连续流固相合成制备HGH(176-191)的方法

摘要

本发明公开了一种连续流固相合成制备HGH(176‑191)的方法，使用连续流固相合成法制备片段Fmoc‑Tyr(tBu)‑Leu‑Arg(Pbf)‑Ile‑Val‑Gln(Trt)‑Cys(Trt)‑Arg(Pbf)‑Ser(tBu)‑Val‑OH，主链以Wang树脂为载体，使用连续流固相合成法依次连接Fmoc‑Phe‑OH、Fmoc‑Cys(Trt)‑Gly‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Gly‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH,Fmoc‑Tyr(tBu)‑Leu‑Arg(Pbf)‑Ile‑Val‑Gln(Trt)‑Cys(Trt)‑Arg(Pbf)‑Ser(tBu)‑Val‑OH，得到肽树脂。该方法缩短了去保护和偶联时间，降低了氨基酸及溶剂用量，制备出的粗肽纯度达到80%以上，大大降低了合成成本。

说明书

技术领域

本发明属于多肽药物合成技术领域，具体涉及到一种连续流固相合成策略制备HGH(176-191)的方法。

背景技术

人类生长激素片段HGH (176-191)是由氨基酸位点176-191制备成的蛋白肽。HGH(176-191)中的HGH代表人类生长激素，已被证明可以减少脂肪和帮助减肥，使其成为一种非常理想的物质。HGH (176-191)作为 HGH 生长激素肽的一部分，通过模仿天然HGH调节人类新陈代谢的方式工作，但不会像整段HGH一样对胰岛素敏感性、血糖、细胞增殖或肌肉生长产生不良副作用，并且这种药物还可以促进抗衰老。事实上，HGH (176-191)比HGH在刺激脂肪分解上效果更为强劲,并能够抑制体内脂肪酸等脂质的生成。HGH (176-191)的强度是正常生长激素的10倍以上，以促进体内体重减轻。与其他常用的减脂药物有所不同，使用者不会出现大幅度的饥饿感增加，也不会像克伦特罗，麻黄素等引起的相关的紧张等副作用。由于HGH (176-191)只是 HGH 生长激素的末端部分，所以不会去参与竞争绑定 HGH 受体。多项研究表明HGH (176-191)还可促进瘦体重增加，蛋白质合成，增加骨密度，改善睡眠。使用生长激素片段与整段相比，使用片段不用担心甲状腺问题，葡萄糖敏感性，关节以及手腕的麻刺感等生长激素整段可能引起的副作用，同时生长激素片段具有强大的减脂作用同时还可以增加血管分布。

HGH(176-191)的肽序为：H-Tyr

关于HGH(176-191)的合成很少有人报道，使用常规固相合成策略逐个接氨基酸的方法，在氨基酸位点191接190时易产生二酮哌嗪，导致活性位点从树脂上脱落造成收率过低。此外，在整个肽序中存在困难序列及易消旋化氨基酸，通常使用的氨基酸投料量及反应时间也并不能达到全部反应，造成粗品纯度非常低，使得纯化过于困难。

公开号为CN114380902A的中国公开专利文献固液相结合法，在进行多肽偶联过程中，使用液相合成二肽片段，固相合成十肽片段，把片段肽通过固相合成法连接在HGH(176-191)主链中，该方法可以有效避免二酮哌嗪及缺失肽的产生，但是面临着片段肽与主链偶联时间过长、溶剂及氨基酸消耗量过大的问题。本发明在此方法的基础上，采用连续流固相合成法制备片段Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Val-OH并参与主链反应，主链以Wang树脂为载体，按照肽序依次进行偶联。

发明内容

本发明的目是的针对现有技术的不足，提供一种新的连续流固相合成制备HGH(176-191)的方法，该方法合成效率高，合成产品杂质少。

本发明的目的是通过以下的技术方案来实现的。本发明是连续流固相合成制备HGH(176-191)的方法，其特点是，使用连续流固相合成法制备片段Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Val-OH，主链以Wang树脂为载体，使用连续流固相合成法依次连接Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Val-OH，得到肽树脂。

