糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出相关的血清脂质标志物及其应用

摘要

本发明提供了糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的血清脂质标志物及其应用。具体地，提供了一种糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出相关的生物标志物集合，其中，所述集合包括A1组的生物标志物：A1：Cer 42:0；4O、DG36:0和ADGGA52:2。本发明的生物标志物能够高特异性、高准确度的评估人糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的风险或程度。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地涉及人糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出相关的血清脂质标志物及其应用。

背景技术

糖尿病(DM)是世界范围内一个重要的公共卫生问题。根据国际糖尿病联盟(IDF)统计，我国糖尿病(DM)人群数量全球第一，DM患病率11.6％，超过1.4亿人。

糖尿病视网膜病变(DR)是一类严重威胁工作人群视力的致盲性疾病，也是糖尿病(DM)在眼部的主要并发症。DM患者中DR患病率高达27.04％，我国DR患者数量超过3400万，因DR导致视力<0.3的盲或严重视力损伤者已接近1千万。且仅有7％的2型DM患者糖化血红蛋白、血压、低密度脂蛋白水平等得到了合理控制，可以说：现有DR患者仅是冰山一角，DM患者中存在相当数量的潜在DR人群。目前尚无有效方法逆转晚期DR，虽然有不少治疗方法，如全视网膜激光光凝、玻璃体手术、眼内注射抗新生血管药物等，但需要反复多次治疗，存在较大治疗风险，且仅针对表面症状，治疗结局差。可见DR防治关键在于寻找早期关键生物标志物，及早辨识、诊断、干预，在疾病发生前有效预警，在疾病早期精确辨识。

糖尿病视网膜病变的眼底典型病变包括微动脉瘤、视网膜内出血、静脉袢、静脉串珠、硬性渗出、棉绒斑、纤维组织增生、视网膜新生血管、视网膜前出血、玻璃体出血等。其中，硬性渗出在眼底表现为黄色颗粒或斑块状，既往被认为是血浆内的脂质或脂蛋白从视网膜血管渗出，沉积在视网膜组织内形成。硬性渗出往往伴随着视网膜增厚和水肿，与糖尿病性黄斑水肿(DME)的发生密切相关。糖尿病性黄斑水肿主要影响中心视力，严重影响患者生活质量。早期糖尿病视网膜病变治疗研究小组(ETDRS)的研究表明，持续性的硬性渗出最终可演变为视网膜下纤维化或视网膜色素上皮(RPE)萎缩，导致不可逆转的视力丧失。其他一些研究也表明，黄斑中心凹硬性渗出通常与较差的视力结局相关。因此，研究硬性渗出发生发展的机制，早期预测预警，进而减少硬性渗出导致的视力损伤至关重要。

根据以往的研究，硬性渗出的形成被认为是脂蛋白从视网膜毛细血管渗漏到视网膜细胞外间隙所致。因此，既往研究关注糖尿病视网膜病变患者血脂水平与硬性渗出程度的关系。传统上认为，血脂水平升高与眼底硬性渗出风险增加相关。早期糖尿病视网膜病变治疗研究小组(ETDRS)的数据表明，降脂药物可以降低糖尿病视网膜病变患者眼底硬性渗出形成的风险。然而，另一些研究发现血脂水平与硬性渗出严重程度之间没有相关性，降脂药物对并不能减少硬性渗出的风险。由于降脂治疗在预防和治疗糖尿病视网膜病变硬性渗出方面的局限性，有必要进行更为深入的脂质组学分析，明确导致眼底硬性渗出的关键生物标志物，早期预测预警，减少硬性渗出导致的视力损伤。

因此，本领域迫切需要提供高特异性、高准确度的与糖尿病视网膜病变患者眼底硬性渗出有关的血清脂质标志物，为此类疾病提供一种新的诊断、分型手段，亦为进一步阐明该类疾病的发生发展机制打下基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够高特异性、高准确度的评估人糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的风险或程度的生物标志物的集合。

本发明第一方面，提供了一种糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出相关的生物标志物的集合，其中，所述集合包括A1组的生物标志物：

