法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2023-06-13
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K35/742 专利申请号:2023100602378 申请日:20230114
实质审查的生效
2023-05-26
公开
发明专利申请公布
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及枯草芽胞杆菌JZXJ-7联合n-3多不饱和脂肪酸在改善肠道生理功能中的应用。
背景技术
肠道既是机体内最大的消化吸收器官,是所有营养物质最终的吸收场所,同时也是体内最大的免疫器官。肠道的发育状况及其免疫屏障功能对人体和动物的生长与健康至关重要。肠道屏障由物理屏障、化学屏障、微生物屏障和免疫屏障所构成,肠道屏障功能出现异常会导致营养物质的消化吸收功能紊乱、生长缓慢、抗病能力下降、对病原微生物的易感性增强,引起各种疾病的发生。比如肠道微生物屏障的菌群失调可富集释放脂多糖的革兰阴性菌,进而增加肠道黏膜通透性,引起全身性的低度炎症,导致胰岛素抵抗和糖尿病;物理屏障可受饮食、疾病、应激等的影响,有些应激反应可能会导致肠道黏膜萎缩、肠道上皮完整性和肠黏膜屏障被破坏以及肠道功能紊乱等。
n-3多不饱和脂肪酸是人体必需脂肪酸以及维持细胞结构和功能的重要组成成分,以EPA和DHA为代表的n-3多不饱和脂肪酸主要来源于鲑鱼、金枪鱼和沙丁鱼等海洋鱼类。近年来,有研究发现n-3多不饱和脂肪酸可恢复肠道菌群平衡及减轻炎症。益生菌作为一种膳食补充剂,它可以提高动物生长性能和增强机体免疫力,并且还可以平衡肠道菌群和与病原菌竞争定植点,进而改善肠道健康。然而,各种物质在单独作用时对肠道功能的调节效果都差强人意,因此,开发能协同增效调节肠道功能的联合制剂还有待筛选和研究,目前关于枯草芽胞杆菌与n-3多不饱和脂肪酸联合增效改善肠道生理功能的应用尚未见报道。
发明内容
为弥补现有技术不足,本发明提供枯草芽胞杆菌JZXJ-7联合n-3多不饱和脂肪酸(鱼油)在改善肠道生理功能中的应用,枯草芽胞杆菌JZXJ-7联合鱼油比各自单独作用时产生更多的益生功效,联合制剂对肠道生理功能具有调节肠道菌群、减少肠道炎症反应和维持肠生态稳定的作用。
本发明的的目的通过以下技术方案实现:
枯草芽胞杆菌JZXJ-7联合n-3多不饱和脂肪酸在制备改善肠道生理功能的制剂中的应用,本发明所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JZXJ-7菌株于2022年5月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC No:62458。
优选的,所述制剂改善肠道生理功能至少具备如下一种表现:
(1)提高肠道菌群多样性;
(2)改善结肠形态、增加隐窝深度、增加杯状细胞数量;
(3)减轻结肠纤维化程度;
(4)减少肠道炎症反应;
(5)增强肠道抗氧化能力。
更优选的,所述减轻结肠纤维化程度时候指肠组织关键纤维化蛋白TICP和TIIICP表达下调。
更优选的,所述减少肠道炎症反应是指结肠组织中白介素1β、白介素6和肿瘤坏死因子α水平下调,白介素10水平上调。
更优选的,所述增强肠道抗氧化能力是指结肠组织中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和总抗氧化酶表达上调。
更优选的,所述鱼油的用量为2-4mg/d,枯草芽胞杆菌JZXJ-7的用量为10
