一种银杏bZIP类转录因子GbbZIP08在促进植物类黄酮合成中的应用方法

摘要

本发明公开了一种银杏bZIP类转录因子GbbZIP08在促进植物类黄酮合成中的应用方法，属于植物分子基因工程技术领域，本发明从银杏中分离得到了编码GbbZIP08转录因子的完整cDNA，连接到植物过表达载体上，利用农杆菌介导转化植物，通过烟草瞬时表达证明了GbbZIP08定位于植物细胞核；分别利用花序侵染法和叶盘转化法获得了转基因拟南芥和转基因烟草，结果表明过表达GbbZIP08能够提高植株中类黄酮物质的积累。本发明为bZIP转录因子促进植物类黄酮合成的研究提供了一定的研究基础和基因资源。

说明书

技术领域

本发明属于植物分子基因工程技术领域，具体涉及一种银杏bZIP类转录因子GbbZIP08在促进植物类黄酮合成中的应用方法。

背景技术

银杏(Ginkgo biloba L.)为银杏科银杏属落叶乔木，是地球上最古老的孑遗植物，也是我国特有的药用植物资源。银杏叶提取物中的主要活性成分有类黄酮、萜内酯、长链酚类、原花色素、酚酸等化合物。其中，类黄酮在银杏叶提取物EGB中的含量在国际上被统一规定为24％，其具有增强免疫力、抗癌活性和抗衰老活性等作用，在预防和治疗心脑血管疾病等方面具有重要疗效。然而，多数银杏品种中的类黄酮含量极低，该因素已成为深入研究与开发银杏叶制剂的重要障碍。当前，利用基因工程技术针对次生代谢产物的关键调控因子进行遗传改良，对于提高银杏类黄酮的含量具有重要意义，目前未见关于银杏bZIP转录因子调控类黄酮代谢的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种银杏bZIP类转录因子GbbZIP08在促进植物类黄酮合成中的应用方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种银杏bZIP类转录因子GbbZIP08在促进植物类黄酮合成中的应用方法，包括如下步骤：

步骤1：通过PCR扩增从银杏中克隆了GbbZIP08的基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示，经翻译得到其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

SEQ ID NO.1：

Atggcttttggagatctcagaggagaacttaaaatgcagcccaatgatacctcaacttccgtacaacagcagtctagcggcgagaaaacgtccagttctggtgacccacttgatgagatgaacaaatatgtgaatgagagtgatgatgatatccgtagagtaccagagatggtaaaccagttaggctcttctagtaattctgttgctgttaagatggagagccaacaggctactggtacttctaatcaaaggaaaagaggcagaacacctgcagacaaagaacataaacgtctgaaaagattgctgaggaatagagtatctgctcaacaagcaagggagaggaagaaggcttacttgagtgagcttgagacaaaggccaaagagtatgagcagaagaactctgagttggaagagaaagtttctactttgcagaatgaaaatttcatgcttagacaggtaccttaa

SEQ ID NO.2：

MAFGDLRGELKMQPNDTSTSVQQQSSGEKTSSSGDPLDEMNKYVNESDDDIRRVPEMVNQLGSSSNSVAVKMESQQATGTSNQRKRGRTPADKEHKRLKRLLRNRVSAQQARERKKAYLSELETKAKEYEQKNSELEEKVSTLQNENFMLRQVP

步骤2：将步骤1中克隆到的基因序列进行一代测序获得GbbZIP08基因的碱基序列，进行后续基因序列分析和表达载体构建引物设计；

步骤3：通过Nimble cloning方法将克隆得到的GbbZIP08构建到pNC-Cam1304-SubC植物亚细胞定位载体和pNC-Cam2304-MCS35S植物过表达载体上；

步骤4：将步骤3构建的pNC-Cam1304-SubC-GbbZIP08表达载体转化农杆菌GV3101，用于烟草瞬时转化，观察GbbZIP08在植物中的亚细胞定位，以空载体做为对照；

