根皮苷（Phlorizin）在抑制神经系统肿瘤上皮间质转化及恶性进展中的应用

摘要

本发明公开了根皮苷(Phlorizin)在抑制神经系统肿瘤上皮间质转化及恶性进展中的应用。本发明通过对神经系统肿瘤细胞系进行检测，发现FAM13A‑001表达水平和神经系统肿瘤的恶性进展相关，根皮苷能够特异性结合FAM13A‑001蛋白的CCD结构域，从而抑制神经系统肿瘤的恶性进展。对于FAM13A‑001高表达的神经系统肿瘤，根皮苷的治疗效果尤为明显，并且具有较好的体内应用药物的安全性。本发明的提出为指导特定亚型神经系统肿瘤患者的个体化治疗，优化治疗方案以达到最大的治疗效益提供了有效的技术手段，有助于提高脑神经系统肿瘤患者的总体生存期，推动神经系统肿瘤精准治疗方案的进展。

说明书

技术领域

本发明涉及根皮苷(Phlorizin)用于抑制神经系统肿瘤上皮间质转化及恶性进展中的应用。属于医药技术领域。

背景技术

原发性恶性中枢神经系统肿瘤，具有异质性极强、生存期短、复发率高等特点。神经系统恶性肿瘤中胶质瘤是最主要的病理类型，其恶性程度高，侵袭性强。神经系统恶性肿瘤治疗采取以手术切除为主，放化疗为辅的综合治疗策略，但治疗效果欠佳，患者预后差。神经系统恶性肿瘤起源于神经上皮，不同类型的肿瘤在病理组织学形态、侵袭进展及临床预后结局有着很大的差异，而目前国际上较为公认的、有意义的肿瘤分型是根据不同基因的表达谱特征来区分不同肿瘤亚型。针对不同肿瘤亚型的基因表达谱特征差异挖掘潜在的靶向药物，可以完善患者的个体化治疗方案以获取最大收益，延长患者生存期。

上皮间质转化(Epithelial to mesenchymal transition，EMT)是细胞从上皮状态向间质状态转换，该过程使得细胞的迁移和侵袭能力增强，与多种肿瘤的恶性进展有关。神经系统肿瘤中存在EMT过程，间质样生长的肿瘤(间质型，Mesenchymal)有较高的恶性行为倾向，参与肿瘤的侵袭迁移和放化疗耐受等生物学活动，并呈现出N-cadherin、Vimentin、β-catenin等间充质标记物的过度表达。RNA选择性转录(AT，Alternativetranscription)增加了RNA和编码蛋白的多样性，并参与了肿瘤的EMT、细胞增殖及凋亡等过程。研究发现FAM13A的转录本FAM13A-001所翻译的蛋白具有两个独特的卷曲螺旋结构(Coiled coil domain，CCD)，并通过CCD结构域结合RanGAP1蛋白，进而激活AKT信号通路促进肿瘤的EMT，参与肿瘤的恶性进展。通过高通量药物筛选发现药物根皮苷(Phlorizin)能够通过特异性结合FAM13A-001蛋白的CCD结构域，抑制AKT信号通路的激活，从而抑制肿瘤的EMT及恶性进展。对于FAM13A-001高表达的肿瘤，根皮苷的治疗效果尤为明显。

因此，根皮苷药物的体内外应用将有助于提高患者的个体化治疗以获取最大效益，推动神经系统肿瘤精准治疗方案的发展。

发明内容

本发明的目的在于提供根皮苷在抑制神经系统肿瘤恶性进展中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明通过对神经系统恶性肿瘤细胞系进行检测，发现FAM13A-001表达水平和肿瘤的恶性进展相关。FAM13A-001蛋白可通过结合RanGAP1参与激活AKT信号通路，从而促进神经系统肿瘤恶性进展。本发明通过分子结构预测发现FAM13A-001转录本有两个CCD结构域，这两个结构域是和RanGAP1结合的关键位点。通过高通量药物虚拟筛选发现根皮苷能够拮抗CCD结构域与RanGAP1的结合从而抑制神经系统肿瘤上皮间质转化及恶性进展。因此，根皮苷可用于高表达FAM13A-001的神经系统肿瘤患者的临床治疗。FAM13A-001转录本的序列记载在公开号为CN113862359A，发明名称为“FAM13A基因转录本在评估胶质母细胞瘤患者临床预后中的应用”的专利申请中。

