一种构建自发产生捕食器官的少孢节丛孢的方法

摘要

本发明提供了一种构建自发产生捕食器官的少孢节丛孢的方法，属于分子生物学技术领域，所述方法包括：将启动子、目的基因、GFP序列、潮霉素筛选标记和终止子依次连接后整体构建于pCE‑Zero载体，后采用引物1进行PCR扩增,得到荧光转化片段；制备少孢节丛孢原生质体，将所述荧光转化片段转化至所述少孢节丛孢原生质体中；筛选出阳性转化子。通过该方法获得的少孢节丛孢能够自发产生捕食器官，对线虫的响应大大提前，对线虫具有更好的防治效果。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种构建自发产生捕食器官的少孢节丛孢的方法。

背景技术

植物寄生线虫引起的病害在全球普遍存在，每年给农业造成的经济损失十分巨大。长期以来化学线虫防治被认为是一种较有效的手段，但杀线虫的化学农药高毒性、高残留，严重影响到农产品和人体安全。作为一种极具应用前景的手段，生物防治展现出了强大的优越性。

自然界中线虫防治的真菌种类繁多、分布广泛，在线虫存在的情况下，它们会从腐生型向捕食型转变，这对调控生态系统中病原线虫种群平衡起到重要作用。根据侵染线虫的方式不同，可分为捕食线虫真菌、内寄生线虫真菌、产毒真菌和机会真菌。不同种类的线虫防治真菌获取营养的方式不同，绝大多数既能营腐生生活，也能与线虫互作利用寄生的方式吸收营养，即生活在有机质环境中营腐生生活，存在线虫时又能转变为寄生生活模式，产生各种特殊的菌丝结构。捕食线虫真菌为了捕获线虫，可以通过营养菌丝分化不同形态的捕器以此来捕获线虫，例如无结菌丝、三维菌网、粘性分支、收缩环、粘球和非收缩环。这些不同形态特征的捕器提高了捕食线虫的能力，使得捕食线虫真菌成为热门的硏究对象。

少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)在饥饿环境下能形成粘性三维菌网捕食线虫，该菌具有世界分布性，在各种不同的环境下，甚至是受到重金属污染的土壤中，少孢节丛孢均显示出了较高的捕食线虫能力，并处于丰富度较高的真菌之列，因此通常被用作捕器形成和线虫-真菌相互作用的模式菌株。少孢节丛孢捕杀线虫的过程较为复杂，首先，加入生长状况一致的线虫，随着诱导时间延长,菌丝的形态会慢慢发生变化进而产生捕器，同时分泌黏性物质黏住线虫，这个过程会产生一些水解酶，然后线虫体内被菌丝慢慢侵入，形成侵入钉或者侵入球，慢慢地产生同化菌丝，最终消化分解线虫。因此在生防领域，相较于普通菌株，若能构建一株自发产生捕器的少孢节丛孢则可能对线虫的响应大大提前，达到更好的预防效果，因此构建一株自发产生捕器的少孢节丛孢对于生产实践而言是迫切需要的。

发明内容

为了解决线虫的生物防治问题，本发明提供了一种构建自发产生捕食器官的少孢节丛孢的方法，通过该方法获得的少孢节丛孢能够自发产生捕食器官，对线虫的响应大大提前，对线虫具有更好的防治效果。

本发明通过以下技术方案实现：

一种构建自发产生捕食器官的少孢节丛孢的方法，所述方法包括：

将启动子、目的基因、GFP序列、潮霉素筛选标记和终止子依次连接后整体构建于pCE-Zero载体，后采用引物1进行PCR扩增,得到荧光转化片段；

制备少孢节丛孢原生质体，将所述荧光转化片段转化至所述少孢节丛孢原生质体中；

筛选出阳性转化子；

其中，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述GFP序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述潮霉素筛选标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步的，所述引物1包括引物1-F和引物1-R，所述引物1-F的核苷酸序列如SEQID NO.6所示，所述引物1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

进一步的，所述将启动子、目的基因、GFP序列、潮霉素筛选标记和终止子依次连接后整体构建于pCE-Zero载体，后采用引物1进行PCR扩增,得到荧光转化片段，具体包括：

将启动子、目的基因、GFP序列、潮霉素筛选标记和终止子分别进行PCR扩增，PCR扩增产物按照启动子、目的基因、潮霉素筛选标记和终止子的顺序依次连接后整体构建于pCE-Zero载体，后采用引物1进行PCR扩增,胶回收得到荧光转化片段。