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明将枯草芽胞杆菌JZXJ-7联合鱼油使用比各自单独作用时益生功效有显著性差异,联合制剂显著下调结肠纤维化蛋白表达,增强了肠黏膜完整性、提高过氧化氢酶,超氧化物歧化酶和总抗氧化活性,降低肿瘤坏死因子α,白细胞介素1β和白介素6水平,提高抗炎因子IL-10水平,减轻了氧化应激和炎症反应。同时,联合制剂还显著提高了短链脂肪酸相关菌属丰度,如粪杆菌属、双歧杆菌和拟杆菌属,增加有益菌群丰度,显著改善肠道菌群组成,维持肠微生态平衡。本发明所述联合制剂对肠道生理功能具有较好的改善作用,有望干预肠道病理损伤和肠道菌群紊乱相关疾病。
附图说明
图1为膳食补充鱼油和枯草芽孢杆菌JZXJ-7对小鼠生长性能和结肠形态的影响测试结果分析图。
图2为鱼油和枯草芽孢杆菌JZXJ-7对小鼠结肠屏障功能的影响结果分析图。
图3为鱼油和枯草芽孢杆菌JZXJ-7对小鼠肠道抗氧化状态和炎症参数的影响分析图。
图4为鱼油和枯草芽孢杆菌JZXJ-7对结肠微生物的影响分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
实验过程
1、材料与方法
1.1、试剂
鱼油制剂由中国德阳华康药业有限公司提供(n-3多不饱和脂肪酸总含量为88.86%,EPA:DHA=1:1);MRS液体培养基,北京路桥生物技术有限公司;磷酸盐缓冲溶液(PBS,PH7.2)、氯化钠(NaCl)、4%多聚甲醛溶液,上海索莱宝科技有限公司;苏木素伊红染色试剂盒、过碘酸雪夫染色液试剂盒、抗氧化酶试剂盒、免疫荧光试剂盒、免疫组化试剂盒、细胞因子酶联免疫试剂盒,南京建成科技有限公司;Trizol提取剂、cDNA逆转录试剂盒、预混型qPCR试剂盒,艾科瑞生物工程有限公司。
1.2、益生菌株和活化
枯草芽孢杆菌JZXJ-7保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC No:62458。
从-80℃冰箱中取出枯草芽孢杆菌JZXJ-7冻干粉,接种至MRS培养基中,35℃有氧条件下活化48h,取菌液转入50mL无菌离心管中,4℃、8,000g离心10min,弃上清液后加入等体积无菌PBS溶液重悬,再次离心,重复上述操作两次去除培养基;最后,使用PBS调整菌悬液浓度至10
1.3、动物实验
无特定病原体(SPF)级7周龄C57BL/6J雄性小鼠,由北京生物技术有限公司生产(批准文号:029357)。所有过程均按实验动物护理和使用指南(批准号:0604)进行。
适应一周后,将24只小鼠随机分为4组(n=6):对照组(CK)、鱼油干预组(FO)、枯草芽孢杆菌JZXJ-7干预组(JZXJ-7)和联合制剂组(FO+JZXJ-7)。FO组、JZXJ-7组和FO+JZXJ-7组小鼠每天灌胃1次0.1mL鱼油水乳剂(2mg FO)和0.1mL枯草芽孢杆菌JZXJ-7(10
1.4、结肠病理分析
将1cm固定在4%多聚甲醛中的结肠组织,包埋在石蜡中,切成5μm切片,并进行苏木精-伊红(HE)染色,采用Image J软件进行图像分析,并评估结肠绒毛上皮和炎性细胞浸润情况。结肠杯状细胞经过碘酸希夫(PAS)染色后,采用光学显微镜在100×和200×下观察。统计含酸性黏液的杯状细胞。每组选取5张切片进行观察。
1.5、免疫荧光染色和实时荧光定量PCR
将5μm石蜡切片加热至60℃,15min脱蜡,用二甲苯清除,分别用梯度75%、95%和100%的乙醇和水处理,在柠檬酸缓冲液中蒸发30min进行抗原回收。采用I型胶原(TICP)和III型胶原(TIIICP)染色检测结肠纤维化程度。分析结肠上皮细胞各视野TICP和TIIICP阳性细胞数。LSM T-PMT激光共聚焦显微镜400×观察组织纤维化程度。
结肠组织纤维化增加导致紧密连接损伤,导致屏障功能障碍。通过实时荧光定量PCR检测紧密连接组织的主要成分:闭锁蛋白(Occludin)、闭合蛋白2(Claudin-2)、闭合蛋白4(Claudin-4)和闭锁小带蛋白1(ZO-1)基因表达。具体使用RNeasy Mini试剂盒提取结肠组织总RNA,然后利用cDNA Synthesis试剂盒,将高质量RNA转录为cDNA。使用SYBR PremixEx Taq II试剂通过ViiA7 RT-PCR系统检测基因表达。内参β-actin对mRNA丰度进行标准化,用2