在上述研究的基础上，本发明提出了根皮苷(Phlorizin)在制备抑制神经系统肿瘤上皮间质转化及恶性进展药物中的应用。

其中，优选的，所述的神经系统肿瘤为FAM13A-001高表达的神经系统肿瘤。

其中，优选的，根皮苷通过特异性结合FAM13A-001蛋白的两个卷曲螺旋结构(Coiled coil domain，CCD)，抑制FAM13A-001蛋白与RanGAP1蛋白结合，下调RanGAP1蛋白活性，进而降低Ran对RhoA蛋白在细胞浆内的募集，抑制细胞内AKT信号通路活性，从而抑制神经系统肿瘤上皮间质转化(Epithelial to mesenchymal transition，EMT)及恶性进展。

其中，优选的，根皮苷药物能够有效通过血脑屏障，在肿瘤组织中富集，并对小鼠重要脏器的药物毒性作用较小。

其中，优选的，应用根皮苷后的神经系统肿瘤细胞增殖和侵袭能力减弱，凋亡增加。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明通过对神经系统肿瘤细胞系进行检测，发现FAM13A-001表达水平和肿瘤的恶性进展相关，根皮苷能够特异性结合FAM13A-001从而抑制肿瘤的恶性进展。对于FAM13A-001高表达的神经系统肿瘤，根皮苷的治疗效果尤为明显。本发明的提出为指导神经系统肿瘤患者的个体化治疗，优化治疗方案以达到最大的治疗效益提供了有效的技术手段，有助于提高脑神经系统肿瘤患者的总体生存期，推动神经系统肿瘤精准治疗方案的进展。

附图说明

图1为FAM13A-001促进神经系统肿瘤的恶性进展实验结果；

其中：(A)FAM13A-001对神经系统肿瘤细胞增殖能力的影响；(B)Transwell细胞侵袭实验检测过表达FAM13A-001对神经系统肿瘤细胞侵袭能力的影响；(C)流式细胞术检测FAM13A-001对肿瘤细胞凋亡的影响；(D)小动物体内研究验证过表达FAM13A-001调控肿瘤生长大小和小鼠预后状况；

图2为FAM13A-001调控AKT信号通路及神经系统肿瘤EMT进展实验结果；

其中：(A)FAM13A-001调控AKT信号通路的激活水平及EMT进程；(B)过表达FAM13A-001对EMT标记物蛋白水平的影响；

图3为FAM13A-001调控AKT信号通路的机制；

其中：(A-B)FAM13A-001转录本翻译的蛋白能够和RanGAP1结合；(C-D)FAM13A-001促进RanGAP1对Ran的激活，并提高了Ran在胞浆中的浓度；(E)Ran在胞浆中能够募集并激活RhoA从而调控AKT信号通路；

图4为根皮苷特异性结合FAM13A-001蛋白的实验结果；

其中：(A-B)FAM13A-001蛋白的两个CCD结构域是和RanGAP1结合的关键位点；(C)高通量药物虚拟筛选发现根皮苷能够和两个CCD结构域都结合；(D)根皮苷药物能够拮抗FAM13A-001的CCD结构域与RanGAP1的结合；

图5为根皮苷与FAM13A-001蛋白的CCD结构域靶向结合的实验结果；

图6为根皮苷药物在肿瘤细胞的半数致死量实验结果；

图7为根皮苷抑制神经系统肿瘤的EMT进程及恶性进展实验结果；

其中：(A-C)根皮苷抑制Ran在胞浆中募集及激活的RhoA的过程；(D-E)根皮苷抑制AKT信号通路的激活以及根皮苷对EMT标记物蛋白水平的影响；(F-H)根皮苷抑制神经系统肿瘤的增殖和侵袭，促进肿瘤细胞凋亡；

图8为根皮苷的血脑屏障渗透效率实验结果；

其中：(A)体外实验验证根皮苷的血脑屏障渗透性；(B)SD大鼠腹腔注射根皮苷后脑组织中药物浓度检测；(C)应用细胞膜通道抑制剂后根皮苷的渗透实验；(D)小鼠体内根皮苷代谢途径及重要器官分布状况；(E)小鼠脑组织内药物的荧光检测；

