一种不影响免疫系统的新型抗炎分子

摘要

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种不影响免疫系统的新型抗炎分子，所述抗炎分子为硫氧还蛋白。硫氧还蛋白是本身就存在于体内的一种蛋白质，本申请利用转基因技术成功提取了重组的人硫氧还蛋白，并进行相关动物研究，不仅证明了硫氧还蛋白与糖皮质激素等同的抗炎效果，还说明了硫氧还蛋白能弥补糖皮质激素会抑制免疫系统的这一缺陷，解决糖皮质激素会导致免疫抑制而引起的一系列问题，还为新型抗炎药剂研发提供了新的选择。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种不影响免疫系统的新型抗炎分子。

背景技术

目前临床上，糖皮质激素是一种广泛用于抗炎的物质，但其存在巨大的免疫抑制副作用，长期或者大量使用会造成免疫系统功能下降从而引发继发性感染。

基于此，寻找一种既有良好抗炎效果，又不会对免疫系统造成干扰的新型分子尤为迫切。

发明内容

本发明希望提供一种用于抗炎分子，所述抗炎分子为硫氧还蛋白。

所述硫氧还蛋白包括生物体内本身存在的硫氧还蛋白或/和通过转基因技术重组的硫氧还蛋白。

所述抗炎分子用于减缓皮肤炎的作用。

所述抗炎分子用于减缓过敏性接触性皮肤炎的作用。

所述抗炎分子用于减缓急性刺激性皮肤炎的作用。

所述抗炎分子应用于研发抗炎制剂。

所述抗炎分子对人体免疫系统无抑制或干扰作用。

本发明的有益效果如下：

硫氧还蛋白（TRX）是本身就存在于体内的一种蛋白质，本申请利用转基因技术成功提取了重组的人硫氧还蛋白，并进行相关动物研究，对动物进行大剂量的糖皮质激素或硫氧还蛋白进行冲击治疗，并利用流式细胞仪对脾脏细胞的 CD4+T 细胞/CD8+T 细胞进行检测，并计算 CD4+T 细胞/CD8+T 细胞比例（这一比例代表着免疫系统的功能），结果发现：硫氧还蛋白的抗炎症效果与糖皮质激素相当，而且相比于正常小鼠，糖皮质激素冲击治疗的小鼠 CD4+T 细胞/CD8+T 细胞比例下调，而等剂量的硫氧还蛋白冲击治疗小鼠的 CD4+T细胞/CD8+T 细胞比例则未发生明显变化，这一发现有望弥补现有的糖皮质激素会抑制免疫系统这一缺陷，为下一步研发新型抗炎制剂提供坚实理论基础。

附图说明

图1为免疫系统抑制模型的实验流程图；

图2为硫氧还蛋白有效缓解急性刺激性皮肤炎（ICD）的实验结果图；

图3为硫氧还蛋白有效缓解过敏性接触性皮肤炎（ACD）的实验结果图；

图4为硫氧还蛋白明显减少急性刺激性皮肤炎的炎症因子产生的实验结果图；

图5为TRX明显减少过敏性接触性皮肤炎的炎症因子产生的实验结果图；

图6为硫氧还蛋白抑制 MAPK 通路中 JNK 分子和 p38 分子的磷酸化激活的实验结果图；

图7为TRX通过调节 MAPK 通路发挥抗炎作用的实验结果图；

图8为TRX发挥抗炎作用的实验结果图；

图9为氢化可的松可通过诱导细胞内亮氨酸拉链蛋白 GILZ 的表达增加抗炎作用的实验结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

为探讨硫氧还蛋白或氢化可的松对免疫系统的影响，本申请涉及如下实验（流程图如图1所示）：一组小鼠单次腹腔注射氢化可的松125mg/kg 建立免疫抑制模型，另一组小鼠单次腹腔注射相同剂量的硫氧还蛋白。干预 24h后，取出小鼠脾脏，胰蛋白酶消化，用含1%BSA（牛血清白蛋白） 的 PBS （磷酸盐缓冲液）在 4℃下制备单细胞悬液。使用 APC（对乙酰水杨酸片）缀合的 CD3 原代抗体(CST，# 24265)标记 T 细胞，然后分别用 FITC（异硫荧光素）缀合的 CD4 抗体(ab269349)和 PE 缀合的 CD8 抗体(ab272343)标记 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞。抗体孵育 1h 后，离心，PBS 洗 3 次，4℃下重新悬浮于 PBS 中。使用FACSCalibur 流式细胞仪(美国贝克曼公司)进行细胞计数。