1.6、酶联免疫吸附法
取结肠组织,用预冷PBS溶液冲洗,随后在新鲜的PBS溶液中匀浆,25℃,3,000g离心15min,制备匀浆液。酶联免疫吸附法试剂盒检测结肠中细胞因子,如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和白介素10(IL-10)水平。过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)活性和丙二醛(MDA)含量。所有操作均按照厂家说明书进行,使用酶标仪在特定波长下检测吸光度并换算含量。
1.7、结肠微生物组成分析
采用16s rDNA测序分析肠道菌群组成,生物信息学分析的步骤和检测工作由杭州谷禾生物科技公司完成,具体操作见公司服务网站。
2、结果分析
2.1、联合制剂对小鼠体重和结肠病理学的影响
与CK组相比,小鼠经枯草芽孢杆菌JZXJ-7和鱼油联合制剂(FO+JZXJ-7)灌胃14d后,体重显著增加(P<0.01),而单独补充枯草芽胞杆菌JZXJ-7(JZXJ-7)未见明显变化(P>0.05,见图1A-1C),联合制剂促进营养物质吸收。HE染色显示,与CK、FO和JZXJ-7组相比,灌胃FO+JZXJ-7的小鼠结肠形态显著改善,增加了结肠隐窝深度,从CK组的389.47μm增加到435.45μm(P<0.05),而单独补充FO或JZXJ-7的小鼠仅增加到395.35μm和404.53μm(P>0.05,见图1D、1E)。此外,联合制剂显著降低小鼠结肠病理学评分,增加杯状细胞数量(P<0.05),而FO组、JZXJ-7组与CK组无明显差异(P>0.05,见图1F、1G)。因此,鱼油和枯草芽孢杆菌JZXJ-7联合制剂具有促进营养物质吸收、改善结肠形态和增加结肠功能细胞的作用。
2.2、联合制剂对小鼠结肠屏障功能的影响
为了解鱼油和枯草芽孢杆菌JZXJ-7联合制剂对肠道屏障的保护作用,采用免疫荧光法检测结肠组织中器官纤维化标志物TICP和TIIICP蛋白表达,qRT-PCR法检测紧密连接蛋白occludin、claudin-2、claudin-4和ZO-1基因表达。TICP和TIIICP免疫染色结果显示,在CK组中,结肠组织中存在组织良好的肌动蛋白应力纤维,呈现强烈的绿光和红光,而膳食补充鱼油或枯草芽孢杆菌JZXJ-7的小鼠减弱了这一效应,尤其是在给予鱼油和枯草芽孢杆菌JZXJ-7(FO+JZXJ-7)小鼠中,表明联合制剂显著改善肠道纤维化程度(图2A)。与CK组相比,3个膳食补充组紧密连接蛋白occludin、claudin-2和claudin-4的mRNA表达均显著增加(P<0.05或P<0.01,图2B-2E),其中FO+JZXJ-7组极显著增加紧密连接蛋白基因表达,联合制剂的促进作用最强。
2.3、联合制剂对小鼠结肠氧化应激和炎症反应的影响
鱼油和枯草芽孢杆菌JZXJ-7对小鼠肠道氧化应激和炎症反应的保护作用显示,联合制剂(FO+JZXJ-7)极显著提高了结肠组织抗氧化酶,如CAT、SOD和T-AOC活性(P<0.01),而对小鼠结肠MDA水平无显著作用(图3A-3D)。与CK组相比,联合制剂显著降低结肠组织促炎细胞因子,如TNF-α、IL-1β和IL-6水平(P<0.05),并提高抗炎因子IL-10水平(P<0.05,图3E-3H),而单独补充鱼油(FO)或枯草芽胞杆菌JZXJ-7(JZXJ-7)未观察到抑制炎症的有益作用。因此,联合制剂可有效提高小鼠结肠的抗炎和抗氧化功能。
2.4、联合制剂对小鼠结肠肠道菌群的影响