图9为根皮苷在高表达FAM13A-001的原代肿瘤细胞小动物肿瘤模型中的应用结果；

其中：(A-C)根皮苷抑制肿瘤生长，延长小鼠生存期；(D-E)根皮苷抑制AKT信号通路及上皮间质转化；(F)根皮苷对重要脏器的毒性作用检测。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1FAM13A-001过表达促进神经系统肿瘤的恶性进展

1、构建过表达FAM13A-001的细胞系

通过对神经系统肿瘤脑胶质瘤组织提取的原代肿瘤细胞HG7及HG11使用过表达带有flag标签的FAM13A-001慢病毒(上海吉凯基因公司)转染细胞，稳定培养过表达FAM13A-001的细胞系，按照以下方法检测FAM13A-001蛋白和AKT信号通路的表达水平变化。

(1)提取组织或细胞蛋白，收集神经系统肿瘤细胞至具有1％蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液(Solarbio)中；

(2)用分光光度计(NanoDrop)测定蛋白质浓度；

(3)电泳：所有样品均经过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(EpiZymeScientific)电泳，电泳条件为恒压100V，待染料前沿移行到距离凝胶底部2-3mm时方可停止(120min)；

(4)电转膜仪转膜：将凝胶转移到PVDF膜上(Millipore，USA)，转膜条件为恒流250mA，2h(时间可根据目的蛋白分子量适当调整)；

(5)封闭：将膜在5％脱脂牛奶-TBST溶液室温封闭1h；

(6)加入一抗(兔抗flag标签抗体)，在抗体覆盖PVDF膜后，放入4℃冰箱中孵育过夜；

(7)回收一抗，PBST洗膜3次，10min/次；

(8)二抗孵育：与辣根过氧化物酶标记的二抗(羊抗兔IgG抗体)室温孵育1h；

(9)洗膜：PBST洗膜2次，PBS洗膜一次，10min/次；

(10)显色：在ChemiDocTM MPImaging System(BioRad)中用SuperEnhanced化学发光检测试剂(Applygen Technologies Inc)检测蛋白条带。

2、CCK-8实验检测FAM13A-001过表达神经系统肿瘤细胞的增殖能力具体方法如下：

(1)制备细胞悬液，计数；

(2)在96孔板中接种细胞悬液，每孔100μL，同样的样本做3个重复；

(3)将培养板放入培养箱中预培养一段时间(37℃，5％CO2)，细胞贴壁需要大约4-6h；

(4)每孔各加入10μL CCK-8溶液，加完试剂后轻轻晃动培养板以帮助混匀；

(5)将培养板放入培养箱中孵育2h；

(6)酶标仪测定450nm处的吸光值(OD)。

结果提示，FAM13A-001过表达肿瘤细胞的增殖能力增强，结果见图1A。

3、Transwell实验检测FAM13A-001过表达神经系统肿瘤细胞的侵袭能力具体方法如下：

(1)铺基质胶：4℃条件下将Matrigel胶用无血清的细胞培养基按照1：8比例稀释，取100μL均匀涂抹于上室的聚碳酸酯膜表面，37℃放置0.5-1h；

(2)细胞培养：取对数生长期的待测细胞，并用PBS洗涤，接着用无血清培养基悬浮细胞，调整细胞密度为1-10×10

(3)接种细胞：24孔板下室加入500μL含10％FBS的培养基，用镊子将Transwell小室置于24孔板内，取细胞悬液200μL加入上室，放入培养箱中培养12-48h；

(4)细胞固定：取出小室，吸走培养基，用棉签轻轻擦拭Matrigel和上室内的细胞。取新的24孔板加入4％多聚甲醛600μL，固定20-30min；

(5)细胞染色及计数：弃固定液，0.2％结晶紫染色10min，PBS洗3遍，用棉签轻轻擦拭小室的上侧，将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉。适当风干后，显微镜下观察细胞并计数。