进一步的，所述制备少孢节丛孢原生质体，将所述荧光转化片段转化至所述少孢节丛孢原生质体中，具体包括：

采用蜗牛酶和纤维素酶制备少孢节丛孢原生质体，通过PEG/CaCl

基于潮霉素筛选标记筛选出阳性转化子。

进一步的，筛选出阳性转化子后，将所述阳性转化子进行产孢培养，获得阳性转化子孢子。

基于同一发明构思，本申请还提供一种自发产生捕食器官的少孢节丛孢，所述自发产生捕食器官的少孢节丛孢通过上述一种构建自发产生捕食器官的少孢节丛孢的方法制备。

基于同一发明构思，本申请还提供一种构建自发产生捕食器官的少孢节丛孢的方法在制备线虫生物防治药剂中的应用。

基于同一发明构思，本申请还提供一种自发产生捕食器官的少孢节丛孢在制备线虫生物防治药剂中的应用。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

1.本发明一种构建自发产生捕食器官的少孢节丛孢的方法，将荧光转化片段转化至少孢节丛孢原生质体中，得到的少孢节丛孢能够自发产生捕食器官，为线虫生物防治提供了新的途径。

2.本发明一种自发产生捕食器官的少孢节丛孢，所述少孢节丛孢无需线虫诱导，能够自发产生捕食器官，显著提升了少孢节丛孢对线虫的响应效率，并且在线虫防控响应上更为灵敏，为线虫生物防治提供了新的途径。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为H2B-GFP阳性转化子的菌丝在WA平板中菌丝自发产生捕器显微图。

图2为H2B-GFP阳性转化子的捕器放大图。

图3为H2B-GFP阳性转化子传代培养显微图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

下面将结合实施例及实验数据对本申请一种构建自发产生捕食器官的少孢节丛孢的方法进行详细说明。

实施例1

一种构建自发产生捕食器官的少孢节丛孢的方法，包括以下步骤；

1)荧光转化片段的构建：把启动子-目的基因-GFP序列-潮霉素筛选标记-终止子分别PCR扩增后，按照该顺序连接后整体构建于pCE-Zero载体(ClonExpress Ultra OneStep Cloning Kit,Vazyme，南京)，随后以引物1扩增荧光转化片段，胶回收后得到荧光转化片段，所述荧光转化片段包含启动子-目的基因-GFP序列-潮霉素筛选标记-终止子，其核苷酸序列见SEQ ID NO.8。

其中，启动子的主要作用是在蛋白水平启动目的基因的表达；目的基因的作用是靶向菌丝中基因的特殊的定位，GFP序列的作用是利用绿色荧光可视化该定位；潮霉素筛选标记的作用是筛选成功导入原生质体中的阳性转化子，降低假阳性的概率；终止子的作用是在蛋白水平终止翻译。将这段荧光转化片段序列导入原生质体后，其可在菌丝中翻译出目的基因-GFP蛋白，完成定位的可视化。

申请人发现，组蛋白H2B作为核小体的核心成分，调控了数目众多基因的转录及蛋白翻译，而少孢节丛孢捕器的产生就受到这种广泛的调控，另一方面，组蛋白H2B修饰作为表观遗传修饰的一部分，其甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等修饰在不改变DNA的前提下，使基因功能多样性，捕器就是基因调控在特定时空表达的产物。

具体而言，就自发产捕器的机制我们做出了如下推测：我们认为少孢节丛孢的正常菌丝转变为捕器这种形态的可塑性，单泛素化动态修饰发挥了重要作用，即菌丝-捕器转换过程中，H2B的泛素化与去泛素化分别由E3泛素连接酶和去泛素化酶所调控。组蛋白的单泛素化(H2Bub)在正常菌丝状态下保持较低水平，当菌丝向捕器转变过程中单泛素化水平可明显升高。我们对组蛋白H2B进行的GFP标记类似于在菌丝中过表达H2B，使菌丝中的H2B单泛素化水平明显升高，进而导致捕器自发产生。有趣的是，已有研究表明H2Bub表达水平与菌丝的程序性激活相关。其中H2B泛素化和去泛素化在酵母菌菌丝形态可逆转变期间由E3连接酶Bre1和去泛素化酶Ubp8动态调节。Bre1和Ubp8在菌丝特异性基因(HSG)调控中的功能似乎是直接的，因为它们在菌丝诱导过程中都被募集到HSG的编码区。Bre1和Ubp8向HSG编码区的顺序募集对于HSG表达的启动和维持很重要。相似的是，少孢节丛孢菌丝到捕器也涉及到了形态学转变，因此我们猜测可能是H2B泛素化调节了这一过程。本申请首次将H2B泛素化与食线虫真菌的形态学转变及侵染性相关联，呈现出潜在的生防应用价值。