为了探究肠道微生物群与联合制剂的有益功能的相关性,我们对结肠内容物进行16SrDNA测序分析。结果显示,CK组和FO+JZXJ-7组间Chao1指数相似(P>0.05),但FO+JZXJ-7组的Simpson指数明显低于CK组(P<0.05),Shannon指数显著高于CK组(P<0.05,图4A-4C),说明联合制剂提高了肠道菌群丰富度和多样性。利用PCoA法分析肠道微生物群落β多样性,结果显示PC1和PC2分别解释47.60和19.22%样本变异,CK组和FO+JZXJ-7组小鼠结肠微生物群组成呈现组内聚集,而组间显著分离(图4D),说明联合制剂显著改变了肠道菌群结构。物种分布显示,在门水平上,厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、变形菌门(Proteobacteria)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、去铁菌门(Deferribacteres)和放线菌门(Actinobacteria)是CK组和FO+JXJ-7组中丰度最高的细菌群落,其中厚壁菌门和拟杆菌门的物种丰度最高(图4E);在属水平,相对丰度较高的有Muribaculaceae、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Alistipes、Rosevuria、Alloprevotella、Prevotellaceae_UCG-001、Bacteroides、Clostridia_ug-014、Parasutterella和Colidextribacter。在CK组中,Muribaculaceae相对丰度最高(39.36%),其次为Lachnospiraceae_NK4A136(13.89%)。在FO+JZXJ-7组,Alloprevotella相对丰度最高29.98%,其次是Bacteroides(18.42%)(图4F),而Alistipes丰度显著降低(P<0.05,图4G)。CK组Clostridia_vadinBB60和Muribaculaceae的丰度高于FO+JZXJ-7组P<
0.05)。LEfSe分析表明,这些生物标志物属在CK组和FO+JZXJ-7组之间存在差异(图4H),与CK相比,FO+JZXJ-7组有9个属(拟杆菌属、粪杆菌属、双歧杆菌、腹真杆菌属、Coriobacteriaceae UCG-002和Erysipelatoclostridiaceae)显著丰度增加,其中短链脂肪酸相关菌属,拟杆菌属、粪杆菌属、双歧杆菌丰度极显著上升(P<0.01)。综上表明,膳食补充鱼油和枯草芽胞杆菌JZXJ-7联合制剂显著增加肠道菌群物种丰度,提高有益菌群比例。
显然,以上所述的具体实施方案,只是对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实例,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、同等替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
机译: 改善鱼油中N-3多不饱和脂肪酸含量的方法
机译: 减少动物死亡,肠道病原体中强毒表达以及细菌细胞中粘附素/凝集素pa-i表达,抑制肠道病原体中粘附素/凝集素pa-i表达,肠道诱导的粘附素活化的方法/凝集素pa-i,c4-hsl诱导的肠道病原体形态变化和哺乳动物肠道细菌细胞粘附,改善肠道发病机制,预防疾病或异常状况,皮肤和呼吸道感染,性传播疾病,消化道疾病,动物泌乳能力的丧失以及哺乳期动物中微生物介导的上皮疾病的发展,至少一部分尿路的冲洗以及用于监测聚乙二醇(peg)的给药动物,组合物药物,用于预防或治疗肠源性败血症并监测多乙
机译: 提高甘油酯中n-3多不饱和脂肪酸富集效率的方法