结果提示，FAM13A-001过表达神经系统肿瘤细胞的侵袭能力增强，结果见图1B。

4、流式细胞术检测FAM13A-001过表达神经系统肿瘤细胞的凋亡状态具体方法如下：

(1)收集细胞，PBS洗涤收集的细胞3次，800-1300rpm转速离心沉淀细胞，弃上清；

(2)边轻轻涡旋边加入3.5mL 70％预冷的乙醇，4℃储存过夜；

(3)离心乙醇固定过的细胞，弃上清，PBS洗涤细胞3次以去除残留的乙醇；

(4)加入含有RNase的500μL PI Staining buffer，染色15min以上；

(5)染色后一小时内应用流式细胞仪测定细胞周期。

结果提示，FAM13A-001过表达神经系统肿瘤细胞的凋亡减少，结果见图1C。

5、过表达FAM13A-001神经系统肿瘤裸鼠模型的肿瘤生长

根据所构建的过表达FAM13A-001的HG7细胞系，选用4周龄雌性BALB/c裸鼠，随机分为4组，每组10只。将3×10

实施例2FAM13A-001表达与AKT信号通路及EMT标记物的相关性检测FAM13A-001蛋白通过结合RanGAP1激活AKT信号通路，参与EMT进程。使用免疫印迹和免疫荧光检测FAM13A-001参与AKT信号通路过程中的相关蛋白质RanGAP1，Ran，RhoA，AKT及pAKT表达水平；使用免疫印迹(Western blot，WB)和免疫组化技术检测敲低和过表达FAM13A-001细胞系中EMT相关标记物E-cadherin，Claudin1，N-cadherin，Slug和β-catenin的表达情况。

1、免疫荧光技术

(1)将5×10

(2)利用4％多聚甲醛将细胞固定，使用含0.5％Triton的PBS溶液透膜，利用5％胎牛血清(BSA)封闭细胞爬片；

(3)将E-cadherin，Claudin1，N-cadherin，Slug和β-catenin的特异性抗体(一抗)加入细胞爬片上，每张爬片加入200μL，将细胞爬片置于4℃冰箱中孵育过夜；

(4)根据一抗种属来源，选择合适的荧光标记二抗，加入到细胞爬片上，于室温孵育1h；

(5)加入DAPI染色剂，对细胞核进行染色，于室温避光状态下孵育20min；

(6)于荧光显微镜下观察细胞爬片，检测E-cadherin，Claudin1，N-cadherin，Slug和β-catenin蛋白的细胞定位以及表达水平。

2、免疫组化技术

(1)将肿瘤组织制成蜡块，在轮转式切片机上制作0.3mm的石蜡切片，于70℃烤箱内烘烤4h至过夜，确保石蜡充分融化；

(2)将石蜡切片置于二甲苯溶液中透明，并在100％、90％、85％、80％、75％、70％的乙醇溶液中梯度水化；

(3)将处理后的组织切片置于柠檬酸修复液中，95℃加热，维持8min，进行抗原修复，静置冷却到室温；

(4)在处理后的组织切片上滴加3％的过氧化氢溶液，室温静置10min，去除内源性过氧化物酶；

(5)在PBST浸润清洗组织切片后，滴加E-cadherin，Claudin1，N-cadherin，Slug和β-catenin对应的一抗，于湿盒中4℃冰箱中孵育过夜；

(6)PBS溶液清洗一抗后，滴加对应种属的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温静置30min；

(7)PBS溶液清洗二抗后，滴加DAB显色液进行显色，在显微镜下观察显色过程；

(8)显色后，自来水冲洗5min终止显色，并利用苏木素染色20s，自来水冲洗5min终止染色；

(9)利用70％-100％乙醇溶液梯度脱水、二甲苯溶液透明处理，使用树胶封片，于70℃烤箱内烤干过夜，室温保存组织切片，以备后续检测观察。

结果提示，FAM13A-001翻译得到的蛋白能够结合RanGAP1促进RanGAP1对Ran的激活并提高了Ran在胞浆中的浓度；Ran在胞浆中能够募集并激活RhoA，从而激活AKT信号通路。在FAM13A-001高表达的原代细胞HG7中，E-cadherin和Claudin1表达明显下降，N-cadherin，Slug和β-catenin表达明显升高，表明FAM13A-001促进EMT进程，结果见图2、图3。

