一种丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群的筛选方法

摘要

本发明公开了一种丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群的筛选方法。属于菌群筛选技术领域。本发明方法包括如下步骤：丛枝菌根真菌共生作用下的根际细菌分离、根际微生物群的筛选、简化细菌菌群的构建和简化细菌菌群功能鉴定。本发明运用多种丛枝菌根真菌进行共生培养，利用多种有差异共生能力的菌株开展研究来构建的极简微生物组更具有普遍性。本发明利用16srRNA基因高通量测序技术与宏基因测序技术结合，使筛选的根际细菌更具有可靠性。本发明利用根际细菌分离纯化，并使用不同功能筛选培养基去鉴定其菌群菌株的功能，以筛选和鉴定与AM真菌相互作用的促生根际细菌，对于AM真菌共生效应的基础研究及广泛应用，具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及菌群筛选技术领域，更具体的说是涉及一种丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群的筛选方法。

背景技术

根际对植物健康至关重要，它包含一个复杂的微生物群落，被称为植物的第二基因组。植物根系向根际释放养分、分泌物、边缘细胞和粘液，细菌、真菌(包括丛枝菌根真菌)、卵菌、病毒和古细菌被根际沉积物吸引并以它们为食。然而，根和微生物之间的直接相互作用是最重要的，并且极大地影响植物的生长、健康和适应。植物对根际微生物群落的相对丰度和组成具有物种特异性影响，不同植物生长在同一土壤中会发展出不同的微生物群落。除了植物的调节外，微生物相互作用还可以调节根际微生物群落。

丛枝菌根(AM)真菌与超过三分之二的陆生植物形成共生关系。在共生关系中，AM真菌以多种方式促进植物生长，尤其是通过增加对磷、氮和钾的吸收。但是，对几种AM真菌全基因组进行研究发现，与腐生真菌或外生菌根真菌的基因组相比，AM真菌具有特别少的外酶谱，其编码碳水化合物降解酶(CAZys)的基因较少，尤其是缺乏糖苷水解酶(GHs)，如GH6、GH7。此外，AM真菌缺乏编码植酸酶的基因，该酶能水解土壤中有机磷的主要形式—植酸。这表明，与其他真菌相比，AM真菌对土壤有机养分的直接活化能力相对较弱。然而，定殖在AM真菌菌丝际的土壤微生物可能极大地促进了土壤有机养分的周转，弥补了AM真菌缺失的功能。迄今为止，大多数研究都集中在微生物-根系的相互作用上，但AM真菌和根际微生物的相互作用及其对植物生长的影响在很大程度上仍未得到探索。菌根生物技术最近在改善退化土壤和保护环境的生物修复中变得不可或缺。AM真菌通过联合根际微生物群来开发土壤中的有机养分(如氮和磷)资源，通过菌根途径提高养分吸收效率，具有重要的生态和农学意义。

因此，发明一种丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群的筛选方法，对于AM真菌共生效应的基础研究及广泛应用，具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群的筛选方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群的筛选方法，包括如下步骤：

步骤一：丛枝菌根真菌共生作用下的根际细菌分离

收集丛枝菌根真菌共生的根际土壤，利用质量浓度0.9％的NaCl无菌溶液对根际土壤进行重悬和梯度稀释，将稀释液涂布到细菌培养基中，对根际细菌进行分离；

步骤二：根际微生物群的筛选

1)对根际土壤样品DNA进行提取，制备插入片段长度为500bp的文库，进行宏基因组测序；同时，以根际土壤样品DNA为模板进行16S rRNA PCR扩增并纯化，构建PE文库，进行16S rRNA基因高通量测序；

2)将16S rRNA基因高通量测序数据进行拼接和质量控制，得到优化数据，进行ASV聚类，对ASV注释，之后进行物种相对丰度分析、α多样性分析、β多样性分析以及物种差异与相关性网络分析；

3)对宏基因组测序的原始数据进行处理，得到有效数据，之后计算基因在根际样本的丰度信息，将基因集与NR、KEGG、eggNOG、ARDB、CAZy、SEED进行比对，获得基因的物种注释信息和功能注释信息；

4)对16S rRNA基因高通量测序数据的分析结果(指的是步骤2)的分析结果)和宏基因组数据(步骤3)的有效数据)进行整合分析，利用随机森林分析、LEfSe分析和相关性网络分析，结合宏基因组的功能分析结果(步骤3)的分析结果)，筛选出丛枝菌根真菌介导的关键根际细菌菌群；

步骤三：简化细菌菌群的构建

1)对步骤一分离到的根际细菌进行种属鉴定；

2)将第1)步鉴定的种属与步骤二分析得到的丛枝菌根真菌介导的关键根际细菌菌群，进行整合分析，找到步骤一和步骤二中相同的菌属，构建简化细菌菌群，并对简化菌群进行纯化培养和保藏；

步骤四：简化细菌菌群功能鉴定

对简化细菌菌群的固氮、解磷和解钾功能进行鉴定，最终确定丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群。