A1：Cer 42:0；4O、DG36:0和ADGGA 52:2。

在另一优选例中，所述集合还包括A2组的生物标志物：A2：TG 49:1和PC O-44:5。

在另一优选例中，所述集合还包括一个或多个选自A3组的生物标志物：

A3:PE 36:1；3O、NAE 20:2、NAE 20:0、DG O-31:1、SM 44:2；3O。

在另一优选例中，所述集合还包括一个或多个选自A4组的生物标志物：

A4:DG O-35:1、PC 31:0、NAE 18:5、NAE 20:0、PC 17:0、TG 32:0、SM 38:5；2O、TG48:0、TG52:0、TG 54:1。

在另一优选例中，所述集合包括A1-A3中的所有生物标志物。

在另一优选例中，所述集合包括A1-A4中的所有生物标志物。

本发明第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的生物标志物集合的用途，用于制备预测和/或诊断糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的试剂盒。

本发明第三方面，提供了一种用于预测和/或诊断糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的试剂盒，包括下组的生物标志物的标准品和/或其同位素标准品，其中，

所述生物标志物包括A1组的生物标志物：

A1：Cer 42:0；4O、DG36:0、ADGGA 52:2。

在另一优选例中，所述生物标志物还包括A2组的生物标志物：A2：TG 49:1、PC O-44:5。

在另一优选例中，所述生物标志物还包括一个或多个选自A3组的生物标志物：

A3:PE 36:1；3O、NAE 20:2、NAE 20:0、DG O-31:1、SM 44:2；3O。

在另一优选例中，所述生物标志物还包括一个或多个选自A4组的生物标志物：

A4:DG O-35:1、PC 31:0、NAE 18:5、NAE 20:0、PC 17:0、TG 32:0、SM 38:5；2O、TG48:0、TG52:0、TG 54:1。

本发明第四方面，提供了一种预测或诊断糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的方法，包括步骤：

(a)检测对象血清样本中的各生物标志物的浓度C1，所述生物标志物包括A1组的生物标志物：A1：Cer 42:0；4O、DG36:0和ADGGA 52:2；

(b)将所述C1分别与参照值C0进行比较，从而预测或诊断所述对象是否患有糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出，或是否存在糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的风险。

在另一优选例中，C0包括从患有糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的对象得到的相应生物标志物的参考值C0+；和/或

所述C0包括为从不患有糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的对象得到的相应生物标志物的参考值C0-。

在另一优选例中，当选用的每一个生物标志物的浓度值都符合C1≥C0+时，则将所述患者诊断为患有糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出。否则为不患有糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出。

在另一优选例中，根据C1与C0+和/或C0-之间的差异，预测患糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的风险。

在另一优选例中，所述生物标志物还包括选自A2组的生物标志物：

A2：TG 49:1、PC O-44:5。

在另一优选例中，所述生物标志物还包括一个或多个选自A3组的生物标志物：

A3:PE 36:1；3O、NAE 20:2、NAE 20:0、DG O-31:1、SM 44:2；3O。

在另一优选例中，所述生物标志物还包括一个或多个选自A4组的生物标志物：

A4:DG O-35:1、PC 31:0、NAE 18:5、NAE 20:0、PC 17:0、TG 32:0、SM 38:5；2O、TG48:0、TG52:0、TG 54:1。

本发明第五方面，提供了一种如本发明第三方面所述的试剂盒的用途，用于预测和/或诊断检测对象是否患有糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出或是否存在糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的风险。

在另一优选例中，所述对象为哺乳动物，如人。

在另一优选例中，所述对象为糖尿病患者，甚至为糖尿病视网膜病变患者。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1.WGCNA脂质模块与硬性渗出pearson相关性及显著性分析结果。

图2.ME1脂质模块脂质组成。

图3.三酰甘油、神经酰胺、N-酰基乙醇胺碳链长度和不饱和度分析。

图4.Multi-ROC分析。由20个脂质分子组成的集合对硬性渗出有最佳的区分效果。

图5.Multi-ROC曲线20个脂质分子具体组成。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了人糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的血清脂质生物标志物集合。具体地，所述的集合包括多种糖尿病视网膜病变患者眼底硬性渗出的血清脂质生物标志物，可以用于评估待测对象的眼底硬性渗出的患病风险或待测对象的眼底硬性渗出的诊断，具有高灵敏性、高特异性的优点，具有重要的应用价值。在此基础上完成本发明。