实施例3根皮苷特异性结合FAM13A-001蛋白并抑制神经系统肿瘤恶性进展

通过分子结构预测发现，FAM13A-001蛋白具有两个独特的CCD结构域，这两个结构域是FAM13A-001和RanGAP1结合的关键位点。随后通过高通量药物筛选寻找能够和这两个CCD结构域均结合的药物，其中根皮苷药物能够特异性结合两个CCD结构域，拮抗FAM13A-001蛋白与RanGAP1的结合，从而抑制AKT信号通路。通过过表达具有突变CCD结构的FAM13A-001蛋白，根皮苷药物不能和具有突变CCD结构的FAM13A-001蛋白结合。

(1)根据FAM13A-001蛋白序列，在RCSB数据库中(https://www.rcsb.org/)预测发现FAM13A-001具有两个CCD结构域。

(2)利用i-TASSER数据库(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)预测FAM13A-001蛋白的三维结构模型。

(3)根据FAM13A-001蛋白的三维结构模型，进行蛋白与小分子药物对接计算，获得根皮苷药物与FAM13A-001蛋白结合的具体位点，确认根皮苷药物结合在FAM13A-001蛋白的两个CCD结构域中。

(4)通过细胞转染过表达含有flag标签的FAM13A-001蛋白后，提取细胞总蛋白，加入flag一抗后，4℃孵育过夜。

(5)加入100μL含有ProteinA/G的磁珠后，于室温旋转混匀2小时，利用磁力架收集磁珠，利用TBST清晰磁珠3次。

(6)利用loading buffer煮沸方法解交联，获得与带有flag标签的FAM13A-001蛋白及其与其他蛋白结合形成的蛋白复合体。

(7)利用蛋白免疫印迹方法，检测FAM13A-001蛋白与RanGAP1蛋白的结合作用。根据根皮苷药物的不同处理，明确根皮苷药物对FAM13A-001蛋白与RanGAP1蛋白结合的抑制作用。

(8)通过转染过表达具有突变的CCD结构域FAM13A-001蛋白，利用生物素(Biotin)基团标记根皮苷药物分子。

(9)在体外将Biotin标记的根皮苷药物与具有突变的CCD结构域的FAM13A-001蛋白混合，于室温摇匀2小时。

(10)利用蛋白免疫共沉淀方法检测具有突变的CCD结构域的FAM13A-001与Biotin标记的根皮苷药物的结合。

(11)转染靶向敲低FAM13A-001的shRNA，敲低脑胶质瘤细胞中内源性FAM13A-001蛋白的表达，并再次转染过表达FAM13A-001，恢复FAM13A-001的蛋白表达。其中，用于恢复表达所转染的FAM13A-001序列，含有shRNA靶点的氨基酸同义突变，因此无法被shRNA靶向敲低。同时确保含有同义突变的FAM13A-001能够产生与内源性FAM13A-001的氨基酸序列相同的蛋白。

(12)分别在各组细胞中加入根皮苷药物，利用蛋白免疫印迹技术，检测细胞中RhoA蛋白以及AKT信号通路的激活情况。

结果提示，根皮苷特异性结合在FAM13A-001蛋白在CCD结构域，并通过与特定的CCD结构域结合后抑制脑胶质瘤细胞内AKT信号通路及RhoA的活性，其结果见图4，图5。

为了更精确地应用根皮苷药物，在检测药物的半数致死量后选择合适的剂量后应用药物在细胞上。

(1)将消化后的脑胶质瘤细胞吹打成细胞悬液，按照96孔板每孔1000个细胞，加入孔板中。

(2)待细胞过夜贴壁后，加入不同剂量的根皮苷药物，按照50μM、100μM、200μM、500μM、750μM、1000μM的剂量，分别处理6h、12h、24h、48h，并加入CCK-8试剂。

(3)检测OD 450nm处的吸光度并进行对比，获得根皮苷药物在脑胶质瘤细胞中的半数致死量。

结果提示，根皮苷药物在肿瘤细胞的半数致死量约为500μM。根据半数致死量选择合适的应用在细胞或动物体内的应用剂量，其结果见图6。

一方面，利用免疫荧光和免疫印迹技术检测AKT信号通路及EMT标志物改变；另一方面利用CCK-8、Transwell实验及流式细胞术检测肿瘤细胞的增殖侵袭和凋亡状态。

