一种缓解哮喘急性发作的中药组合物及其验证方法

摘要

本发明涉及中药领域，尤其涉及一种缓解哮喘急性发作的中药组合物及其验证方法，包括中药组合物由以下原料组成：麻黄9重量份、杏仁9重量份、甘草6重量份、石膏18重量份、地龙10重量份，通过麻杏石甘汤联合地龙可以有效缓解哮喘急性发作，其可以成为临床上治疗哮喘的良药，进而减少激素类药物的使用，有益于患者的健康；明确了麻杏石甘汤加地龙通过HIF1信号路径调控Th2细胞缓解哮喘急性发作的机理，可为经典方加味的临床应用提供科学依据，更好地造福哮喘患者。

说明书

技术领域

本发明涉及中药领域，尤其涉及一种缓解哮喘急性发作的中药组合物及其验证方法。

背景技术

支气管哮喘(Bronchial Asthma，BA)，简称哮喘，是一种常见的呼吸系统疾病。2019年中国成人肺部健康研究报告指出我国目前有4570万成人患有哮喘，患病率高达4.2％。哮喘是由多种细胞(嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞)和细胞组分参与的气道慢性炎症疾病。这种慢性炎症与气道高反应性相关，常导致反复发作的喘息、气促、咳嗽和胸闷。喘息、气促、咳嗽、胸闷等症状突然发生，或原有症状急剧加重，伴有呼吸困难，以呼气流量降低为特征的阶段，称为哮喘急性发作期。哮喘急性发作常因接触变应原、刺激物或呼吸道感染诱发。其轻重程度不一，可在数小时或数天内出现，也可在数分钟内危及生命。哮喘危及生命主要包括以下途径：①体内水、电解质和酸碱失衡；②缓解药物使用不当，严重缺氧时诱发致命性心律失常；③气道处于在高敏状态时受到外界刺激，引起严重的喉、气管水肿和广泛支气管痉挛，使气管阻塞窒息；④在机制未明的情况下突然暴发发作，来不及用药而导致死亡。哮喘急性发作不仅严重影响患者身体健康，甚至危及患者生命，如何良好的控制哮喘，减少意外发生是一个重要的临床问题。

现有技术中治疗哮喘往往都是使用激素类的药物，众所周知，激素类药物对人体副作用大且多，所以亟待一种缓解哮喘急性发作的中药来替代激素类药物。

支气管哮喘属中医“哮证”、“喘证”范畴，中医分型一般分急性发作期与缓解期，急性发作期分热哮、冷哮等证型。临床流行病学方法调查研究发现支气管哮喘发作期以热哮为主。患者常因外感风、热之邪而发病：因“风”致“痉”，气道痉挛，气流受阻而发生哮鸣喘息之症；风热引动伏痰阻于痉挛的气道，而宿痰伏肺致肺络不通、血瘀阻滞。故热哮以痰鸣气喘、口唇紫绀、胸闷气短，舌质红，苔黄或薄黄，脉滑数等为主要表现。四诊合参，辨证论治，热哮以清热化痰、息风止痉、通络平喘为主要治则。麻杏石甘汤出自汉代医圣张仲景的《伤寒论》，是治疗热哮的经典方，其治疗支气管哮喘的临床疗效确切。麻杏石甘汤由麻黄、杏仁、炙甘草、石膏4味药组成，具有辛凉宣肺、清热平喘的功效。麻黄合石膏共为君药，杏仁降利肺气而平喘，为臣药；炙甘草益气和中，为使药。然麻杏石甘汤息风止痉、通络之功稍逊，有医家认为治疗哮喘非一般草木祛痰药能达，当有虫类剔凝瘀、通络脉、起沉疴，热痰较重者多用地龙。缘地龙性寒，善走串引诸药直达病所，能息风止痉、清热平喘、通络除痹，常用于肺热咳喘之证，是治疗高热惊厥、支气管哮喘的典型药物。地龙可能通过抑制炎性细胞的浸润、减缓气道上皮下纤维化以及减少黏液高分泌等过程，从而抑制甚至逆转哮喘导致的气道重塑进程。麻杏石甘汤联合地龙，是中医经典方剂的加味，也是经典传承的实践和创新，协同增效，共奏宣肺化痰、清热平喘之效，此应用使哮喘急性发作患者热去痰消、喘平息安。所以麻杏石甘汤联合地龙可以有效缓解哮喘急性发作，其可以成为临床上治疗哮喘的良药，进而减少激素类药物的使用，有益于患者的健康。