本发明所述的一种连续流固相合成制备HGH(176-191)的方法，其进一步优选的技术方案是：

1、所述的制备HGH(176-191)的方法，其具体反应步骤如下：

（1）将2-CTC树脂提前溶胀，然后装入可调节玻璃反应柱中，调节活塞、液体流速、紫外波长；

（2）将2-CTC树脂通过连续流固相合成策略依次连接带保护基的氨基酸Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH，制备得Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Val-CTC树脂；

（3）将步骤（2）制备的肽树脂经过全保护切割得到Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Val-OH片段；

（4）将Wang树脂提前溶胀，然后装入可调节玻璃反应柱中，调节活塞、液体流速、紫外波长；

（5）将Wang树脂通过连续流固相合成策略依次连接带保护基的氨基酸及多肽片段Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Val-OH，制得H-Tyr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Val-Glu(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Gly-Phe-Wang树脂；

（6）将步骤（5）制备得到的多肽树脂经过切割后得到HGH（176-191）线肽；

（7）将步骤（6）制备的线肽环化得到HGH(176-191)粗品。

2、所述的制备HGH(176-191)的方法中：

Fmoc脱除溶液为质量浓度15%~30%的哌啶溶液；

Fmoc脱除溶液中溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃中的一种或几种。

3、所述的制备HGH(176-191)的方法中：氨基酸偶联溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷中的一种或几种；

缩合剂为DIC/HOBt、DIC/Cl-HOBt、HBTU/DIEA、HATU/DIEA、PyBOP/DIEA、(HBUT+HOBt)/DIEA、(HAUT+HOAt)/DIEA中的任意一种。

4、所述的制备HGH(176-191)的方法中：酰化催化剂为4-二甲氨基吡啶。

5、所述的制备HGH(176-191)的方法中：带保护基的氨基酸或片段、缩合试剂、树脂的摩尔比为1.1~3：1.1~3：1，反应溶剂与树脂的质量比为1~5：1。

6、所述的制备HGH(176-191)的方法中：带保护基的氨基酸或片段偶联反应温度为20~35℃；Fmoc脱除温度为15~25℃。

7、所述的制备HGH(176-191)的方法中：树脂装填高度为1~10cm； Fmoc脱除溶液流速为5~30ml/min，反应时间为2~10min；洗涤溶剂流速为5~30 ml/min，时间为10~20min。

8、所述的制备HGH(176-191)的方法中：反应压力为0~1.0MPa；紫外波长为210~400nm。

9、所述的制备HGH(176-191)的方法，其制备方法步骤如下：

一、Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Val-OH片段：

将2-CTC-树脂加入二氯甲烷溶胀10min后装入可调节反应柱中，调节活塞，使用纯DMF洗涤至UV基线平稳并归零，然后以一定流速泵入Fmoc-Val-OH、缩合剂的DMF混合溶液，反应至UV曲线在一分钟内变化值小于1mAu，再用纯DMF洗涤至UV曲线小于100mAu；使用脱保护溶液脱除Fmoc至UV曲线达到最大值后回到小于100mAu，然后再按照片段肽序将带保护基的氨基酸逐个偶联到H-Val-树脂上；

使用1%三氟乙酸/二氯甲烷的混合溶液或20%三氟乙醇/二氯甲烷的混合溶液切割肽树脂得到全保护的多肽片段；

Fmoc脱除溶液为20%的哌啶溶液，溶剂为DMF、NMP、THF中的一种；

带保护基的氨基酸为：Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-OH；

二、H-Tyr(tBu)-Leu-Arg(pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(pbf)-Ser(tBu)-Val-Glu(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Gly-Phe-Wang合成：

将Wang树脂加入二氯甲烷溶胀10min后装入可调节反应柱中，调节活塞，使用纯DMF洗涤至UV基线平稳并归零，然后以一定流速泵入Fmoc-Phe-OH、缩合剂及4-二甲氨基吡啶的DMF混合溶液，反应至UV曲线在一分钟内变化值小于1mAu，再用纯DMF洗涤至UV曲线小于100mAu；使用脱保护溶液脱除Fmoc至UV曲线达到最大值后回到小于100mAu，洗涤，然后再按照肽序逐个将带保护基的氨基酸和片段偶联到H-Phe-树脂上，最后使用脱保护溶液脱除Fmoc至UV曲线达到最大值后回到小于100mAu，洗涤，收样；

三、H-Tyr-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-OH合成：使用TFA切割，过滤、沉降、洗涤、干燥，得到HGH（176-191）线肽；

