剂(LEMONADES)、芳香水剂(AROMATIC WATERS)、散剂(POWDERS)、糖浆剂(SYRUPS)、眼软膏剂(OPHTALMIC OINTMENTS)、液剂(LIQUIDS ANDSOLUTIONS)、气雾剂(AEROSOLS)、浓缩剂(EXTRACTS)、药水剂(ELIXIRS)、软膏剂(OINTMENTS)、流浸膏剂(FLUIDEXTRACTS)、乳剂(EMULSIONS)、悬混剂(SUSPENSIONS)、汤剂(DECOCTIONS)、浸剂(INFUSIONS)、滴眼剂(OPHTHALMIC SOLUTIONS)、片剂(TABLETS)、栓剂(SUPPOSITORIES)、注射剂(INJECTIONS)、醑剂(SPIRITS)、巴布剂(CATAPLASMA)、胶囊剂(CAPSULES)、霜剂(CREAMS)、含片剂(TROCHES)、酊剂(TINCTURES)、糊剂(PASTES)、丸剂(PILLS)、软质或硬质明胶胶囊中的任一种。

另一方面，本发明的药物组合物的给药量以考虑给药方法、服用人员的年龄、性别、体重及疾病的严重程度等来决定为佳。例如，优选地，以2′-岩藻糖基乳糖为基准，一天给药24mg/kg(体重)～40mg/kg(体重)的本发明的药物组合物一次。但上述给药量仅为用于例示的一例，医生的处方可根据服用人员的状态来改变。

以下，通过下述实施例和实验例更为详细地说明本发明。但本发明的权利范围不限定于下述实施例及实验例，还应包括与之等价的技术思想的变形。

实施例1：确认基于人乳寡糖的选择性血小板凝集抑制效果

(1)实验目的

本发明探索利用人乳寡糖作为血液循环改善战略材料的可能性。为此，本实验中利用人乳寡糖中的2′-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖以及作为阳性对照物的低聚果糖来确认血小板活性抑制机制，进而确认改善由血小板的作用引起的血液循环障碍的功效。

(2)实验材料及方法

①材料

人凝血酶(Human thrombin)、血栓素A2类似物(U46619)、前列腺素E1(PGE1)以及所有试剂均从西格玛公司(圣路易斯(St.Louis)，密苏里州(MO))购入。D-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-氯甲酮(D-Phe-Pro-Arg-chloromethyl ketone，PPACK)从EMD密理博(Millipore)公司(比尔里卡(Billerica)、马萨诸塞州(MA))购入。I型马腱胶原(Equinetendon collagen type I)从科鲁诺-罗格公司(Chrono-log)(哈福镇(Havertown)，宾夕法尼亚州(PA))购入，胶原相关肽(Collagen-related peptide，CRP)从理查德法恩戴尔博士(Dr.Richard Farndale)(生物化学系(Department of Biochemistry)，剑桥大学(University of Cambridge)，英国(UK))处购入来在本实验中使用。藻红蛋白-缀合的同种型对照免疫球蛋白G(Phycoerythrin(PE)-conjugated isotype control IgGs)、藻红蛋白抗小鼠CD62P(PE anti-mouse CD62P(P选择素(P-selectin))抗体(antibody)以及藻红蛋白抗小鼠(PE anti-mouse)αIIbβ3(JON/A)抗体从生物传奇(Biolegend)公司(圣迭戈(SanDiego)，加利福尼亚州(CA))购入。2′-岩藻糖基乳糖及3-岩藻糖基乳糖使用(株)AP技术公司(AP Technology)生产的材料。

②血小板分离方法

使用通过柠檬酸盐-葡萄糖溶液(ACD，西格玛公司)预处理的注射器从小鼠(6周龄-8周龄)的腹部经脉采血来获得血小板。为了获得血小板丰富的血浆(platelet-richplasma，PRP)，在室温下以300×g的条件离心分离20分钟后，向从红细胞中分离的血浆中加入0.5μM的前列腺素E1后以700×g的条件再次离心分离4分钟。使用含有10％的柠檬酸盐-葡萄糖溶液的4-羟乙基哌嗪乙磺酸-台氏液(HEPES-Tyrode)缓冲液(5mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸/氢氧化钠(HEPES/NaOH)、pH7.3，5mM的葡萄糖、136mM的氯化钠(NaCl)、12mM的碳酸氢钠(NaHCO