哮喘急性发作给患者带来极大的身体和心理负担，严重者可危及生命，及时有效缓解哮喘急性发作将挽救患者生命，大大提高哮喘患者的生活质量。麻杏石甘汤联合地龙是中医治疗哮喘急性发作的良药，但具体的治疗机理尚不明确。明确麻杏石甘汤联合地龙缓解哮喘急性发作的机理，可为经典方加味的临床应用提供科学依据，更好地造福哮喘患者，所以亟待一种麻杏石甘汤联合地龙可以缓解哮喘急性发作的验证方法。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种缓解哮喘急性发作的中药组合物及其验证方法，解决了现有技术存在的问题，通过麻杏石甘汤联合地龙可以有效缓解哮喘急性发作，其可以成为临床上治疗哮喘的良药，进而减少激素类药物的使用，有益于患者的健康；另外也验证了麻杏石甘汤联合地龙缓解哮喘急性发作的机理，为经典方加味的临床应用提供科学依据，更好地造福哮喘患者。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种缓解哮喘急性发作的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由以下原料组成：麻黄9重量份、杏仁9重量份、甘草6重量份、石膏18重量份、地龙10重量份。

优选的，一种缓解哮喘急性发作的中药组合物的验证方法，其针对权利要求1中所述的中药组合物，其特征在于，包括以下步骤：

S1、筛选能与麻杏石甘汤起协同增效作用治疗哮喘急性发作的虫类药物；

S2、研究麻杏石甘汤联合地龙缓解哮喘急性发作与Th2细胞及其调控分子、分泌分子的相关性；

S3、研究麻杏石甘汤联合地龙通过抑制Th2细胞缓解哮喘急性发作；

S4、研究麻杏石甘汤联合地龙通过HIF1抑制Th2细胞缓解哮喘急性发作。

优选的，S1步骤具体包括如下步骤：

a、筛选虫类药物：从中药的性味归经、功效中筛选麻杏石甘汤的加味药物，具有息风止痉通络的虫类药物有地龙、僵蚕、全蝎、蜈蚣；

b、构建动物模型；

c、动物模型验证。

优选的，S2步骤具体包括如下步骤：

a、确定研究对象及其临床特征；

b、麻杏石甘汤联合地龙汤剂的制备；

c、分析麻杏石甘汤联合地龙对哮喘急性发作的有效性；

d、分析麻杏石甘汤联合地龙与Th2细胞及其调控分子、分泌分子的相关性。

优选的，S3步骤具体包括如下步骤：

a、构建动物模型；

b、分析CD4+T细胞、Th2细胞、Ⅱ型细胞相关因子对哮喘急性发作的影响；

c、分析麻杏石甘汤联合地龙通过抑制Th2细胞缓解哮喘急性发作。

优选的，S4步骤具体包括如下步骤：

a、构建细胞模型；

b、分析麻杏石甘汤联合地龙通过HIF1对Th2细胞的影响；

c、分析麻杏石甘汤联合地龙通过HIF1抑制Th2细胞缓解哮喘急性发作。

(三)有益效果

1.本发明通过麻杏石甘汤联合地龙可以有效缓解哮喘急性发作，其可以成为临床上治疗哮喘的良药，进而减少激素类药物的使用，有益于患者的健康；

2.本发明明确了麻杏石甘汤加地龙通过HIF1信号路径调控Th2细胞缓解哮喘急性发作的机理，可为经典方加味的临床应用提供科学依据，更好地造福哮喘患者；

3.本发明研究技术创新：前期通过OVA致敏+激发，成功构建了哮喘动物模型；同时还进行了CD4+T细胞制备技术体系的构建；哮喘动物模型和CD4+T细胞制备技术体系的构建为本项目的顺利完成提供了技术支撑。