步骤5：将步骤3中的pNC-Cam2304-MCS35S-GbbZIP08表达载体转化农杆菌，采用拟南芥花序侵染法转入拟南芥，采用烟草叶盘转化法转入烟草；

步骤6：采用抗性筛选获得转基因拟南芥纯合子，通过植物组培方法获得转基因烟草再生体系；使用阳性PCR、GUS染色和qRT-PCR方法验证转基因植株；

步骤7：对步骤6获得的转基因植株和野生型植株进行类黄酮含量检测，分析过表达GbbZIP08在植物中对类黄酮合成的影响。

本发明相比现有技术具有以下优点：

本发明从银杏中分离得到了编码GbbZIP08转录因子的完整cDNA，连接到植物过表达载体上，利用农杆菌介导转化植物，通过烟草瞬时表达证明了GbbZIP08定位于植物细胞核；分别利用花序侵染法和叶盘转化法获得了转基因拟南芥和转基因烟草，结果表明过表达GbbZIP08能够提高植株中类黄酮物质的积累。本发明为bZIP转录因子促进植物类黄酮合成的研究提供了一定的研究基础和基因资源。

附图说明

图1为银杏8个组织中bZIP基因的FPKM值和总黄酮含量的相关性分析热图；

图2为GbbZIP08氨基酸序列的系统进化树分析结果图；

图3为pNC-Cam1304-SubC-pNC-GbbZIP08植物亚细胞定位载体和Cam2304MCS-35S-GbbZIP08过表达载体示意图；

图4为GbbZIP08的亚细胞定位结果图；

图5为转基因拟南芥纯合子筛选图；

图6为烟草遗传转化体系获得图；

图7为转基因植株阳性PCR鉴定结果图；

图8为转基因植株GUS染色图；

图9为转基因植株GbbZIP08定量分析结果图；

图10为转基因植株总黄酮含量分析结果图；

图11为转基因植株中山奈酚含量分析结果图；

图12为转基因植株花青素含量分析结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

一种银杏bZIP类转录因子GbbZIP08在促进植物类黄酮合成中的应用方法，包括如下步骤：

(1)银杏bZIP基因家族的筛选与鉴定：

基于银杏基因组数据库，利用本地blast从中筛选得到40条GbbZIP基因；结合银杏8个组织的转录组数据和类黄酮含量的相关性分析；

发现GbbZIP08基因和银杏类黄酮含量存在高度的正相关性(图1)；

进化树分析显示GbbZIP08是拟南芥类AtbZIP56的同源基因(图2)；

(2)银杏中GbbZIP08基因序列获得：

取新鲜的银杏叶置于液氮预冷的研钵中进行研磨，根据RNA提取试剂盒(TaKaRa)说明书提取植物RNA，提取完成后使用凝胶电泳检测RNA完整性，NanoDrop仪器检测RNA浓度，经检测合格的RNA样品使用RNA反转录试剂盒(Vazyme)进行反转录，根据产品说明书合成cDNA；

根据银杏基因组中GbbZIP08的CDs序列设计克隆引物(U：ATGGCTTTTGGAGATCTCAG；D：TTAAGGTACCTGTCTAAGCATG)；

通过PCR扩增目的基因，纯化回收，使用TA克隆将目的基因连到T载体上，转化至大肠杆菌感受态，挑取单克隆用M13引物进行菌液PCR验证，将阳性克隆菌液一部分用50％甘油保存备用，一部分送至上海生工生物公司测序获得基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

(3)银杏中GbbZIP08表达载体构建：

设计载体构建引物(U：AGTGGTCTCTGTCCAGTCCTATGGCTTTTGGAGATCTCAG；D：GGTCTCAGCAGACCACAAGTTTAAGGTACCTGTCTAAGCATG)，将质粒菌液活化后参照质粒提取试剂盒说明提取质粒，采用SfiI限制性内切酶分别对植物亚细胞定位载体pNC-Cam1304-SubC和植物过表达载体pNC-Cam2304-MCS35S(图3)进行酶切，酶切产物纯化后用于后续的载体构建；