③血小板凝集分析方法

在37℃的温度下分别使用溶剂(Vehicle)(蒸馏水(distilled water))、1000μM的低聚果糖、3-岩藻糖基乳糖以及多种浓度(300μM～1000μM)的2′-岩藻糖基乳糖预处理以3×10

④流式细胞(Flow cytometry)分析

利用流式细胞仪(Flow cytometry)(Gallios牌，贝克曼库尔特(BeckmanCoulter)公司)测定已知为血小板活性生物标记物(biomarker)的血小板P选择素及αIIbβ3的活性度。在37℃的温度下分别使用溶剂(蒸馏水)、1000μM的低聚果糖、3-岩藻糖基乳糖以及多种浓度(300μM～1000μM)的2′-岩藻糖基乳糖预处理小鼠血小板，为了测定血小板活性，在37℃的温度下使用0.15μg/ml的胶原相关肽处理小鼠血小板5分钟后，利用P选择素及αIIbβ3抗体测定活性度。

⑤统计处理

统计分析为利用GraphPad Prism 5来进行资料分析。利用多组方差分析(ANOVA)、多组比较的Dunnett检验(Dunnett's test for comparisons of multiple group)、两组比较的学生t检验(Student's t-test for comparisons of two groups)来分析统计学显著性。低于0.05的P值视作显著结果。

(3)实验结果

①确认基于人乳寡糖的血小板凝集抑制功效

为了查明人乳寡糖给血小板功能带来的影响，首先调查对血小板凝集力的功效。

结果如图2所示。图2的曲线图中横轴的“透光率(light transmission)”为表示血小板凝集随着光透过的增加而增多的尺度，利用了如下原理：原本血小板以漂浮细胞(floating cell)的方式漂浮，随着被血小板激动剂激活，血小板的形态发生变化并发生凝集，从而透光率增加。普通血小板的完全凝集需要约300秒钟，图2的曲线图中横轴的“时间(秒钟)(time(sec))”表示在该时间内测定的血小板的凝集程度。

在本实验结果中，将使用人乳寡糖中的2′-岩藻糖基乳糖预处理的血小板与对照组(溶剂)的使用蒸馏水预处理的血小板进行比较，在由血小板激动剂中的胶原相关肽(0.15μg/ml)和胶原(0.5μg/ml)(图2的A)部分和图2的B)部分)诱导的血小板凝集中，确认到血小板凝集力浓度依赖性地显著减少。在使用低聚果糖和3-岩藻糖基乳糖预处理的血小板中，确认到由胶原相关肽和胶原诱导的血小板凝集未得到显著抑制。并且，在使用2'-岩藻糖基乳糖预处理的血小板中，与对照组相比，由凝血酶(0.025U/ml)和血栓素A2类似物(3μM)(图2的C)部分和图2的D)部分)诱导的血小板凝集力抑制功效未观察到显著差异。即，2′-岩藻糖基乳糖不对由凝血酶和血栓素A2类似物诱导的血小板凝集力示出抑制功效。

这样的结果视作人乳寡糖中只有2′-岩藻糖基乳糖在以糖蛋白VI为媒介的血小板凝集信号传导通路中选择性地对血小板凝集起到重要作用。相反，可以推论2′-岩藻糖基乳糖对通过G蛋白偶联受体信号传导通路激活血小板凝集反应的凝血酶和血栓素A2类似物没有抑制功效。

②确认基于人乳寡糖的血小板激活抑制机制

确认基于人乳寡糖的血小板激活抑制机制。利用流式细胞分析(flow cytometryanalysis)分析人乳寡糖对在血小板激活中诱导正反馈循环(positive feedback cycle)的过程中用作血小板活性生物标记物的血小板的α-颗粒(α-granule)的P选择素及αIIbβ3整联蛋白(αIIbβ3integrin)激活调节机制的功效。