附图说明

图1为本发明的维恩图。

图2为本发明GO-BP(生物学过程)功能富集分析图。

图3为本发明GO-CC(细胞组件)功能富集分析图。

图4为本发明GO-MF(分子功能)功能富集分析。

图5为本发明KEGG通路重叠基因富集分析。

图6为本发明将124个重叠基因的编码蛋白在STRING数据库中进行互作分析后建立PPI网络。

图7为本发明的中药组合物-靶点-途径网络图。

图8为本发明的GSE137268和GSE148004样本的主成分分析图。

图9为本发明的消除批量效应后的主成分分析图。

图10为本发明分析数据集中对照样本和哮喘样本22种免疫细胞的比例图。

图11为本发明对照组和哮喘组免疫细胞比例的差异图。

图12为本发明哮喘患者和健康人群的Th2细胞分泌炎性因子IL-4、IL-5、IL-13、IL-6、IL-10的对比图。

图13为本发明HDM模型组小鼠造模过程图。

图14为本发明NS小鼠和HDM模型小鼠的肺泡灌洗液中的炎性细胞和嗜酸性粒细胞数量对比图。

图15为本发明aPCR检测NS小鼠和HDM模型小鼠的肺部组织切片中的炎性介质IL-4的mRNA水平对比图。

图16为本发明aPCR检测NS小鼠和HDM模型小鼠的肺部组织切片中的炎性介质IL-5的mRNA水平对比图。

图17为本发明aPCR检测NS小鼠和HDM模型小鼠的肺部组织切片中的炎性介质IL-13的mRNA水平对比图。

图18为本发明aPCR检测NS小鼠和HDM模型小鼠的肺部组织切片中的炎性介质1L-25的mRNA水平对比图。

图19为本发明HDM模型小鼠支气管肺组织周围有明显炎症浸润和粘液高分泌图。

图20为本发明磁珠分离法从C57BL/6J小鼠和HDM模型小鼠脾脏中分离CD4+T细胞的过程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图1-20对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

关于一种缓解哮喘急性发作的中药组合物的制备方法的实施例如下：

实施例1

S1：将9g的麻黄加入盛有1400ml饮用水的煎药壶中，用武火煮沸，边煮边去除浮沫，煮至剩1000ml；

S2：将9g的杏仁、6g的甘草、18g的石膏、10g的地龙加入S1中的煎药壶中煎煮，直至浓缩成400ml的浓缩液；

S3：关火，取出S2步骤中的浓缩液，待冷却后即可饮用。

实施例2

S1：将18g的麻黄加入盛有2800ml饮用水的煎药壶中，用武火煮沸，边煮边去除浮沫，煮至剩2000ml；

S2：将18g的杏仁、12g的甘草、36g的石膏、20g的地龙加入S1中的煎药壶中煎煮，直至浓缩成800ml的浓缩液；

S3：关火，取出S2步骤中的浓缩液，待冷却后即可饮用。

实施例3

S1：将27g的麻黄加入盛有4200ml饮用水的煎药壶中，用武火煮沸，边煮边去除浮沫，煮至剩3000ml；

S2：将27g的杏仁、18g的甘草、54g的石膏、30g的地龙加入S1中的煎药壶中煎煮，直至浓缩成1200ml的浓缩液；

S3：关火，取出S2步骤中的浓缩液，待冷却后即可饮用。

关于麻杏石甘汤加地龙可以缓解哮喘急性发作的验证方法：

一、方案：

(1)筛选能与麻杏石甘汤起协同增效作用治疗哮喘急性发作的虫类药物A、筛选虫类药物

从中药的性味归经、功效中筛选麻杏石甘汤的加味药物，具有息风止痉通络的虫类药物有地龙、僵蚕、全蝎、蜈蚣。四味药物的比较见下图。

以上四味均具有息风止痉的功效，但根据中医疗热以寒的治疗原则，四味药中只有地龙的性味咸、寒，有清热之功效；此外地龙能兼顾通络平喘，符合热哮的治疗原则。

B.构建动物模型

动物伦理已获浙江中医药大学实验动物管理与伦理委员会批准。

①C57BL/6小鼠：雄/雌性小鼠各20只，体重15-20g，5-7周龄，购买自斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号[SCXK(京)2016-0002]；

②通过HDM致敏+激发构建哮喘动物模型：在第0天和第10天，用20μg/30ml屋尘螨工作液(由高温高压灭菌生理盐水配置)滴鼻激发哮喘；紫绀、频繁抓口/鼻/四肢和弓背直立等症状出现则激发成功；

C.动物模型验证

①以正常的C57BL/6小鼠为对照，以C57BL/6哮喘小鼠为试验；予麻杏石甘汤+地龙、麻杏石甘汤+僵蚕、麻杏石甘汤+全蝎、麻杏石甘汤+蜈蚣干预；

②药物制备：麻杏石甘汤联合地龙：麻黄9g、杏仁9g、甘草6g、石膏18g，地龙10g，以上5味，沿用经典煎煮方法，先将麻黄加入1400ml的饮用水用武火煮沸去除浮沫至1000ml，加入剩余4味药煎煮浓缩成400ml。其余各给药组药物制备方法同上述麻杏石甘汤联合地龙，其余虫类药物剂量为僵蚕10g，全蝎6g，蜈蚣5g。