所取得的有益效果：丛枝菌根真菌共生作用下的根际细菌的筛选和鉴定是本发明的第一个难点。主要依靠多种组学分析技术，扩增子高通量测序可以明确根际富集的菌属，宏基因组测序可以明确根际富集的菌属的功能，两者结合，就可以分析出丛枝菌根真菌共生作用下介导养分吸收的根际细菌。

根际细菌的分离和功能鉴定是本发明的第二个难点，因为土壤中可分离的菌属占比非常小，分离特定种属一直是个挑战，本发明采取多种培养基结合的方式进行分离，并采用鉴定培养基对特定功能菌属进行筛选。

进一步的，所述细菌培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、R2A培养基和大豆酪蛋白琼脂培养基。

所取得的有益效果：上述三种培养基可以培养的细菌种类很多，同时也可以达到互补分离的效果。

进一步的：所述步骤二中的16S rRNA基因高通量测序区域为V3-V4；

测序平台为Illumnia Mi-seq 2×300bp；

测序引物为：

341F:CCTACGGGNGGCWGCAG，SEQ ID NO:1；

805R:GACTACHVGGGTATCTAATCC，SEQ ID NO:2。

所取得的有益效果：上述测序区域具有较高的简并度有利于较高的覆盖率。

进一步的，步骤二的具体操作为：

1)对步骤一分离收集到的根际土壤，对根际土壤样品DNA进行提取，制备插入片段长度为500bp左右的文库，在Illumina

2)将16S rRNA基因高通量测序下机的原始bcl格式数据转化为fastq文件，然后对数据进行拼接和质量控制，优化得到数据；利用usearch进行ASV聚类，利用已有的物种注释数据库对ASV注释。利用已注释的ASV进行物种相对丰度分析、α多样性分析、β多样性分析以及物种差异与相关性网络分析。

3)对宏基因组测序的原始数据通过FastQC进行质量评估，并通过Trimmomatic进行过滤处理，得到相对准确的有效数据。对各样本Clean reads进行拼接组装，对拼接结果进行ORF预测，对于各样本的基因预测结果进行去冗余，以获得非冗余的基因集，然后将各样本Clean reads比对到非冗余基因集序列上，计算基因在各样本的丰度信息。将基因集与NR、KEGG、eggNOG、ARDB、CAZy、SEED进行比对，获得基因的物种注释信息和功能注释信息。

4)对16S rRNA基因高通量测序数据和宏基因组数据进行整合分析，利用随机森林分析、LEfSe分析和相关性网络分析，结合宏基因组的功能分析，筛选出丛枝菌根真菌介导的关键根际细菌菌群。

进一步的，所述步骤四中的氮、磷和钾筛选培养基为NFM培养基、OPD B培养基、无机磷筛选培养基和解钾细菌筛选培养基，各培养基组分如下：

每1000g NFM培养基包括如下组分：K

每1000g OPDB培养基包括如下组分：葡萄糖10.0g，(NH

每1000g无机磷筛选培养基包括如下组分：葡萄糖10.0g，(NH

每1000g解钾细菌筛选培养基包括如下组分：glucose 3.50g，MgSO

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明利用16s rRNA基因高通量测序技术与宏基因测序技术结合，使筛选的根际细菌更具有可靠性。本发明利用根际细菌分离纯化，并使用不同功能筛选培养基去鉴定其菌群菌株的功能，以筛选和鉴定与AM真菌相互作用的促生根际细菌，对于AM真菌共生效应的基础研究及广泛应用，具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明方法示意图；

图2附图为本发明实施例1中随机森林分析图；

图3附图为本发明实施例1中宏基因组核心菌属SEED分析图；

图4附图为本发明方法实施例1中根际简化细菌菌群的解磷、固氮和溶钾功能鉴定结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。

实施例1

一种丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群的筛选方法，包括以下步骤：

步骤一：丛枝菌根真菌共生作用下的根际细菌分离

利用已测序模式牧草植物百脉根MG20，分别接种三种丛枝菌根真菌(一株接种一种)，依次为摩西球囊霉、根内球囊霉和地表球囊霉，种植土量为每盆2kg鲜土(含水量为65％)，每盆种植4棵植株，丛枝菌根真菌接种量为250个孢子/盆。种植条件为25℃下以16小时/8小时昼夜循环，相对湿度为65％，共生培养40天后，通过菌根台盼蓝染色确定建立共生。

取出带土壤植物根部，置于50mL无菌离心管中，加入25mL无菌预冷的PBS溶液，在漩涡震荡仪上4℃震荡10min，6000rpm4℃离心10min，弃上清收集根际土壤。利用质量浓度0.9％的NaCl无菌溶液对根际土壤进行重悬，对重悬液进行梯度稀释，将稀释液分别涂布到3种细菌培养基中(牛肉膏蛋白胨培养基、R2A培养基和大豆酪蛋白琼脂培养基)，28℃培养7天，挑选单菌落进行摇菌，对菌液进行甘油保存，以此对根际细菌进行分离。

步骤二：根际微生物群的筛选

1)对步骤一分离收集到的根际土壤，称取500mg的样品，放入灭菌的2mL离心管中，加入1×PBS溶液，震荡混匀，12000rpm室温离心3min，弃置上层液体。倒置2mL离心管于吸水纸上1min，直至没有液体流出。利用MP Biomedicals FastDNA土壤样品提取试剂盒对根际土壤样品DNA进行提取，利用Qubit