四、H-Tyr-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-cyclo[Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys]-Gly-Phe-OH合成：

将制备好的线肽溶解于醋酸水溶液中，加入碘乙醇或双氧水氧化得到HGH(176-191)粗品。

本发明与现有技术相比，具有以下创新点及优点：

1、本发明方法利用连续流固相合成策略制备HGH(176-191)。连续流固相合成HGH(176-191)工艺与间歇式固相合成相比，每步氨基酸的偶联时间由1.5~3小时缩短到30分钟以内，脱Fmoc保护时间由原来的30分钟缩短至10分钟以内，大大提高了合成工序的生产效率，氨基酸、缩合剂、去保护液和溶剂用量液大幅降低，氨基酸的偶联、脱Fmoc保护时无需手工加料，有效避免溶剂挥发及人员接触，使生产过程更加安全。

2、本发明方法采用Fmoc固相合成策略在可调节反应柱中实现高效偶联，通过可调节活塞维持树脂密度，利用UV/Vis能够实时检测偶联及脱Fmoc效率。该方法缩短了去保护和偶联时间，降低了氨基酸及溶剂用量，制备出的粗肽纯度达到80%以上，大大降低了合成成本。

3、本发明方法在偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH时，反应时间过长很容易造成氨基酸消旋化，连续流固相合成可以在短时间内完成偶联，避免了氨基酸消旋，降低了多肽粗品的杂质。

附图说明

图1为实施例制备HGH(176-191)粗品的高效液相图谱；

图2为实施例制备HGH(176-191)粗品的质谱图；

图3为偶联反应UV曲线。

具体实施方式

本发明公布了一种连续流固相合成HGH(176-191)的制备方法，实施例仅仅是本发明的一部分，并非全部实施例。实施例只是为了说明解释本发明的技术性及特点，并不能一次限制本发明的保护范围，凡是根据本发明实质做出的等效变化或是修饰等，都包含在本发明的保护范围之内。

实施例1，一种连续流固相合成制备HGH(176-191)的方法

使用连续流固相合成法制备片段Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Val-OH，主链以Wang树脂为载体，使用连续流固相合成法依次连接Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Val-OH，得到肽树脂。

其具体反应步骤如下：

（1）将2-CTC树脂提前溶胀，然后装入可调节玻璃反应柱中，调节活塞、液体流速、紫外波长；

（2）将2-CTC树脂通过连续流固相合成策略依次连接带保护基的氨基酸Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH，制备得Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Val-CTC树脂；

（3）将步骤（2）制备的肽树脂经过全保护切割得到Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Val-OH片段；

（4）将Wang树脂提前溶胀，然后装入可调节玻璃反应柱中，调节活塞、液体流速、紫外波长；

（5）将Wang树脂通过连续流固相合成策略依次连接带保护基的氨基酸及多肽片段Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Val-OH，制得H-Tyr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Val-Glu(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Gly-Phe-Wang树脂；

（6）将步骤（5）制备得到的多肽树脂经过切割后得到HGH（176-191）线肽；

（7）将步骤（6）制备的线肽环化得到HGH(176-191)粗品。

所述的制备HGH(176-191)的方法中：

Fmoc脱除溶液为质量浓度15%%的哌啶溶液；

Fmoc脱除溶液中溶剂为N，N-二甲基甲酰胺；

氨基酸偶联溶剂为N，N-二甲基甲酰胺；

缩合剂为DIC/HOBt；

酰化催化剂为4-二甲氨基吡啶；

带保护基的氨基酸或片段、缩合试剂、树脂的摩尔比为1.1：3：1，反应溶剂与树脂的质量比为1：1。带保护基的氨基酸或片段偶联反应温度为20℃；Fmoc脱除温度为15℃。树脂装填高度为1cm； Fmoc脱除溶液流速为5ml/min，反应时间为2min；洗涤溶剂流速为30ml/min，时间为10min。反应压力为1.0MPa；紫外波长为210nm。