③分组：C57BL/6小鼠+麻杏石甘汤+地龙，C57BL/6哮喘小鼠+麻杏石甘汤+地龙，C57BL/6小鼠+麻杏石甘汤+僵蚕，C57BL/6哮喘小鼠+麻杏石甘汤+僵蚕，C57BL/6小鼠+麻杏石甘汤+全蝎，C57BL/6哮喘小鼠+麻杏石甘汤+全蝎，C57BL/6小鼠+麻杏石甘汤+蜈蚣，C57BL/6哮喘小鼠+麻杏石甘汤+蜈蚣；

④干预方法:以60kg成人每日服用药物剂量与小鼠体重换算比值换算出小鼠1d用量。麻杏石甘汤联合地龙给药组按30.03ml/kg剂量灌胃，2次/d，其余各给药组剂量同麻杏石甘汤联合地龙组。

⑤分析并验证麻杏石甘汤联合4类虫类药物的有效性。

(2)研究麻杏石甘汤联合地龙缓解哮喘急性发作与Th2细胞及其调控分子、分泌分子的相关性

A.确定研究对象及其临床特征

①人体伦理已获医院医学伦理委员会批准，批件号2021030-A。

②研究对象样本：90例支气管哮喘急性发作患者。诊断标准：西医：中华医学会呼吸病学分会哮喘组更新的最新支气管哮喘防治指南(2016版)的诊断标准：a.喘息、气急、胸闷或咳嗽等症状突然发生或症状加重；b.双肺可闻及散在或弥漫性哮鸣音，呼气相延长；c.上述症状或体征在数小时或数天内出现；d.伴有呼气流量受限：支气管舒张试验阳性，平均每日PEF昼夜变异率>10％或PEF周昼夜变异率>20％。中医：热哮的诊断标准：a.气粗息涌，咳呛阵作，喉中哮鸣，胸高胁胀，烦闷不安；b.汗出口渴喜饮，面赤口苦，咳痰色黄或白，黏浊稠厚，咳吐不利，不恶寒；c.舌质红，苔黄腻，脉滑数或弦滑。③纳入标准：同时符合上述西医诊断标准及中医热哮的诊断标准；年龄18岁-60岁，性别不限；同意参加本研究，理解并签署知情同意书。

④排除标准：a.支气管哮喘病情危重患者；b.合并COPD、支气管扩张、肺结核、肺纤维化等原发肺部疾病者；c.合并心脑血管、肝、肾、造血系统等严重原发性疾病者；d.合并精神疾患者；e.妊娠及哺乳期妇女；f.过敏体质或对多种药物过敏者；g.依从性差，沟通存在障碍的患者。

⑤问卷调查基本信息：姓名，年龄，性别，饮食及生活习惯、民族、地域等。⑥采集治疗前样本：静脉采血法获取外周血20ml；分离血清和血细胞，各分4份，保存于-80℃冰箱，1月内使用。

B.麻杏石甘汤联合地龙汤剂的制备

麻杏石甘汤联合地龙：麻黄9g、杏仁9g、甘草6g、石膏18g，地龙10g，以上5味，沿用经典煎煮方法，先将麻黄加入1400ml的饮用水用武火煮沸去除浮沫至1000ml，加入剩余4味药煎煮浓缩成400ml，每次200ml，早晚分服。急性发作时立即服用。

C.分析麻杏石甘汤联合地龙对哮喘急性发作的有效性

药效学研究：以30名地塞米松治疗患者为对照组，以30名麻杏石甘汤联合地龙治疗患者以及30名地塞米松+麻杏石甘汤联合地龙治疗患者为试验组；在患者哮喘急性发作时分别使用地塞米松、麻杏石甘汤联合地龙、地塞米松+麻杏石甘汤联合地龙治疗，随后评估哮喘急性发作相关症状体征缓解情况；分析麻杏石甘汤联合地龙治疗哮喘急性发作的有效性。备注：哮喘急性发作相关症状体征包括：喘息、气急、胸闷或咳嗽；双肺闻及散在或弥漫性哮鸣音，呼气相延长。