术语

除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

糖尿病视网膜病变患者眼底硬性渗出

糖尿病视网膜病变的眼底典型病变包括微动脉瘤、视网膜内出血、静脉袢、静脉串珠、硬性渗出、棉绒斑、纤维组织增生、视网膜新生血管、视网膜前出血、玻璃体出血等。

其中，硬性渗出在眼底表现为黄色颗粒或斑块状，往往伴随着视网膜增厚和水肿，与糖尿病性黄斑水肿(DME)的发生密切相关。糖尿病性黄斑水肿主要影响中心视力，严重影响患者生活质量。早期糖尿病视网膜病变治疗研究小组(ETDRS)的研究表明，持续性的硬性渗出最终可演变为视网膜下纤维化或视网膜色素上皮(RPE)萎缩，导致不可逆转的视力丧失。当眼底已发生显著硬性渗出改变时，患者视功能已严重受损，且对现有治疗反应较差。目前尚无通过血清脂质组学检测或任何其他方法可以预测或诊断糖尿病视网膜病变患者眼底硬性渗出的有效方法。糖尿病视网膜病变患者眼底特征性改变与患者血清脂质组学改变的联系目前尚无相关研究报道。本研究具体的技术方案中采用了UHPLC-MS/MS方法进行血清脂质组学检测，涵盖了血清当中的888个脂质分子，可以对全身脂质的改变进行详细、全面的分析。

眼底硬性渗出相关的生物标志物

本发明提供了血清样本中，可用于评估眼底硬性渗出的相关生物标志物的(物质)集合。其中，A1组的生物标志物与眼底硬性渗出具有最高的相关性：

A1：Cer 42:0；4O、DG36:0、ADGGA 52:2。

进一步地，所述集合还可包括选自A2组的生物标志物：

A2：TG 49:1、PC O-44:5。

优选地，所述集合还包括一个或多个选自A3组的生物标志物：A3:PE 36:1；3O、NAE20:2、NAE 20:0、DG O-31:1、SM 44:2；3O。

在另一优选例中，所述集合还包括一个或多个选自A4组的生物标志物：A4:DG O-35:1、PC 31:0、NAE 18:5、NAE 20:0、PC 17:0、TG 32:0、SM 38:5；2O、TG 48:0、TG52:0、TG54:1。

优选地，所述标志物的集合包括A1-A3中的所有(共10种)生物标志物。

更优选地，所述标志物的集合包括A1-A4中的所有(共20种)生物标志物。

本发明中，脂质的表示方法对于本领域技术人员是清楚的，其中，“TG”表示三酰甘油、“Cer”表示神经酰胺，“NAE”表示N-酰基乙醇胺，“ADGGA”表示酰基二酰基甘油葡萄糖醛酸酯，“DG”表示二酰甘油，“PE”表示磷脂酰乙醇胺，“PC”表示磷脂酰胆碱，“SM”表示鞘磷脂。典型地，“DG O-31:1”表示双链C原子数的总长度为31，且含有1个不饱和双键的二酰甘油，O表示碳链通过醚键的方式与甘油骨架相连；SM 44:2；3O表示双链C原子数的总长度为44，且两条链中总的不饱和度为2，并且2条碳链中含有3个O原子的鞘磷脂。.

本发明还提供了一种上述的生物标志物的集合的用途，用于制备预测和/或诊断糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的试剂盒。

试剂盒

本发明进一步提供了一种用于预测和/或诊断糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的试剂盒，其包括如上生物标志物的标准品和/或其同位素标准品。

本发明中，所述试剂盒至少包括A1组的生物标志物：

A1：Cer 42:0；4O、DG36:0和ADGGA 52:2。

本发明的如上所述的试剂盒可用于预测和/或诊断检测对象是否患有糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出或是否存在糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的风险。

优选地，所述同位素标准品指同位素标记的所述生物标志物，例如氘(2H)、

在另一优选例中，所述对象为哺乳动物，如人。

在另一优选例中，所述对象为糖尿病患者，甚至为糖尿病视网膜病变患者。

通常，所述试剂盒中，生物标志物、或其同位素标准品的标准品可以分开包装，也可以以混合标品的方式提供。

此外，所述试剂盒还可以包括说明书。优选地，所述说明书包括下述的预测或诊断糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的方法。

预测或诊断糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的方法

进一步地，本发明还提供了一种预测或诊断糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的方法，包括步骤：