实施例1，一种连续流固相合成制备HGH(176-191)的方法

所述的制备HGH(176-191)的方法中：

Fmoc脱除溶液为质量浓度15%~30%的哌啶溶液；

Fmoc脱除溶液中溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃中的一种或几种。

氨基酸偶联溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷中的一种或几种；

缩合剂为DIC/HOBt、DIC/Cl-HOBt、HBTU/DIEA、HATU/DIEA、PyBOP/DIEA、(HBUT+HOBt)/DIEA、(HAUT+HOAt)/DIEA中的任意一种。

酰化催化剂为4-二甲氨基吡啶。

带保护基的氨基酸或片段、缩合试剂、树脂的摩尔比为1.1~3：1.1~3：1，反应溶剂与树脂的质量比为1~5：1。带保护基的氨基酸或片段偶联反应温度为20~35℃；Fmoc脱除温度为15~25℃。树脂装填高度为1~10cm； Fmoc脱除溶液流速为5~30ml/min，反应时间为2~10min；洗涤溶剂流速为5~30 ml/min，时间为10~20min。反应压力为0~1.0MPa；紫外波长为210~400nm。

其余与实施例1相同。

实施例2，一种连续流固相合成制备HGH(176-191)的方法

所述的制备HGH(176-191)的方法中：

Fmoc脱除溶液为质量浓度30%的哌啶溶液；

Fmoc脱除溶液中溶剂为N-甲基吡咯烷酮；

氨基酸偶联溶剂为N-甲基吡咯烷酮；

缩合剂为DIC/Cl-HOBt或者HBTU/DIEA；

酰化催化剂为4-二甲氨基吡啶；

带保护基的氨基酸或片段、缩合试剂、树脂的摩尔比为3：1.1：1，反应溶剂与树脂的质量比为5：1。带保护基的氨基酸或片段偶联反应温度为35℃；Fmoc脱除温度为25℃。树脂装填高度为10cm； Fmoc脱除溶液流速为30ml/min，反应时间为10min；洗涤溶剂流速为5ml/min，时间为20min。反应压力为0.5MPa；紫外波长为400nm。

其余与实施例1相同。

实施例3，一种连续流固相合成制备HGH(176-191)的方法

所述的制备HGH(176-191)的方法中：

Fmoc脱除溶液为质量浓度25%的哌啶溶液；

Fmoc脱除溶液中溶剂为四氢呋喃；

氨基酸偶联溶剂为二氯甲烷；

缩合剂为HATU/DIEA或者PyBOP/DIEA或者(HBUT+HOBt)/DIEA或者(HAUT+HOAt)/DIEA；

酰化催化剂为4-二甲氨基吡啶。

带保护基的氨基酸或片段、缩合试剂、树脂的摩尔比为2：2：1，反应溶剂与树脂的质量比为3：1。带保护基的氨基酸或片段偶联反应温度为25℃；Fmoc脱除温度为20℃。树脂装填高度为5cm； Fmoc脱除溶液流速为20ml/min，反应时间为5min；洗涤溶剂流速为15 ml/min，时间为15min。反应压力为0.3MPa；紫外波长为300nm。

实施例4，一种连续流固相合成制备HGH(176-191)的方法，其制备方法步骤如下：

一、Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Val-OH片段：

将2-CTC-树脂加入二氯甲烷溶胀10min后装入可调节反应柱中，调节活塞，使用纯DMF洗涤至UV基线平稳并归零，然后以一定流速泵入Fmoc-Val-OH、缩合剂的DMF混合溶液，反应至UV曲线在一分钟内变化值小于1mAu，再用纯DMF洗涤至UV曲线小于100mAu；使用脱保护溶液脱除Fmoc至UV曲线达到最大值后回到小于100mAu，然后再按照片段肽序将带保护基的氨基酸逐个偶联到H-Val-树脂上；

使用1%三氟乙酸/二氯甲烷的混合溶液或20%三氟乙醇/二氯甲烷的混合溶液切割肽树脂得到全保护的多肽片段；

Fmoc脱除溶液为20%的哌啶溶液，溶剂为DMF、NMP、THF中的一种；

带保护基的氨基酸为：Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-Gly-OH；

二、H-Tyr(tBu)-Leu-Arg(pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(pbf)-Ser(tBu)-Val-Glu(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Gly-Phe-Wang合成：