D.分析麻杏石甘汤联合地龙与Th2细胞及其调控分子、分泌分子的相关性

①获取30名经麻杏石甘汤联合地龙治疗的患者的外周血20ml，分离血清和血细胞，各分4份，保存于-80℃冰箱，1月内使用。

②利用获取的未治疗患者的外周血，流式双标法检测Th2细胞数量，qPCR法和WesternBlot法检测患者外周血中Ⅱ型细胞相关因子和HIF1的表达情况。③利用获取的经麻杏石甘汤联合地龙治疗患者的外周血，流式细胞术检测Th2细胞数量，WesternBlot法和qPCR法检测患者外周血中Ⅱ型细胞相关因子和HIF1的表达情况。

④比较麻杏石甘汤联合地龙治疗前后Th2细胞数量，Ⅱ型细胞相关因子和HIF1的表达水平的差异，分析麻杏石甘汤联合地龙与Th2细胞及其调控分子和分泌分子的相关性。

备注：Ⅱ型细胞相关因子主要包括：IL-4、IL-5、IL-13、IL-6、IL-10等。

(3)研究麻杏石甘汤联合地龙通过抑制Th2细胞缓解哮喘急性发作

A.构建动物模型

C57BL/6小鼠：雄/雌性小鼠各20只，体重15-20g，5-7周龄，购买自斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号[SCXK(京)2016-0002]。构建方法如上述。

B.分析CD4+T细胞、Th2细胞、Ⅱ型细胞相关因子对哮喘急性发作的影响

以正常的C57BL/6小鼠为对照，以C57BL/6哮喘小鼠为试验，获取2组小鼠的肺泡灌洗液、肺组织切片、和外周血，保存于-80℃冰箱，保存期限1月；采用WesternBlot法和qPCR法检测小鼠肺泡灌洗液、肺组织切片、和外周血中的CD4+T细胞数量、Th2细胞数量及分泌功能，Ⅱ型细胞相关因子的表达；分析CD4+T细胞、Th2细胞、Ⅱ型细胞相关因子在哮喘急性发作中的作用。

C.分析麻杏石甘汤联合地龙通过抑制Th2细胞缓解哮喘急性发作

①以正常的C57BL/6小鼠为对照，以C57BL/6哮喘小鼠为试验，予生理盐水、地塞米松、麻杏石甘汤联合地龙、地塞米松+麻杏石甘汤联合地龙干预。②分组：a.C57BL/6小鼠+生理盐水；b.C57BL/6小鼠+地塞米松；c.C57BL/6小鼠+麻杏石甘汤联合地龙；d.C57BL/6小鼠+地塞米松+麻杏石甘汤联合地龙；e.C57BL/6哮喘小鼠+生理盐水；f.C57BL/6哮喘小鼠+地塞米松；g.C57BL/6哮喘小鼠+麻杏石甘汤联合地龙；h.C57BL/6哮喘小鼠+地塞米松+麻杏石甘汤联合地龙。

③干预方法：以60kg成人每日服用药物剂量与小鼠体重换算比值换算出小鼠1d用量。麻杏石甘汤联合地龙按30.03ml/kg剂量灌胃，2次/d；地塞米松按5mg/kg剂量腹腔注射，2次/d。空白小鼠接受等剂量30.03ml/kg生理盐水灌胃，2次/d。

④观察C57BL/6哮喘小鼠干预前的症状，及干预后的症状，与生理盐水和地塞米松组对比，分析麻杏石甘汤联合地龙对症状的缓解效果。

⑤获取以上8组小鼠的肺泡灌洗液、肺组织切片、和外周血，保存于-80℃冰箱，保存期限1月；采用WesternBlot法和qPCR法检测小鼠肺泡灌洗液、肺组织切片、和外周血中的CD4+T细胞、Th2细胞数量，Ⅱ型细胞相关因子的表达；分析麻杏石甘汤联合地龙是否通过抑制CD4+T细胞缓解哮喘急性发作。