(1)构建细胞爬片，确保每个爬片附着1×10

(2)用PBS清洗4％多聚甲醛后，利用0.05％的Triton溶液进行透膜处理。

(3)用5％胎牛血清封闭细胞爬片。

(4)同时用鼠抗人Ran一抗、兔抗人RhoA一抗，于4℃条件下孵育细胞爬片过夜。

(5)利用PBS清洗掉一抗后，使用Alexa Fluor 488羊抗鼠二抗及Alexa Fluor594羊抗兔二抗同时孵育细胞爬片，于室温避光孵育1小时。

(6)利用PBS清洗掉二抗后，使用DAPI容易对细胞核进行染色15min，并于高分辨率荧光显微镜下进行观察。

结果显示，根皮苷抑制了Ran在胞浆中募集和激活的RhoA的作用，进而抑制AKT信号通路和EMT进程；同时，应用根皮苷后的神经系统肿瘤细胞增殖和侵袭能力减弱，凋亡增加，结果见图7。

实施例4根皮苷在过表达FAM13A-001的原代肿瘤细胞小鼠肿瘤模型中的应用

1、根皮苷的血脑屏障渗透效率实验

根据上述根皮苷在体外抑制神经系统肿瘤细胞增值侵袭及促进凋亡的结果，为了确保药物能够应用于体内研究，我们做了药物的血脑屏障渗透效率实验，这个实验分为体内实验和体外实验两部分。

(1)体外实验：通过Transwell小室，在小室下层铺上1×10

(2)小室上层加入500μM浓度的根皮苷药物，与37℃孵育Transwell小室0.5小时。

(3)利用流式细胞仪检测下层液体中的药物浓度，反映渗透效率。

(4)体内实验：选择雌性成熟SD大鼠，通过给SD大鼠腹腔注射根皮苷药物，药物浓度为200mg/kg。

(5)药物注射后0.5小时，处死SD大鼠，提取其脑组织及脑脊液组织，利用流式细胞术检测其脑组织和脑脊液中药物的浓度，反映渗透效率。

(6)提取SD大鼠的脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏及肾脏组织，在小动物成像仪中，观察药物的Cy5荧光基团发光情况，检测药物在大鼠体内各个重要脏器中的分布，观察药物代谢途径及药物脑组织分布情况。

结果显示，根皮苷可以通过血脑屏障，并且在脑组织中有一定程度的富集，药物可以在体内应用，结果见图8。

2、根皮苷治疗FAM13A-001过表达神经系统肿瘤的具体体内实验

申请人在前期研究中证实敲减RBMX是导致FAM13A-001过表达的重要因素，因此利用shRNA靶向敲减RBMX可更好地在体内实验中模拟神经系统肿瘤中FAM13A-001过表达的机制。

(1)构建利用shRBMX神经系统肿瘤的载瘤小鼠，在小鼠颅内原位注射3×10

(2)经确认后的载瘤小鼠，每日进行腹腔注射根皮苷药物，注射浓度为200mg/kg，分别于7天、14天、21天使用荧光成像技术拍照，观察肿瘤生长大小及小鼠生存时间；

(3)提取小鼠的脑组织蛋白，制作肿瘤组织切片，通过免疫印迹及免疫组化技术检测小鼠体内的AKT激活状态及EMT标志物。

(4)利用组织切片进行H&E染色，观察药物对小鼠重要脏器的毒性作用。结果显示，应用根皮苷治疗的小鼠较对照组小鼠肿瘤生长减缓，小鼠生存期延长，AKT信号通路及EMT进展受抑制，并且在药物处理后的小鼠体内各重要脏器未见明显病理学改变，结果见图9。

这些结果提示，根皮苷能够通过特异性结合FAM13A-001蛋白的CCD结构域，抑制AKT信号通路的激活，从而抑制神经系统肿瘤的EMT及恶性进展。对于FAM13A-001高表达的神经系统肿瘤，根皮苷的治疗效果尤为明显。