(a)检测一对象血清样本中的各生物标志物的浓度C1，所述生物标志物包括A1组的生物标志物：A1：Cer 42:0；4O、DG36:0、ADGGA 52:2；

(b)将所述C1分别与参照值C0进行比较，从而预测或诊断所述对象是否患有糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出，或是否存在糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的风险。

在已知本发明的生物标志物与眼底硬性渗出具有高度相关性的情况下，本领域技术人员可以通过本领域常规的方法制备预测/诊断疾病的标准。例如，C0包括从患有糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的对象得到的相应生物标志物的参考值C0+；和/或所述C0包括为从不患有糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的对象得到的相应生物标志物的参考值C0-。

当选用的每一个生物标志物的浓度值都符合C1≥C0+时，则将所述患者诊断为患有糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出。否则为不患有糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出。

在另一优选例中，根据C1与C0+和/或C0-之间的差异，预测患糖尿病视网膜病变眼底硬性渗出的风险。例如，当C1越接近C0+时，眼底硬性渗出风险增大，而当C1越接近C0-时，眼底硬性渗出风险较小。

在另一优选例中，所述对象为哺乳动物，如人。

在另一优选例中，所述对象为糖尿病患者，甚至为糖尿病视网膜病变患者。

本发明的主要优点包括：

1.本发明首次提供了一种糖尿病视网膜病变患者眼底硬性渗出相关的生物标志物集合，及包括所述生物标志物的试剂盒，可用于预测或早期诊断硬性渗出。

2.本发明的生物标志物可以高特异性、高准确度的预测和/或诊断硬性渗出。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

(a)试验描述

研究人群：

纳入排除标准：本研究所有参与者均为2017年7月至2021年3月于上海市第一人民医院眼科和内分泌科住院患者和门诊患者。纳入标准：(1)年龄≥18岁；(2)汉族；(3)诊断为糖尿病(1型和2型，经糖尿病医生确诊)和任何严重程度的糖尿病视网膜病变[包括轻度非增殖性糖尿病视网膜病变、中度非增殖性糖尿病视网膜病变、重度非增殖性糖尿病视网膜病变和增殖性糖尿病视网膜病变，经眼科医生确诊]。排除标准:(1)其他可能导致眼底硬性渗出表现的眼部疾病史，如年龄相关性黄斑变性、葡萄膜炎、视网膜静脉阻塞等；(2)患有严重白内障导致屈光介质混浊，影响对硬性渗出严重程度的评估；(3)合并除糖尿病视网膜病变以外的其他严重糖尿病并发症；(4)怀孕或哺乳。

全身及眼部评估与检查：糖尿病的诊断标准依据1997年美国糖尿病协会提出的标准。糖尿病视网膜病变的评估依据美国眼科学会2001年提出的诊断标准，由资深眼底专家进行眼底检查。所有患者均接受全面眼科检查，包括裂隙灯检查眼前节及眼底、眼底彩照。按照眼底彩照病变程度分为轻度非增殖性糖尿病视网膜病变、中度非增殖性糖尿病视网膜病变、重度非增殖性糖尿病视网膜病变和增殖性糖尿病视网膜病变。记录所有研究对象的性别、年龄、糖尿病类型、糖尿病病程、高血压病史、高血压病程、血脂异常病史、心血管疾病史、伴随用药情况等。此外，收集患者的糖化血红蛋白(HbA1c)、总胆固醇、甘油三酯、肌酐、尿素和尿酸等生化指标。

眼底彩照硬性渗出严重程度评价：所有患者均拍摄第2视野35度眼底彩照，涵盖以黄斑为中心、包含视盘的后极部区域。发明人使用国际上早期糖尿病视网膜病变治疗研究小组(ETDRS)制定的不同严重程度硬性渗出的标准照片与本研究患者眼底影像进行比较，判断第2视野中硬性渗出的是否存在及其严重程度。国际上的硬性渗出分级标准为:0级，无硬性渗出；1级，可疑的硬性渗出；2级，硬性渗出<标准照片3；3级，硬性渗出≥标准照片3且<标准照片5；4级，硬性渗出≥标准照片5且<标准照片4；5级，硬性渗出≥标准照片4；8级，不能分级。为了简化进一步血脂组学和代谢组学分析的分组，本研究将硬渗出物的程度合并为3类：无或可疑硬性渗出(0级和1级)；中度硬性渗出(2级和3级)；严重硬性渗出(4级和5级)。对眼底彩照不能分级的患者予以排除。评价工作由两名经验丰富的读片师独立完成，然后由资深眼底专家确认等级，并做出最终的分类。如果有任何分歧，由所有的评分者达成一致。