具体的，把启动子-目的基因-GFP序列-潮霉素筛选标记-终止子分别PCR扩增后，按照该顺序连接后整体构建于pCE-Zero载体，包括：

(1)把5个片段利用引物PCR扩增回收后，分别进行浓度测定。

(2)最适克隆载体pCE-Zero使用量＝[0.02×克隆载体碱基对数3957]＝79.14ng

启动子-目的基因片段的最适使用量＝[0.02×片段碱基对数1624]＝32.48ng

GFP片段的最适使用量＝[0.02×片段碱基对数720]＝14.4ng

潮霉素筛选标记片段的最适使用量＝[0.02×片段碱基对数1835]＝36.7ng

终止子片段的最适使用量＝[0.02×片段碱基对数1002]＝20.04ng

(3)根据所需的质量加入每个片段对应的体积，随后向PCR管中加入5μl的2×ClonExpress Mix，最终以ddH

(4)将PCR管置于PCR仪以50℃反应15min；最终降至4℃。

引物1扩增荧光转化片段包括：

(1)把上述的含5个片段的pCE-Zero载体提取质粒后，把质粒进行稀释，以质粒为模板(浓度为200ng/μl)。

(2)以25μl的PCR体系进行扩增(Vazyme，P505)，具体体系为：0.5μldNTP Mix，1μl引物1-F，1μl引物1-R，0.5μl的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，1μl模板质粒,12.5μl的2×Phanta Max Buffer，8.5μl的ddH

(3)PCR反应条件为：

(4)PCR产物胶回收

目标片段大小为5190bp，跑胶后把对应的条带切下，以每0.1g胶块的重量加入100μl溶胶buffer的比例，于55℃水浴溶胶。最终把全部液体上柱进行回收，加入ddH

用6层无菌滤纸过滤多余菌丝，以5000rpm离心收集原生质体，利用STC buffer(18.21g/100ml D-Sorbitol，0.555g/100ml CaCI

具体的，以PEG/CaCl

(1)将PDA上培养4-5天的少孢节丛孢菌块接于TG培养基中，28℃静置培养24h，180rpm摇床培养12h，用灭过菌的4层滤纸过滤收集菌丝。

(2)将菌丝置于酶解液中，30℃，150rpm酶解4-5h，镜检查看原生质体数量。

(3)用6层灭过菌的滤纸过滤得到原生质体。

(4)4℃，6000rpm离心5min收集原生质体，用冰浴的STC溶液洗三次。

(5)用100μL的STC重悬原生质体，加入35μL回收的片段，轻轻混匀以后，于冰上静置30min。

(6)加入1mL的PTC溶液(STC buffer:60％PEG4000＝1:2V/V)，轻轻颠倒混匀后于28℃放置20min。

(7)将反应后的溶液涂布于TB3平板上，每个平板100μL，置于28℃培养过夜。

(8)于之前的平板上铺上一层加有100mg/mL潮霉素的TB3培养基，用于抗性菌落的筛选。

(9)置于28℃培养5-7天后，即可长出抗性菌落。

最终在含有潮霉素的平板上筛选出绿色荧光的阳性转化子(即H2B-GFP阳性转化子)。

如图1所示，把阳性转化子接种于WA平板上，分别利用明场和绿色荧光观察发现可以自发产生捕器，图2A为菌丝上形成捕器的情况，分别以明场和绿色荧光进行观察；图2B为捕器的绿色荧光观察情况，可明显观察到绿色荧光呈点状分布。

实施例2

一种构建自发产生捕食器官的少孢节丛孢的方法，包括以下步骤；

荧光转化片段的构建：把启动子-目的基因-潮霉素筛选标记-终止子分别PCR扩增后，按照该顺序连接后整体构建于pCE-Zero载体，随后以引物1扩增荧光转化片段，胶回收后得到荧光转化片段。

把0.12g的蜗牛酶和0.12g的纤维素酶溶于16mL的MN溶液中(0.3mol NaCl、0.3molMgSO

用6层无菌滤纸过滤多余菌丝，以5000rpm离心收集原生质体，利用STC清洗两次原生质体后，以PEG/CaCl

最终在含有潮霉素的平板上筛选出绿色荧光的阳性转化子。

把阳性转化子接种于CMY平板培养7-10d，待其产生大量孢子后，用无菌水洗脱下孢子，用六层无菌擦镜纸过滤，滤液离心收集孢子。

把孢子涂布于水琼脂平板，28℃培养4天，菌株可自发产生捕器。

实施例3

一种构建自发产生捕食器官的少孢节丛孢的方法，包括以下步骤；

荧光转化片段的构建：把启动子-目的基因-潮霉素筛选标记-终止子分别PCR扩增后，按照该顺序连接后整体构建于pCE-Zero载体，随后以引物1扩增荧光转化片段，胶回收后得到荧光转化片段。