由于在前面的血小板凝集力抑制实验中已经确认到人乳寡糖中只有2′-岩藻糖基乳糖在以糖蛋白VI为媒介的血小板凝集信号传导通路中选择性地对血小板凝集起到重要作用，因此，在本血小板激活实验中，只利用胶原相关肽进行激活功效抑制试验。

在37℃的温度下分别使用溶剂(蒸馏水)或低聚果糖、2′-岩藻糖基乳糖以及3-岩藻糖基乳糖预处理血小板15分钟，在37℃的温度下使用0.15μg/ml的胶原相关肽激活5分钟后，利用P选择素及αIIbβ3抗体测定血小板活性度。

结果如图3所示。当血小板被激活时，因血小板的激活信号，随着原本在α-颗粒中的P选择素向血小板细胞外漂出，进一步强烈地引起血小板的激活，在血小板-血小板凝集中重要的αIIbβ3的活性增加使αIIbβ3与纤维蛋白原(fibrinogen)的结合增加，从而更多地引起血小板-血小板凝集。因此，利用流式细胞仪测定P选择素的接触水平(exposurelevel)和aIIbβ3的激活水平(activation level)作为血小板活性的尺度，在曲线图中，波峰越向左移动，则表示随着血小板活性的P选择素的接触水平和aIIbβ3的激活水平越低，表示2′-岩藻糖基乳糖具有浓度依赖性地抑制血小板活性的功效。

通过与对照组(溶剂)比较，确认到人乳寡糖中只预处理2′-岩藻糖基乳糖的血小板中浓度依赖性地显著抑制小鼠血小板α-颗粒的P选择素(图3的A)部分)及血小板的αIIbβ3整联蛋白(图3的B)部分))的激活。上述结果视作2′-岩藻糖基乳糖通过颗粒分泌和抑制αIIbβ3整联蛋白的激活来选择性地抑制血小板的激活。

实验例1：人乳寡糖的细胞毒性测试

在本实验例中，通过细胞增殖与毒性分析(Oh,Y.C.；Jeong,Y.H.；Pak,M.E.；Go,Y.,Banhasasim-Tang Attenuates Lipopolysaccharide-Induced Cognitive Impairmentby Suppressing Neuroinflammation in Mice.Nutrients 2020,12,(7))测定人乳寡糖的细胞毒性。由于未确立能够测定对血小板的细胞毒性的方案，使用人乳寡糖(HMO)(2′-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖)浓度依赖性地预处理HepG2细胞。24小时后，向各孔(well)中处理细胞技术试剂盒溶液(Cell counting kit solution)(同仁分子技术公司(DojindoMolecular Technologies,Inc.))并追加培养1小时后，利用酶标仪(Microplate reader)在450nm的波长处测定吸光度。

使用人乳寡糖预处理HepG2细胞来测定细胞存活率(cell viability)的结果如图4所示，未确认到由人乳寡糖(2′-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖)的处理引起的HepG2细胞的细胞凋亡，由此可以得出人乳寡糖没有细胞毒性的结论。

实施例2：确认基于人乳寡糖的与血液循环改善相关的血小板活性(生物体内(invivo))功效

(1)实验目的

在颈动脉结扎血栓动物模型中评估人乳寡糖的血液循环改善功效，口服给药后(生物体外(ex vivo))确认血小板的凝集及活性功效。

(2)实验动物准备及实验方法

①准备实验动物

从(株)都耶(DOOYEOL)生物技术公司购入实验中使用的雄性C57BL/6(6周龄～8周龄)小鼠，在23±1℃和56％的相对湿度条件下经过供应普通饲料的1周的驯化时间后在实验中使用。下述动物实验根据韩国韩医研究院实验动物伦理委员会认证的动物实验计划书方案来进行(认证号：20-058)。