16S rRNA V3-V4区段特异性引物序列如下：

341F:CCTACGGGNGGCWGCAG，SEQ ID NO:1；

805R:GACTACHVGGGTATCTAATCC，SEQ ID NO:2。

Illumina桥式PCR兼容引物序列如下：

Illumina P5 adaptor:5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3'，SEQ ID NO:3；

Illumina P7 adaptor:5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3'，SEQ ID NO:4。

2)将IlluminaMiseq

3)对测序的原始数据通过Fastp进行质量评估，数据过滤，有效reads统计等，去除污染序列，得到相对准确的有效数据。首先使用megahit进行多样本混合拼接，得到初步拼接contig序列。随后使用bowite2将clean reads map回拼接结果，提取unmapped reads，并使用SPAdes再次拼接，得到低丰度contigs。结合初步拼接结果，最终得到较为完整的contigs组装结果。使用软件Metawrap，依次完成Bin分选，Bin提纯，Bin定量，Bin重组装和Bin鉴定等过程。最终经过滤后得到完整度较高且低污染度的单菌基因组草图。采用Prodigal对拼接结果进行ORF预测，选择长度大于等于100bp的基因，并将其翻译成氨基酸序列。对于各样本的基因预测结果，采用CD-HIT软件进行去冗余，以获得非冗余的基因集。采用Bowtie2将各样本Clean reads比对到非冗余基因集序列上，利用SAMtools获得比对上的reads，再考虑到基因长度，计算基因在各样本的丰度信息。将基因集与NR、KEGG、eggNOG、ARDB、CAZy、SEED等数据库进行比对，获得基因的物种注释信息和功能注释信息，并根据基因集丰度得到功能丰度和物种丰度。根据物种丰度和功能丰度，进行物种与功能组成分析、物种与功能差异分析、样本比较分析等多方向的统计分析。

4)对16S rRNA基因高通量测序数据和宏基因组数据进行整合分析，利用随机森林分析、LEfSe分析和相关性网络分析，结合宏基因组的KEGG、eggNOG和SEED功能分析，挖掘核心标记细菌，筛选出丛枝菌根真菌介导的关键根际细菌菌群。随机森林分析图见图2，通过3种菌根共生组的随机森林分析可以看出，在三种菌根真菌共生的根际中，有10个菌属被定义为关键菌属，对这个10菌属的表达丰度进行分析，发现其中9个菌属呈现富集趋势，所以根据该结果，定义这9个菌属为丛枝菌根真菌介导的关键根际细菌菌群。宏基因组核心菌属SEED分析图见图3，通过宏基因组数据，提取核心菌属的功能序列，结合SEED数据库(https://theseed.org/wiki/Home_of_the_SEED)对其氮磷钾代谢功能进行分析，结果表明核心菌属均具有氮磷钾代谢的功能。

步骤三：简化细菌菌群的构建

1)对步骤一分离到的根际细菌，设计16S rRNA基因全长引物(27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，SEQ ID NO:5和1429R：GGTTACCTTGTTACGACTT，SEQ ID NO:6)，利用Taq酶对16S rRNA基因进行扩增，对扩增条带进行一代测序，测序结果利用NCBI的BLAST功能对序列进行分析，以此对分离的细菌进行种属鉴定。

2)将第1)步鉴定的种属与步骤二分析得到的丛枝菌根真菌介导的关键根际细菌菌群，进行整合分析，构建简化细菌菌群，并对简化菌群进行纯化培养，利用甘油进行菌种保藏。

步骤四：简化细菌菌群功能鉴定

对步骤三保藏的简化细菌菌群，用R2A固体培养基进行活化菌株，用R2A液体培养基制备菌液，离心收集菌体，并利用无菌0.9％NaCl对菌体进行3～5次洗涤，除去残留的培养基成分，6000rpm离心15min，再用1mL无菌0.9％NaCl重悬菌体，分别点到氮、磷和钾筛选固体培养基中，点斑量3μL，28℃暗培养7天，观察溶解圈，并测定溶解圈直径和菌斑直径，计算其比值，以此对简化细菌菌群的固氮、解磷和解钾功能进行鉴定，结果见图4，通过根际细菌的分析，我们分离出关键根际细菌菌群的9个菌属中的7个，通过功能鉴定培养基，对其解磷、固氮和解钾的功能进行分析，最终确定丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群。

氮、磷和钾筛选固体培养基为NFM(N-free medium，无氮培养基)培养基、OPDB培养基(organophosphorus-degrading bacteria，有机磷分解细菌筛选培养基)、无机磷筛选培养基和解钾细菌筛选培养基。各培养基组分如下：

每1000g NFM培养基包括如下组分：K

每1000g OPDB培养基包括如下组分：葡萄糖10.0g，(NH

每1000g无机磷筛选培养基包括如下组分：葡萄糖10.0g，(NH

每1000g解钾细菌筛选培养基包括如下组分：glucose 3.50g，MgSO

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。