一种筛选铜绿假单胞菌LasR基因调控网络未知基因突变体的方法

摘要

本发明提供了一种筛选铜绿假单胞菌LasR基因调控网络中未知基因突变体的方法。本发明通过在铜绿假单胞菌LasR敲除突变体中过表达易突变基因，利用铜绿假单胞菌LasR敲除突变体不能水解酪蛋白的缺陷，在胁迫环境下进行培养，诱使其发生突变，再通过筛选恢复蛋白水解能力的铜绿假单胞菌，找出相应的突变位点。本发明所述方法更为直接、简便、快捷，能够使得某个具体调控网络中的基因发生定向的未知突变，较现有的方法来说，不仅能更好地发现基因与基因之间的调控关系和调控网络，且大大节省了时间。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种筛选铜绿假单胞菌LasR基因调控网络未知基因突变体的方法。

背景技术

细菌全基因组测序为深入认识细菌的生命活动规律奠定了基础，但是测序完成之后，人们必须面对众多基因功能不清的问题，而如何阐明未知基因的功能和这些基因之间的关系成为最急迫的任务。据估算，在研究得最深入的微生物大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)中，仍然有30～50％的基因功能是未知的。了解细菌基因功能最主要的方法就是获得该基因的突变株，然后根据该突变株表型变化来确定基因产物的功能。目前，主流的研究方法是建立细菌单基因突变株库或利用转座子构建突变株库。例如，中国专利CN112553251A公开了一种流感病毒相关宿主基因突变体的筛选方法，其筛选的第一步就是建立随机基因突变文库。但细菌单基因突变株库的建库策略都是利用单交换的方法一个基因一个基因地分别突变，由于多数细菌都含有数千个基因，这种策略费时费力，且一般都需要大规模的协作，想单独完成是很困难的。转座子构建突变株库的技术路线是利用Tn5等转座子随机插入产生突变株，由于插入的随机性，使得筛选基因的突变成为一个非常耗时的工作。上述方法只适合研究单一基因的突变对细菌通路的影响，无法很好的研究某个系统通路上涉及的基因的突变，若想研究基因之间的调控网络就显得更加困难了。

铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)原称绿脓杆菌，是土壤中存在的最常见的细菌之一。研究显示，铜绿假单胞菌群体感应(Quorum Sensing，QS)系统跟它的毒力因子表达启动及表达水平关系密切。铜绿假单胞菌QS系统包括las系统和rhl系统，las系统由lasI和lasR组成，rhl系统由rh1I和rh1R组成。其中，lasI和rhlI控制信号分子的合成，而lasR和rh1R则分别控制各自信号分子配体的合成，信号分子与分子配体蛋白的结合具有高度特异性。信号分子与配体形成的复合物调控下游毒力基因的表达，对各种毒力因子的产生进行调控。las系统的信号分子配体复合物不仅可以调控各种毒力因子的表达，同时还可以对自身进行调控，形成一个正反馈循环，使其效能不断放大。当铜绿假单胞菌的QS系统被激活，其生物性状就会发生改变，表现出一些新的生物特征。如诱导生物被膜分化与成熟，增强其耐药性；上调和增强毒力因子表达，提高其致病能力；诱发并促进部分细菌死亡，维持菌群合适密度；帮助细菌耐受不良环境，如低氧损伤、抗生素杀灭等。因此，研究铜绿假单胞菌QS基因的功能和遗传通路对于防治该菌具有重大意义，而提供一种筛选铜绿假单胞菌QS基因调控网络未知基因突变体的方法显得尤为重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种筛选铜绿假单胞菌LasR基因调控网络未知基因突变体的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种筛选铜绿假单胞菌LasR基因调控网络未知基因突变体的方法，其包含以下步骤：