把0.12g的蜗牛酶和0.12g的纤维素酶溶于16mL的MN溶液中(0.3mol NaCl、0.3molMgSO

用6层无菌滤纸过滤多余菌丝，以5000rpm离心收集原生质体，利用STC清洗两次原生质体后，以PEG/CaCl

最终在含有潮霉素的平板上筛选出绿色荧光的阳性转化子。

把阳性转化子接种于CMY平板培养7-10d，待其产生大量孢子后，用无菌水洗脱下孢子，用六层无菌擦镜纸过滤，滤液离心收集孢子。

把孢子涂布于水琼脂平板，28℃培养4天，菌株可自发产生捕器。

切取自发产生捕器的菌块接种于新的水琼脂平板(传代第一代)，新生菌丝上依旧可以产捕器。

实施例4

一种构建自发产生捕食器官的少孢节丛孢的方法，包括以下步骤；

荧光转化片段的构建：把启动子-目的基因-潮霉素筛选标记-终止子分别PCR扩增后，按照该顺序连接后整体构建于pCE-Zero载体，随后以引物1扩增荧光转化片段，胶回收后得到荧光转化片段。

把0.12g的蜗牛酶和0.12g的纤维素酶溶于16mL的MN溶液中(0.3mol NaCl、0.3molMgSO

用6层无菌滤纸过滤多余菌丝，以5000rpm离心收集原生质体，利用STC清洗两次原生质体后，以PEG/CaCl

最终在含有潮霉素的平板上筛选出绿色荧光的阳性转化子。

把阳性转化子接种于CMY平板培养7-10d，待其产生大量孢子后，用无菌水洗脱下孢子，用六层无菌擦镜纸过滤，滤液离心收集孢子。

把孢子涂布于水琼脂平板，28℃培养4天，菌株可自发产生捕器。

切取自发产生捕器的菌块接种于新的水琼脂平板(传代第一代)，新生菌丝上依旧可以产捕器。

把上述传代第一代的菌块接种于新的水琼脂平板(传代第二代)，新生菌丝上依旧可以产捕器。

实施例5

一种构建自发产生捕食器官的少孢节丛孢的方法，包括以下步骤；

荧光转化片段的构建：把启动子-目的基因-潮霉素筛选标记-终止子分别PCR扩增后，按照该顺序连接后整体构建于pCE-Zero载体，随后以引物1扩增荧光转化片段，胶回收后得到荧光转化片段。

把0.12g的蜗牛酶和0.12g的纤维素酶溶于16mL的MN溶液中(0.3mol NaCl、0.3molMgSO

用6层无菌滤纸过滤多余菌丝，以5000rpm离心收集原生质体，利用STC清洗两次原生质体后，以PEG/CaCl

最终在含有潮霉素的平板上筛选出绿色荧光的阳性转化子。

把阳性转化子接种于CMY平板培养7-10d，待其产生大量孢子后，用无菌水洗脱下孢子，用六层无菌擦镜纸过滤，滤液离心收集孢子。

把孢子涂布于水琼脂平板，28℃培养4天，菌株可自发产生捕器。

如图3所示，切取自发产生捕器的菌块接种于新的水琼脂平板(传代第一代)，新生菌丝上依旧可以产捕器。

把上述传代第一代的菌块接种于新的水琼脂平板(传代第二代)，新生菌丝上依旧可以产捕器。

把上述传代第二代的菌块接种于新的水琼脂平板(传代第三代)，新生菌丝上依旧可以产捕器。

图3中，A1、A2、A3均为H2B-GFP菌株的孢子涂布于WA平板的显微图，箭头处为自发产生的捕器。B1、B2、B3为第二代(传代第一代)培养显微图，仍可产生捕器。C1、C2、C3为为第三代(传代第二代)培养显微图，为同一捕器在不同放大倍数下的观察情况。

序列1是启动子序列

序列2是目的基因序列

序列3是GFP序列

序列4是潮霉素筛选标记序列

序列5是终止子序列

序列6是引物1-F序列

序列7是引物1-R序列

序列8是荧光转化片段序列

序列1

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序列8

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最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。