(4)研究麻杏石甘汤联合地龙通过HIF1抑制Th2细胞缓解哮喘急性发作

A.构建细胞模型

①分离C57BL/6小鼠和C57BL/6哮喘小鼠的CD4+T细胞。

②构建HIF1敲除、过表达的质粒载体；采用慢病毒转染法将构建的2个质粒载体与空白质粒载体分别转染至CD4+T细胞。

B.分析麻杏石甘汤联合地龙通过HIF1对Th2细胞的影响

以HIF1高表达、正常表达、低表达的CD4+T细胞正常培养为对照，以使用麻杏石甘汤联合地龙培养为对照，WesternBlot法和qPCR法检测培养液中Th2细胞的数量、Ⅱ型细胞相关因子的表达；分析HIF1对CD4+T细胞、Th2细胞功能的影响；分析麻杏石甘汤联合地龙通过HIF1抑制CD4+T细胞功能。

C.分析麻杏石甘汤联合地龙通过HIF1抑制Th2细胞缓解哮喘急性发作

①将构建的HIF1高表达、正常表达、低表达的CD4+T细胞模型移植至C57BL/6小鼠模型中，予生理盐水或麻杏石甘汤联合地龙干预。

②分组：a.HIF1高表达的C57BL/6小鼠+生理盐水；b.HIF1高表达的C57BL/6小鼠+麻杏石甘汤联合地龙；c.HIF1正常表达的C57BL/6小鼠+生理盐水；d.HIF1正常表达的C57BL/6小鼠+麻杏石甘汤联合地龙；e.HIF1低表达的C57BL/6小鼠+生理盐水；f.HIF1低表达的C57BL/6小鼠+麻杏石甘汤联合地龙。

③观察治疗前后C57BL/6小鼠是否具有哮喘相关症状以及哮喘相关症状的严重程度，分析麻杏石甘汤联合地龙对哮喘症状的缓解作用。

④获取以上各组小鼠的肺泡灌洗液、肺组织切片、外周血，保存于-80℃冰箱，保存期限1月；采用WesternBlot法和qPCR法检测小鼠肺泡灌洗液、肺组织切片、和外周血中的Th2细胞数量，Ⅱ型细胞相关因子的表达；分析麻杏石甘汤联合地龙是否通过HIF1信号路径抑制Th2细胞缓解哮喘急性发作。

二、结果：

(1)通过动物模型验证了麻杏石甘汤联用地龙在缓解哮喘急性发作中优于与其它虫类中药的联用；

(2)明确麻杏石甘汤联合地龙通过HIF1信号路径调控CD4+T细胞、Th2细胞缓解哮喘急性发作：

A、将麻杏石甘汤联合地龙的潜在靶点与CD4+T细胞相关的DEGs相交获得重叠基因，对重叠基因进行GO和KEGG通路分析，发现：重叠基因主要富集在转录调控，凋亡调控，细胞增殖和对缺氧的反应中(HIF1信号通路途径)。将重叠基因进行互作分析，并建立PPI网络，发现：TOP2A、GART、VEGFA、CAD、ALDH7A1、TYMS、MTOR、HIF1等枢纽基因，具体参见附图1-6，

注：图1:维恩图显示中草药相关基因和CD4T细胞相关基因的交集，通过交集分析共获得124个重叠基因；图2:GO-BP(生物学过程)功能富集分析；图3:GO-CC(细胞组件)功能富集分析；图4:GO-MF(分子功能)功能富集分析；图5:KEGG通路重叠基因富集分析；在每个类别中，以p值排列的Top15项显示在直方图中；X轴表示基因计数，Y轴表示GO或KEGG项；图6将124个重叠基因的编码蛋白在STRING数据库中进行互作分析，并建立PPI网络，图中节点表示重叠基因的编码蛋白，线表示重叠基因之间的相互作用。红圈和蓝圈分别表示上调和下调基因。节点大小越大，相关性越强。

B、麻杏石甘汤的药材成分主要为麻黄、杏仁、甘草、石膏。通过整合麻杏石甘汤和地龙的成分、基因和途径之间的相互作用，发现：杏仁、甘草、地龙可通过HIF1信号通路相互作用，具体参见附7，

注：通过整合药材、成分、基因和途径之间的相互作用，构建了加味中医经方-靶点-途径网络。该网络包括3种药材109个节点、37个化合物、54个靶点和15个通路，共发现453种药材成分-靶点-通路相互作用。核心成分为杏仁、甘草、地龙，枢纽成分为花生酸、乙酸松油酯，关键基因为PRKCB、ACSS1、ALDH2、HIFIA等，重要途径为代谢途径及HIFI信号通路途径。图中绿色、橙色、紫色和红色节点分别表示药材、成分、靶点和途径。