S1.选择一个已知的在铜绿假单胞菌LasR基因调控网络中与LasR基因功能关联且易发生突变的基因作为目的基因，构建该目标基因的重组质粒；

S2.将步骤S1中构建的重组质粒转入铜绿假单胞菌LasR敲除突变体中，在胁迫环境下筛选突变体；

S3.对步骤S2筛选到的突变体进行PCR测序，判断是否是目标基因发生了突变，若不是，则提取该突变体的基因组DNA进行重测序以鉴定突变位点；

S4.将步骤S3中鉴定到的突变位点在铜绿假单胞菌中进行敲除验证，看是否能够得到一样的表型，如果能得到相同表型则表明该突变位点的基因在LasR基因调控网络中具有重要作用。

具体地，步骤S1中所述目的基因为mexT基因。

具体地，步骤S1中用于构建重组质粒的质粒为pUC18T-miniTn7。

具体地，将所构建的重组质粒转入铜绿假单胞菌LasR敲除突变体时，使用pTNS2质粒进行辅助。

具体地，所述重组质粒和pTNS2质粒通过电击转化法转入铜绿假单胞菌LasR突变体中。

具体地，将构建好的重组质粒转入大肠杆菌DH5α中进行转化，PCR检测在LB平板(含有庆大霉素)上长出来的转化子，将测序正确的阳性转化子大量培养后，提取质粒，然后将携带目标基因的重组质粒和pTNS2质粒混合后电击到铜绿假单胞菌LasR敲除突变体中。

具体地，转入的铜绿假单胞菌敲除突变体可以为多基因敲除突变体，但所述多基因敲除突变体中至少敲除了LasR基因。

LasR敲除突变体不能水解酪蛋白，因此可以用酪蛋白为唯一碳源的培养基作为胁迫环境筛选突变体。

具体地，步骤S2是在PM-casein培养基提供的胁迫环境下筛选突变体。

具体地，筛选突变体的方法为：将携带有目标基因重组质粒的铜绿假单胞菌菌株接种至含PM-casein培养基的Falcon圆底试管中培养，每隔2d补充一次无菌水，每隔5d取一次样，将取样所得菌液涂布在LB固体培养基上，培养至长出单菌落后，将单菌落点在牛奶-LB板上培养并观察，用原始铜绿假单胞菌菌株作对照，出现水解圈的单菌落即为突变体菌株。同时，取100μL菌液接种到新的3mL PM-casein培养基中继续摇培。

具体地，将携带有重组质粒的铜绿假单胞菌LasR缺失菌株接种至PM-casein培养基中前需先摇种子液。

具体地，在PM-casein培养基中的培养条件为37℃，220rpm。

具体地，所述原始铜绿假单胞菌菌株为铜绿假单胞菌PAO1。

铜绿假单胞菌在LasR和mexT等基因上存在很多的突变体菌株，它们的毒力和各种性状发生了改变。敲除铜绿假单胞菌的LasR基因会影响铜绿假单胞菌的蛋白水解活性，而在敲除LasR基因的基础上，突变mexT基因又会使得绿假单胞菌的蛋白水解活性恢复。因此，本发明利用LasR敲除突变体和mexT基因对铜绿假单胞菌LasR基因调控网络的未知基因突变体进行了筛选。

本发明利用PUC18T-miniTn7质粒和已知的在铜绿假单胞菌群体感应系统中容易发生突变的基因(mexT)构建了一个重组质粒，对本发明筛选方法进行说明、验证，利用电击转化将构建的重组质粒和pTNS2质粒导入铜绿假单胞菌LasR敲除突变体中，过表达该容易发生突变的基因，并通过在胁迫环境下培养含有所述重组质粒的铜绿假单胞菌，以此筛选突变基因。其中，pTNS2质粒是帮助质粒，能够帮助PUC18T-miniTn7质粒将目的基因插入到铜绿假单胞菌的glms基因位置上，但不影响其性状。而过表达该容易发生突变的基因的原因是，即使这个容易发生突变的基因未来发生了突变，也会因为携带有这个基因的质粒而使该基因的功能恢复。