使用Nimble cloning试剂盒构建重组表达载体，转化至大肠杆菌感受态，挑取单克隆用检测引物进行菌液PCR验证，液将阳性克隆菌液活化，提取重组质粒，使用电转化法将重组质粒转入农杆菌GV3101；

(4)GbbZIP08在烟草中的亚细胞定位：

将含有重组载体的GV3101农杆菌活化两次，培养至OD600值为0.6～0.8，室温5000rpm离心，去上清液，菌体用MES缓冲液重悬浮，调整OD600值至0.6，用1mL注射器吸取菌液从烟草叶片背面注射，并做好标记，注射完成后将烟草置于黑暗中培养12h，随后转入光照培养箱培养3～5天，撕取注射区的叶片下表皮，于激光共聚焦显微镜下观察荧光并拍照，以转空载体的烟草叶片作为对照；

观察发现，在转空载体的烟草叶片中，细胞核被DAPI染料染成蓝色，但是没有观察到绿色荧光，而在转入35S::GbbZIP08-GFP融合表达载体的烟草表皮细胞中观察到了绿色荧光(图4)，且该绿色荧光与DAPI蓝色荧光重叠，由此得出结论GbbZIP08定位于细胞核；

(5)GbbZIP08转化拟南芥：

选用盛花期的拟南芥植株进行侵染，转化前一天浇透水，修剪已有的果荚；将含有重组载体的GV3101农杆菌侵染液(OD600为0.8)倒入一个开口大的器皿，把拟南芥花序完全浸泡在侵染液中约1min，用塑料袋套上保湿，置于黑暗中培养12h，随后转入光照培养箱，一周后重复侵染一次，侵染后的植株置于植物光照培养箱培养至种子成熟，收获T0代种子；

将T0代种子消毒后，均匀铺撒在含相应抗生素的MS固体平板中进行培养，生长10d左右，将子叶和根生长正常的幼苗移栽至植物光照培养箱中培养；幼苗成熟后，取嫩叶粗提DNA，用载体检测引物进行阳性PCR验证，检测为阳性的植株继续培养至种子成熟并分株收集T1代种子；

将T1代种子消毒后用带抗性的MS固体培养基进一步筛选，挑选阳性比例为3:1的株系(图5)进行移栽，继续培养至种子成熟，分株收集T2代种子；

将T2代种子用相同方式继续筛选，此时在抗性平板中全部存活的幼苗即可认为是纯合子，继续培养至成熟植株，即可获得T3代转基因拟南芥纯合子；

图5中：A-D分别表示野生型、T0代、T1代和T2代转基因拟南芥；

(6)GbbZIP08转化烟草：

在超净台中将无菌烟草叶片切成1cm×1cm的正方形，置于含有过表达载体的GV3101农杆菌侵染液(OD600值为0.8)中10～15min，期间间断摇晃使重悬液完全浸泡叶片；侵染后将叶片用无菌滤纸吸干表面液体，叶片背面朝下转入共培养基，于28℃黑暗培养48h；

随后将外植体转入分化培养基以诱导愈伤和生芽(图6)，待分化的不定芽形成苗体，切取苗体并转移至生根培养基以诱导生根，待植株生长稳定，把烟草从组培瓶中取出，洗净其根部残留的培养基，移栽至营养基质土，置于植物光照培养箱中培养；

(7)转基因植株验证：

取转基因植株1～2片嫩叶于1.5mL离心管中，做好标记，用植物组织磨样机研磨叶片至匀浆状，使用植物DNA粗提法提取植株的基因组DNA；

用载体构建所使用的的检测引物进行阳性PCR验证转基因植株，以野生型植株DNA作为阴性对照，以含有重组表达载体的大肠杆菌菌液作为阳性对照，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，发现转基因植株扩增得到的目的条带与菌液PCR的长度一致，而野生型植株中没有扩增出目的条带(图7)，表明GbbZIP08过表达载体成功转入了拟南芥和烟草中；