关于该实验的前期工作：

一、证明CD4+T细胞参与哮喘急性发作：

A、从GEO数据库获取GSE137268和GSE148004中健康人群和哮喘患者的样本，通过分析健康人群和哮喘患者免疫细胞浸润丰度，发现：健康人群和哮喘患者的CD4+T细胞比例差异最显著(P<0.012)，从GEO数据库获取GSE137268和GSE148004的健康人群和哮喘患者的样本；GSE137268包括15个健康对照样本和54个哮喘样本，GSE148004包括9个健康对照样本和9个哮喘样本，具体实验数据参见图8-11，

注：从GEO数据库获取GSE137268和GSE148004的健康人群和哮喘患者的样本；GSE137268包括15个健康对照样本和54个哮喘样本，GSE148004包括9个健康对照样本和9个哮喘样本；图8:GSE137268和GSE148004样本的主成分分析；图9:消除批量效应后的主成分分析；图10:分析数据集中对照样本和哮喘样本22种免疫细胞的比例；图11:对照组和哮喘组免疫细胞比例的差异；x轴表示免疫细胞，y轴表示细胞的比例，P<0.05为具有统计学意义。

B、前期通过分析健康人群和哮喘患者的Th2细胞分泌因子的表达发现：哮喘患者的Ⅱ型细胞相关因子的表达多于健康人群(P<0.05)，具体实验结果参见图12，

注：将某三甲医院50例经体检无呼吸道炎症疾病的健康人群和50名确诊为支气管哮喘的患者，分为对照组和哮喘组，qPCR法检测两组人群外周血中的Th2细胞分泌因子的表达发现：哮喘患者Th2细胞分泌炎性因子IL-4、IL-5、IL-13、IL-6、IL-10多于健康人群(P<0.01)。

二、通过屋尘螨(House dustmite，HDM)滴鼻致敏成功构建了炎性哮喘动物模型，具体参见图13-19：选取20只雌性6～8周龄C57BL/6小鼠，随机分为NS组与HDM模型组(n＝10)；图13：HDM模型组小鼠造模过程:在第0天和第10天，用20ug/30ml屋尘螨工作液(由高温高压灭菌生理盐水配置)滴鼻激发哮喘；图14:通过对NS小鼠和HDM模型小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)灌取及细胞计数，发现:HDM模型小鼠肺泡灌洗液中的炎性细胞和嗜酸性粒细胞多于对照组小鼠:图15-18:aPCR检测NS小鼠和HDM模型小鼠的肺部组织切片中的炎性介质发现:HDM模型小鼠肺组织中的IL-4、IL-5、IL-13、1L-25的mRNA水平高于NS小鼠，图19为：末次HDM激发哮喘后24h内处死小鼠，4％甲醛溶液固定支气管肺组织，以NS小鼠支气管肺组织为对照，HE染色评估支气管肺组织炎症细胞浸润情况发现：HDM模型小鼠支气管肺组织周围有明显炎症浸润和粘液高分泌。

其中前期通过磁珠分离法从C57BL/6J小鼠和HDM模型小鼠脾脏中成功分离CD4+T细胞，具体参见图20：注:取6周左右的C57小鼠，取出脾脏置于盛有RPMI-1640培养基的平皿中，用一对玻片的毛面将脾脏磨匀，形成细胞悬液；200目尼龙网置于50mL离心管口，将细胞悬液滤入离心管，将细胞悬液离心(1200rpm/min4℃，10min)，弃上清；用吸管将4ml70％(V/V)Percol轻轻加到试管底部，制成Percoll梯度分离液:400g离心30分钟，弃上清，滴加红细胞裂解液，裂解红细胞5min；加入5mlRPMI-1640培养基终止裂解，离心(1200rpm/min，4℃，10min)，弃上清，加RPMI-1640培养基重景细胞，离心(1200mm/min，4℃:5min)，清除红细胞裂解液(重复两次)；预冷孵育液重悬细胞悬液，调整细胞浓度至10^7/80ul；每10^7个细胞加入20ulanti-CD4磁珠，混匀，4℃避光孵育15min；用500ul预冷清洗液预先润湿分选柱3次；将细胞悬液加入缓慢分选柱中，再用1ml预冷清洗液洗涤柱子3遍；将分选柱从磁架上取出，加入500ul预冷清洗液，用针栓迅速的将阳性细胞洗拖至另一无菌离心管中，加入5倍体积以上预冷清洗液，混匀，计数，1000rpm离心10min。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。