本发明利用铜绿假单胞菌LasR敲除突变体不能水解酪蛋白的缺陷，将携带所述重组质粒的铜绿假单胞菌在PM-casein液体培养基中不断培养。酪蛋白(Casein)是PM-casein液体培养基中的唯一碳源，铜绿假单胞菌必须能够大量分解才能大量繁殖，而敲除了LasR的菌株缺乏蛋白水解活性。本发明利用这种极端环境和铜绿假单胞菌的进化，使得铜绿假单胞菌朝着有利于自身生存的方向发生突变。这种突变的基因是定向的，它是铜绿假单胞菌基因与基因调控网络中的一环，突变后可能恢复之前的性状。而由于本发明在利用胁迫环境培养铜绿假单胞菌前，通过重组质粒过表达了铜绿假单胞菌中容易发生突变的基因，那么铜绿假单胞菌就会在这个调控的网络中突变其他的基因来使自己生存。通过筛选恢复了酪蛋白水解能力的铜绿假单胞菌，找出相应的突变位点就能更好地研究基因与基因之间的调控关系和调控网络。

本发明具有以下有益效果：

本发明通过在铜绿假单胞菌LasR敲除突变体中过表达易突变基因，利用铜绿假单胞菌LasR敲除突变体不能水解酪蛋白的缺陷进行胁迫，在胁迫环境下进行培养，诱使其发生突变，再通过筛选恢复蛋白水解能力的铜绿假单胞菌，找出相应的突变位点。本发明所述方法更为直接、简便、快捷，能够使得某个具体调控网络中的基因发生定向的未知突变，较现有的方法来说，不仅能更好地发现基因与基因之间的调控关系和调控网络，且大大节省了时间。

附图说明

图1为PUC18T-miniTn7-mexT重组质粒的结构示意图。

图2为牛奶-LB板上筛选到的突变体菌株。

图3为pGEX2-rpoA2载体的结构示意图。

图4为rpoA突变的验证结果图。

图5为用PAO1-ΔLasRΔpsdR双敲除菌株在牛奶-LB板上筛选到的突变体菌株。

图6为pGEX2-gshA点突变载体的结构示意图。

图7为gshA突变的验证结果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1

本实施例以铜绿假单胞菌PAO1的mexT基因作为目的基因来对本发明的筛选方法进行更详细的说明，本实施例所用引物的名称及其序列见表1。

表1引物序列表

S1.构建携带目标基因mexT的重组质粒

(1)目标基因mexT的PCR扩增

以铜绿假单胞菌PAO1的基因组DNA为模板，用正向引物miniTn7-mexT-F和反向引物miniTn7-mexT-R进行PCR扩增，在mexT的上下游各多扩增200多bp，最终扩增得到长度为1577bp的片段，命名为miniTn7-mexT片段。正向引物miniTn7-mexT-F和反向引物miniTn7-mexT-R是以Gene ID：880417所示序列为目标进行设计的。PCR扩增结束后，通过电泳检测并通过切胶回收PCR产物。

(2)mexT片段和PUC18T-miniTn7酶切质粒同源重组

将PUC18T-miniTn7质粒用BamHI和HindIII内切酶酶切后胶回收，获得质粒酶切产物，命名为miniTn7-BamHI-HindIII；将PCR扩增回收的mexT片段跟miniTn7-BamHI-HindIII片段用一步定向克隆试剂盒(Novoprotein，NR001B)无缝连接同源重组，50℃反应20min。

(3)热击转化

按常规方法制备得到大肠杆菌DH5α感受态细胞，取100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞与5μL miniTn7-mexT同源重组反应液轻柔混合，冰浴20min后42℃热击90s，立即转入冰上5min。迅速加入500μL LB液体培养基，取少量菌液在37℃培养1h后涂布于LB固体培养基(含50μg/mL的Gm(Gentamicin、硫酸庆大霉素))上，在37℃过夜培养。用正向引物miniTn7-F和反向引物miniTn7-R检测获得阳性转化子后，将对应的菌株命名为DH5α-MiniTn7-mexT。