图7中：P为菌液PCR阳性对照；C为野生型植株阴性对照；M为2000bp marker；

取野生型和转基因植株叶片，置于1.5mL离心管并做好标记，加入现配的GUS染液浸没叶片，用锡箔纸包裹避光，放入37℃恒温培养箱中孵育过夜，染色完成后，将叶片转入75％酒精中浸泡16h脱色，后更换成95％酒精继续脱色，每天更换一次酒精，直至叶片完全变成白色透明，将脱色完成的叶片置于体式显微镜下观察并记录，发现转基因植株叶片被染成蓝色，而野生型植株叶片没有被染色(图8)，表明GbbZIP08表达载体在转基因植株中成功表达；

图8中：A为野生型拟南芥；B为转基因拟南芥；C为野生型烟草；D为转基因烟草；

取野生型和转基因植株叶片，参考植物RNA提取试剂盒提取植物的RNA，反转录成cDNA，使用目的基因定量引物(U：GTCCAGTTCTGGTGACCCAC；D：GCCTGTTGGCTCTCCATCTT)，以cDNA为模板对目的基因进行荧光定量PCR检测，以野生型植株为对照，每个样本设置3个生物学重复；

拟南芥内参基因为AtUBQ(NM_178970)，烟草内参基因为NbGADPH(Niben101Scf05177g02025.1)，定量结果采用2

GbbZIP08在转基因植株中的表达水平显著高于野生型(图9)，表明GbbZIP08在转基因植株中成功过表达；

(8)转基因植株黄酮含量分析：

将野生型和转基因植株叶片用液氮研磨，冻干机干燥，过40目筛，天平称取干燥样品0.02g于离心管中，向其中加入2mL 75％乙醇，60℃振荡提取2h，室温10000×g离心10min，取上清液分别加入试剂盒中相关试剂进行反应，取反应液用酶标仪测定510nm处的吸光值，计算样品中类黄酮的含量，结果如图10所示:；

称取冻干样品0.1g，加入2mL 75％甲醇，超声破碎30min，室温10000×g离心10min，取上清液500μL，加入36％盐酸500μL，85℃水浴1h，自然冷却至室温后，经45μm有机滤膜过滤，即可用于高效液相色谱(HPLC)检测；

本实验使用的HPLC条件：色谱柱型号为Hypersil GOLD C18(4.6mm×250mm，5μm)，进样量为20μL，流动相A：100％乙腈，流动相B：2％乙酸，柱温：30℃，流速1.0mL/min，洗脱程序为：0～14min时85％ B→67.5％ B，14～23min时67.5％ B→10％ B，23～24min时10％ B→85％ B，24～28min，85％ B；

以320nm检测波长检测山奈酚含量，结果如图11所示；

图11中：A-C分别为山奈酚标样、拟南芥和烟草提取物在320nm处的色谱图；

将植物样品用液氮研磨，冻干机干燥，过40目筛，天平称取冻干样品粉末0.1g，加入4mL甲醇(含1％盐酸，体积比)，室温超声1h，用锡箔纸将样品包裹避光，置于摇床120rpm，4h，5000rpm离心10min，取500μL上清液，加入500μL蒸馏水振荡混匀，随后加入500μL氯仿振荡混匀以去除叶绿素，吸取上层水相，用酶标仪测定530nm处的吸光值；

以公式10×(A530)/g(DW)来计算花青素含量，结果如图12所示；

经过以上检测分析发现，过表达GbbZIP08能够显著提高转基因拟南芥和烟草中的总黄酮，山奈酚和花青素含量，表明GbbZIP08能够促进植物类黄酮的生物合成。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。