在上述检测过程中，动物模型的成功建立直接决定了测试的可信度。我们目前参考相关文献使用单次大剂量冲击疗法建立免疫系统抑制模型（Obmińska-Domoradzka B,Szczypka M, Debowy J. Effects of thymomimeticdrugs and zinc supplementationon the cellular immune response in hydrocortisone-suppressed mice. J Vet MedB Infect DisVet Public Health. 2002 Dec;49(10):469-75. doi: 10.1046/j.1439-0450.2002.00500.x. PMID: 12485356.），但其他方案建立免疫抑制模型情况下进行多次验证可以使得此论证更加充分有力。

其中图2分A、B、C、D、E和F六部分，A为鼠耳大体图片；B和C是利用HE染色后的细胞结构图；D为每一组选定表皮层下固定部位进行中性粒细胞计数，n=6；E为在给药后8小时，计数每只老鼠挠抓耳朵次数，n=6；F为分别在4h，8h，24h测鼠耳肿胀厚度，n=6；图片证明了硫氧还蛋白有效缓解了急性刺激性皮肤炎。图3分为A、B、C、D、E和F六部分，A为鼠耳大体图片；B和C为HE染色后的细胞结构图； D为在第5天与第6天分别测量的鼠耳厚度，并算得出肿胀厚度，n=6；E为每一组选定表皮层下固定部位进行中性粒细胞计数，n=6；F为在第5天DNFB（2，4二硝基氟苯）激发后8小时，计数每只老鼠挠抓耳朵次数，n=6。

图4表明对于IL-33和TSLP等过敏性相关因子，在急性刺激性皮肤炎的四组中表达无明显差异，均呈低水平表达，所以硫氧还蛋白明显减少了急性刺激性皮肤炎的炎症因子产生。图5由于IL-1β、TNF-α、IL-33和TSLP等细胞炎症因子及过敏性因子均呈差异性表达，因此证明 TRX 明显减少了过敏性接触性皮肤炎的炎症因子产生。图6由于在细胞中加入硫氧还蛋白干预后细胞中磷酸化JNK和p38表达水平显著下降，说明硫氧还蛋白可以抑制MAPK通路中JNK分子和p38分子的磷酸化激活，以此证明了硫氧还蛋白对抗炎症的具体作用靶点为MAPK信号通路中的JNK和p38分子。

图7通过LPS激活MAPK通路与SB203580抑制MAPK通路中的p38分子（一正一反两方面验证），证实TRX的抗炎作用与TLR4-MAPK通路有关。*与A组相比p<0.05，#与B组相比p<0.05，$两组相比p<0.5，说明TRX 可以通过调节 MAPK 通路来发挥抗炎作用。图8说明了TRX发挥抗炎作用是通过与氢化可的松不同的途径来实现的，通过单次腹膜内剂量（125mg /kg）氢化可的松进行免疫抑制模型建立，同时另一组小鼠注射等计量的TRX，流式细胞分析发现，氢化可的松组小鼠出现了CD4+T细胞/CD8+T细胞的比例发生了明显降低，而TRX组则与正常健康小鼠相近。图9进一步研究证实，氢化可的松可能通过诱导细胞内亮氨酸拉链蛋白 GILZ的表达增加来发挥了抗炎作用，而 TRX 则不会诱导 GILZ增加。注：糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白(Glucocorticoid inducedleucine zipper,GILZ)是近年来发现的GC/GR靶蛋白, 具有与GC类似的免疫抑制、抗炎、抑制细胞增殖等功能，被认为是糖皮质激素作用的重要介导子。

综上所述，本申请提出的重组的人源硫氧还蛋白不仅显示出与糖皮质激素等同的抗炎效果，更能弥补糖皮质激素会抑制免疫系统的这一缺陷，解决糖皮质激素会导致免疫抑制而引起的一系列问题，还为新型抗炎药剂研发提供了新的选择。

以上内容是结合本专利的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于上述这些说明，对于本专利所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本专利的保护范围。