将Wang树脂加入二氯甲烷溶胀10min后装入可调节反应柱中，调节活塞，使用纯DMF洗涤至UV基线平稳并归零，然后以一定流速泵入Fmoc-Phe-OH、缩合剂及4-二甲氨基吡啶的DMF混合溶液，反应至UV曲线在一分钟内变化值小于1mAu，再用纯DMF洗涤至UV曲线小于100mAu；使用脱保护溶液脱除Fmoc至UV曲线达到最大值后回到小于100mAu，洗涤，然后再按照肽序逐个将带保护基的氨基酸和片段偶联到H-Phe-树脂上，最后使用脱保护溶液脱除Fmoc至UV曲线达到最大值后回到小于100mAu，洗涤，收样；

三、H-Tyr-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-OH合成：使用TFA切割，过滤、沉降、洗涤、干燥，得到HGH（176-191）线肽；

四、H-Tyr-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-cyclo[Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys]-Gly-Phe-OH合成：

将制备好的线肽溶解于醋酸水溶液中，加入碘乙醇或双氧水氧化得到HGH(176-191)粗品。

实施例5：一种连续流固相合成制备HGH(176-191)的方法，其制备方法步骤如下：

步骤1、Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Val-OH片段合成。

取2-CTC-树脂18.2 g（替代度=1.1 mmol/g）加入到烧杯中，树脂使用50 mL DCM溶胀5 min，再加入到可调节玻璃反应柱中。连接好管路，打开UV，设置紫外波长270 nm，调节反应柱活塞，使活塞底部距离树脂表面约3 mm。打开DMF通道，调节流速为20 mL/min,当UV曲线平稳后归零。按照肽序把带保护基的氨基酸与2-CTC树脂逐个偶联，缩合试剂使用DIC/HOBt体系，氨基酸及缩合剂用量为树脂的1.5倍。脱Fmoc保护液使用20%PIP/DMF溶液，实时观察脱保护及偶联的树脂高度及反应压力，得Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Val-CTC肽树脂21.53 g。脱Fmoc保护、偶联以一分钟内UV吸收值小于1 mAu为反应终点；以UV吸收值小于100 mAu为偶联后洗涤终点；UV吸收值小于1 mAu为脱保护后洗涤终点。偶联循环液、去Fmoc保护液、洗涤液流速均为20 mL/min。

使用肽树脂10倍量的20%TFE/DCM进行全保护切割，旋转蒸发仪旋干，得到十肽干粉10.91 g。

步骤2、H-Tyr(tBu)-Leu-Arg(pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(pbf)-Ser(tBu)-Val-Glu(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Gly-Phe-Wang的合成

将9.43 g Wang树脂（替代度=0.53 mmol/g）加入到烧杯中，树脂使用50 mL DCM溶胀5分钟，再加入到可调节玻璃反应柱中。连接好管路，打开UV，设置紫外波长280nm，调节反应柱活塞，使活塞底部距离树脂表面约3mm。打开DMF通道，调节流速为20mL/min,当UV曲线平稳后归零。按照肽序把带保护基的氨基酸和片段与Wang树脂逐个偶联，缩合试剂使用DIC/HOBt体系，氨基酸及缩合剂用量为树脂的1.5倍。脱Fmoc保护液使用20%PIP/DMF溶液，实时观察脱保护及偶联的树脂高度及反应压力，得H-Tyr(tBu)-Leu-Arg(pbf)-Ile-Val-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Arg(pbf)-Ser(tBu)-Val-Glu(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Gly-Phe-Wang肽树脂24.8克。脱Fmoc保护、偶联以一分钟内UV吸收值小于1mAu为反应终点；以UV吸收值小于100mAu为偶联后洗涤终点；UV吸收值小于1mAu为脱保护后洗涤终点。偶联循环液、去Fmoc保护液、洗涤液流速均为20mL/min。

步骤3、制备H-Tyr-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-OH按肽树脂8倍量计算裂解液198.4mL，裂解液配比为TFA:EDT:H

步骤4、H-Tyr-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-cyclo[Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys]-Gly-Phe-OH的合成将制备的HGH(176-191)线肽8.8克溶于3.5L 10%得醋酸溶液中，边搅拌边缓慢滴加20%碘乙醇溶液至溶液微黄（氧化环合），滴加VC消耗过量的碘，得到HGH(176-191)粗品，经验证，摩尔收率为38.25%，纯度为83.73%，摩尔分子量为1815.10，经质谱检测[M+3]