(4)将DH5α-MiniTn7-mexT用LB培养基培养后，用OMEGA公司质粒提取试剂盒提取MiniTn7-mexT质粒。

本发明构建所得的PUC18T-miniTn7-mexT重组质粒的结构示意图如图1所示。

S2.电击转化铜绿假单胞菌突变体菌株并在胁迫环境下筛选突变体

(1)将PUC18T-miniTn7-mexT质粒插入到铜绿假单胞菌突变体菌株中

将培养过夜的铜绿假单胞菌PAO1-LasR敲除突变体用10％的蔗糖溶液制作成感受态细胞，然后将PUC18T-miniTn7-mexT质粒和pTNS2帮助质粒混合后加入到感受态细胞中，置于0.2cm预冷的电击杯中，用Bio-Rad电转仪在2.5kV进行电击，用电击杯进行电击后，迅速加入1mL LB液体培养基，取少量菌液在37℃培养1h后涂布于LB固体培养基(含100μg/mL的Gm(Gentamicin、硫酸庆大霉素))上，在37℃过夜培养。

用正向引物glmsup-F和反向引物glmsdown-R检测获得阳性转化子后，将对应菌株命名为PAO1-ΔLasR-MiniTn7-mexT。

(2)胁迫环境下筛选突变体

将菌株PAO1-ΔLasR-MiniTn7-mexT摇种子液，于37℃，220rpm，摇培5h后取100μL的种子液接种到3mL的PM-casein培养基中，所用试管为14mL Falcon圆底试管，于37℃，220rpm摇培，每隔2天补充无菌水。同时，每隔5天取100μL的摇培液，用无菌水或者LB液体培养基稀释后，涂布在LB固体培养基上，于37℃培养箱培养20小时长出单菌落后，将单菌落用无菌的牙签点在牛奶-LB(常规LB培养基中添加终浓度为4％的脱脂奶粉)板上，于37℃培养箱中培养20小时，用野生型菌株和ΔLasRΔmexT做阳性对照(由于mexT过表达会影响下游基因的表达，减弱蛋白水解能力，敲除mexT后蛋白水解能力反而增强了，故可用作对照)，ΔLasR做阴性对照，看牛奶板上是否出现水解圈，出现水解圈的即为想要找的突变体。

本发明经过25～30天的筛选后，筛选到了具有水解圈的突变体，结果如图2所示。其中，第一排左侧2孔为野生型菌株，中间两孔为ΔLasR突变体，右侧两孔为ΔLasRΔmexT突变体，其余均为测试的单菌落。由图2可知，与野生型PAO1和ΔLasRΔmexT表型相同，部分单菌落在牛奶-LB板培养后出现了明显的水解圈，蓝黑色的圈是蛋白水解圈，越黑越大说明水解能力越强。

S3.突变体的检测

(1)目的基因的突变检测

对mexT进行扩增并测序，以此检测突变是否是由mexT的突变引起的。本发明将筛选到的突变体用正向引物mexT-JC-F和反向引物mexT-JC-R进行了PCR扩增，并送公司测序，将测序结果与原始序列进行比对后发现基因组上的基因mexT并未发生突变。故提取突变体的基因组DNA进行突变基因的检测鉴定。

(2)测序鉴定突变基因

挑选3株突变体菌株，分别用LB培养基培养。37℃，220rpm，摇培6h后取1mL菌液，用DNA提取试剂盒(全式金，EE161)提取基因组DNA，具体参照试剂盒说明书进行。将提取得到的DNA送诺禾致源公司进行重测序，经比对发现3株突变体均在相同的基因(rpoA)上面出现了同样的碱基突变，其编码的氨基酸也发生了改变。

S4.重新敲除突变基因验证

用正向引物pGEX2-rpoA2-F和反向引物pGEX2-rpoA2-R，以鉴定好突变位点的突变体为模板进行PCR扩增并进行胶回收，获得PCR产物，命名为rpoA2-G片段，长度为2412bp。将pGEX2自杀质粒用XbaI和EcoRI内切酶酶切，胶回收，获得质粒酶切产物，命名为pGEX2-XbaI-EcoRI。将PCR扩增回收的rpoA2-G片段跟pGEX2-XbaI-EcoRI片段用一步定向克隆试剂盒(Novoprotein，NR001B)无缝连接同源重组，50℃反应20min。

按常规方法制备得到大肠杆菌DH5α感受态细胞。取100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞与5μL pGEX2-rpoA2-G同源重组反应液轻柔混合，置于冰上20min，42℃热击90s，立即转入冰上5min。