②利用氯化铁(FeCl

为了制备血栓病诱导小鼠模型，利用了氯化铁(10％)。向小鼠口服给药2′-岩藻糖基乳糖(500mg/kg BW，1000mg/kg BW)、3-岩藻糖基乳糖(1000mg/kg BW)或阿司匹林(ASA)(100mg/kg BW)7天，在最后一次口服给药2小时后，使用2％的异氟烷麻醉小鼠后，分离出小鼠的左侧颈动脉，利用沾有氯化铁(10％)的滤纸(直径2mm)放置在颈动脉上2分钟来诱导血栓病。利用血流量计(AD测量仪，血流量计)测定血流量。

③尾部流血时间(Tail bleeding time)动物模型制备及止血作用测定

为了测定由血栓病引起的止血作用，实施了尾部流血时间测定(tail bleedingtime assay)。以一天一次的方式向小鼠口服给药2′-岩藻糖基乳糖(500mg/kg BW，1000mg/kg BW)、3-岩藻糖基乳糖(1000mg/kg BW)或阿司匹林(100mg/kg BW)7天，在最后一次口服给药2小时后，使用2％的异氟烷麻醉小鼠。然后，使用剃须刀片切割5mm小鼠尾部后将尾部固定在装有45mL的磷酸盐缓冲溶液(PBS)的50mL的锥形管(conical tube)中后，测定出血时间及出血量。具体过程及照片如图6的(A)部分所示。通过测定使用45mL的磷酸盐缓冲溶液收集的血中血红蛋白含量来定量血中血流的损失量。在此情况下，使用加热垫使体温保持37℃。

④统计处理

在统计分析中，利用GraphPad Prism 5来实施资料分析。利用多组方差分析、多组比较的Dunnett检验、两组比较的学生t检验来分析。低于0.05的P值视作显著结果。

(3)实验结果

①在颈动脉血栓病动物模型中确认基于人乳寡糖的血栓病发生抑制效果

在血管损伤的情况下，血小板被激活而凝集在受损部位，从而止住因受损而发生的出血，但在疾病/病理生理阶段中引起血栓，此时血小板活性起到非常重要的作用。

在血栓病诱导小鼠模型中确认血栓病发生抑制功效的结果如图5所示，对照组(溶剂)中的颈动脉闭塞时间平均为7.47分钟，在低浓度(500mg/kg BW)的2′-岩藻糖基乳糖给药组中平均为11.79分钟，而在高浓度(1000mg/kg BW)的2′-岩藻糖基乳糖给药组中平均为14.52分钟，颈动脉闭塞时间显著增加。相反，在口服给药高浓度(1000mg/kg BW)的3-岩藻糖基乳糖的小鼠中，颈动脉闭塞时间8.18分钟，与对照组没有显著差异。并且，高浓度(1000mg/kg BW)的2′-岩藻糖基乳糖给药组中的颈动脉闭塞时间表现出与作为阳性对照组(标记为ASA)的阿司匹林(Aspirin)(100mg/kg BW)处理组的18.05分钟相同水平的颈动脉闭塞时间。

②在颈动脉血栓病模型中确认基于人乳寡糖的止血功效

在血管损伤的情况下，血小板被激活而凝集并附着在受损部位，从而起到抑制血管损伤引起的出血的止血作用。确认在上述实验的颈动脉血栓病中示出浓度依赖性的抑制功效的2′-岩藻糖基乳糖给止血作用带来怎样的影响。

切割血栓病诱导小鼠模型的尾部后测定出血时间及出血量的结果如图6的(B)部分所示，高浓度3-岩藻糖基乳糖给药组及低浓度2′-岩藻糖基乳糖给药组、高浓度2′-岩藻糖基乳糖给药组的小鼠尾部出血时间与对照组比较时，在统计学上未表现出显著差异。并且，将切割部位中采集的血液和血红蛋白含量与对照组比较来定量化的结果如图6的(C)部分所示，喂食人乳寡糖的小鼠中的血流损失量与对照组相比没有显著差异。但口服给药100mg/kg BW的阿司匹林7天时，与2′-岩藻糖基乳糖和对照组相比，出血时间和血红蛋白含量显著增加，这样的结果可以确认人乳寡糖在生物体内不给止血作用带来显著影响，从而具有能够用作替代现有血栓治疗剂阿司匹林的副作用的治疗材料的可能性。