迅速加入500μL LB液体培养基，取少量菌液在37℃培养1h后涂布于LB固体培养基(含50μg/mL的Gm(Gentamicin、硫酸庆大霉素))上，在37℃过夜培养。

用正向引物pGEX2-F和反向引物pGEX2-R筛选获得阳性转化子后，将对应菌株命名为DH5α-pGEX2-rpoA2-G。

本发明构建所得的pGEX2-rpoA2载体的结构示意图如图3所示。

将铜绿假单胞菌PAO1-LasR敲除突变体，DH5α-pGEX2-rpoA2-G和DH5α-PRK2013(帮助质粒，帮助pGEX2自杀质粒结合到宿主细菌内)三者三亲混合，滴在LB板上8个小时，然后稀释涂布在PIA培养基板(含100μg/mL的Gm(Gentamicin、硫酸庆大霉素))上，37℃培养24h。将长出来的转化子用10％的蔗糖-LB无盐板再筛，经过蔗糖板的转化子在发生交换后质粒自杀，无抗性。用正向引物rpoA-JC-F和反向引物rpoA-JC-R进行PCR扩增检测，送公司测序，测序显示部分rpoA的突变位点碱基已经替换。

实施例2

在牛奶-LB板上对PAO1-ΔLasR-rpoA点突变菌进行表型检测，同时用铜绿假单胞菌PAO1-ΔLasR突变体和铜绿假单胞菌PAO1-ΔLasR-rpoA-miniTn7-mexT筛选得到的突变体做对照，结果如图4所示。由图4可知，PAO1-ΔLasR-rpoA点突变菌在牛奶-LB板出现了水解圈，敲除rpoA点突后的菌株与筛选到的突变体的表型相同，表明rpoA点突变敲除成功。其蛋白水解能力比mexT过表达的突变体更强是因为mexT过表达影响了下游基因的表达，减弱蛋白水解能力。上述结果表明该基因参与调控了LasR的调控网络。

实施例3

本实施例以mexT基因作为载体上目的基因，利用铜绿假单胞菌PAO1的LasR和psdR双缺失突变体来对本发明的筛选方法进行更详细的说明。本实施例所用引物的名称及其序列见表2。

表2引物序列表

S1.构建携带目标基因mexT的重组质粒

本实施例所构建的mexT重组质粒与实施例1是相同的，此处不再赘述，重组质粒的结构示意图如图1所示。

S2.电击转化铜绿假单胞菌突变体菌株并在胁迫环境下筛选突变体

(1)将PUC18T-miniTn7-mexT质粒插入到铜绿假单胞菌突变体菌株中

将培养过夜的铜绿假单胞菌PAO1-LasR-psdR双敲除突变体用10％的蔗糖溶液制作成感受态细胞，然后将PUC18T-miniTn7-mexT质粒和pTNS2帮助质粒混合后加入到感受态细胞中，置于0.2cm预冷的电击杯中，用Bio-Rad电转仪在2.5kV进行电击，用电击杯进行电击后，迅速加入1mL LB液体培养基，取少量菌液在37℃培养1h后涂布于LB固体培养基(含100μg/mL的Gm(Gentamicin、硫酸庆大霉素))上，在37℃过夜培养。

用正向引物glmsup-F和反向引物glmsdown-R检测获得阳性转化子后，将对应菌株命名为PAO1-ΔLasR-ΔpsdR-MiniTn7-mexT。

(2)胁迫环境下筛选突变体

将菌株PAO1-ΔLasR-ΔpsdR-MiniTn7-mexT摇种子液，于37℃，220rpm，摇培5h后取100μL的种子液接种到3mL的PM-casein培养基中，所用试管为14mL Falcon圆底试管，于37℃，220rpm摇培，每隔2天补充无菌水。同时，每隔5天取100μL的摇培液，用无菌水或者LB液体培养基稀释后，涂布在LB固体培养基上，于37℃培养箱培养20小时长出单菌落后，将单菌落用无菌的牙签点在牛奶-LB(常规LB培养基中添加终浓度为4％的脱脂奶粉)板上，于37℃培养箱中培养20小时，用野生型菌株做阳性对照，ΔLasR做阴性对照，看牛奶板上是否出现水解圈，出现水解圈的即为想要找的突变体。与此同时，取100μL菌液接种到新的3mL PM-casein培养基中继续摇培。

本发明经过25～30天的筛选后，筛选到了具有水解圈的突变体，结果如图5所示。其中，第一排右侧第1孔为野生型菌株，第2孔为ΔLasR突变体，其余均为测试的单菌落。由图5可知，与野生型PAO1表型相同，部分单菌落在牛奶-LB板培养后出现了明显的水解圈，蓝黑色的圈是蛋白水解圈，越黑越大说明水解能力越强。

S3.突变体的检测

(1)目的基因的突变检测

对mexT进行扩增并测序，以此检测突变是否是由mexT的突变引起的。本发明将筛选到的突变体用正向引物mexT-JC-F和反向引物mexT-JC-R进行了PCR扩增，用正向引物rpoA-JC-F和反向引物rpoA-JC-R进行并送公司测序，将测序结果与原始序列进行比对后发现基因组上的基因mexT和rpoA并未发生突变。故提取突变体的基因组DNA进行突变基因的检测鉴定。

(2)测序鉴定突变基因

挑选2株突变体菌株，分别用LB培养基培养。37℃，220rpm，摇培6h后取1mL菌液，用DNA提取试剂盒(全式金，EE161)提取基因组DNA，具体参照试剂盒说明书进行。将提取得到的DNA送诺禾致源公司进行重测序，经比对发现gshA基因上面出现了碱基突变，其编码的氨基酸也发生了改变。

S4.重新敲除突变基因验证

用正向引物pGEX2-gshA-F和反向引物pGEX2-gshA-R，以鉴定好突变位点的突变体为模板进行PCR扩增并进行胶回收，获得PCR产物，命名为gshA片段，长度为1459bp。将pGEX2自杀质粒用HindⅢ和XmaⅠ内切酶酶切，胶回收，获得质粒酶切产物，命名为pGEX2-HindⅢ-XmaⅠ。将PCR扩增回收的gshA片段跟pGEX2-HindⅢ-XmaⅠ片段用一步定向克隆试剂盒(Novoprotein，NR001B)无缝连接同源重组，50℃反应45min。

按常规方法制备得到大肠杆菌DH5α感受态细胞。取100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞与5μL pGEX2-gshA同源重组反应液轻柔混合，置于冰上20min，42℃热击90s，立即转入冰上5min。

迅速加入500μL LB液体培养基，取少量菌液在37℃培养1h后涂布于LB固体培养基(含50μg/mL的Gm(Gentamicin、硫酸庆大霉素))上，在37℃过夜培养。

用正向引物pGEX2-F和反向引物pGEX2-R筛选获得阳性转化子后，将对应菌株命名为DH5α-pGEX2-gshA。

本发明构建所得的pGEX2-gshA载体的结构示意图如图6所示。

将铜绿假单胞菌PAO1-ΔLasRΔpsdR敲除突变体，DH5α-pGEX2-gshA和DH5α-pRK2013三者三亲混合，滴在LB板上8个小时，然后稀释涂布在PIA培养基板(含100μg/mL的Gm(Gentamicin、硫酸庆大霉素))上，在37℃过夜培养24h。将长出来的转化子过10％的蔗糖-LB无盐板，经过蔗糖板后的转化子发生交换后质粒自杀，无抗性。用引物正向引物gshA-JC-F和反向引物gshA-JC-R进行PCR扩增检测，送公司测序，测序显示部分gshA的突变位点碱基已经替换。用铜绿假单胞菌PAO1、ΔLasR敲除体、ΔLasRΔpsdR双敲除突变体、ΔLasRΔpsdRΔMexT三敲除突变体做对照，在牛奶-LB板上进行表型检测，结果如图7所示。由图7可知，出现水解圈表明gshA点突变敲除成功，敲除gshA点突后的菌株与筛选到的突变体的表型相同，表明该基因参与调控了这个调控网络。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。