血清样本采集：所有患者早晨空腹取全血10ml注入肝素钠管，30min内离心(1500rpm,20℃，10min)。将1.5mL的血清等分物转移到冷冻管中，并立即在-80℃保存。采用液-液萃取法提取样品中的脂质:50μL样品以冷氯仿:甲醇(v/v＝2:1)的4倍体积提取。将样品涡旋30s，然后在室温下静置5分钟。将混合物在13000g下离心15min，分别收集上相(亲水代谢物)和低有机相(疏水代谢物)，在室温真空下蒸发。

超高效液相色谱/串联质谱法结合模式识别技进行脂质的检测：代谢产物和脂质在Ultimate 3000UHPLC系统(Thermo Scientific)上分离。脂质组学数据采集采用全扫描方式。

数据处理：对UPLC-MS/MS生成的组学原始数据，使用Mzmine对组学原始数据进行自动的峰值挑选、整合、保留时间调整和对齐。

统计分析：使用MetaboAnalyst5.0(http://www.metaboanalyst.ca/)进行热图、spearman等级相关分析和通路分析。采用Logistic回归分析和受试者工作特征(ROC)分析对不同人群硬性渗出进行诊断。采用期望最大化(EM)方法估计临床和人口统计学特征的缺失值或ROC分析。使用SPSS 18.0软件进行统计分析。

(b)结果(数据、图表等)

研究对象一般资料：本研究共纳入上海市第一人民医院糖尿病视网膜病变患者167例(167眼)，分为发现集和验证集。其中，发现集为从2017年7月到2019年11月入组的116例(116眼)；验证集为2020年4月至2021年3月入组的51例(51眼)。

硬性渗出严重程度评价的一致性：根据分型标准，将患者分为3组，即无或可疑的硬性渗出、中度硬性渗出和重度硬性渗出。加权kappa为0.931(P<0.001)。这一结果显示了良好的观察者间一致性。

WGCNA分析：通过WGCNA对脂质组学数据进行分析，888个脂质分子被分为18个模块，对获得的模块得分和渗出程度进行pearson相关分析和显著性分析，非增殖性糖尿病视网膜病变患者、增殖性糖尿病视网膜病变患者及糖尿病视网膜病变病人(非增殖性糖尿病视网膜病变+增殖性糖尿病视网膜)硬性渗出程度都与ME1模块显著正相关，与ME5模块显著负相关，结果见图1。

ME1脂质组成分析：ME1脂质模块组成分析见图2，ME1主要组成为三酰甘油(TG，占29％)，神经酰胺(Cer，占17％)和N-酰基乙醇胺(NAE，占15％)。

三酰甘油、神经酰胺、N-酰基乙醇胺的碳链长度和不饱和度分析：ME1模块中主要为三酰甘油，进一步对三酰甘油的不饱和度和碳链长度与渗出的相关关系进行pearson相关分析。

分析结果见下图3，红色表示脂质成分与渗出呈正相关，蓝色表示与渗出成负相关，黄色框表示pearson相关性的p值<0.01；红色框表示pearson相关性的p值<0.0001。分析的结果表明，渗出的程度与超长链不饱和的TG甘油升高显著相关，并且与长链饱和的TG甘油降低显著相关。另外两者神经酰胺、N-酰基乙醇胺的碳链长度和不饱和度未发现明显变化趋势。黄色框：p值<0.01；红色框：p值<0.0001。

Multi-ROC分析：ROC曲线分析是基于多变量算法-支持向量机(SVM)，ROC曲线通过蒙特卡洛交叉验证(MCCV)产生的，使用平衡子抽样。在每个MCCV中，三分之二(2/3)的样本被用来评估特征的重要性，采用SVM对特征进行排序。然后，前2、3、5、10......100个(最大)重要特征被用来建立分类模型，并在被排除的1/3样本上进行验证。这个过程被重复多次，以计算每个模型的性能和置信区间。ME1 Multi-ROC分析结果见图4，研究表明由10个脂质分子组成的集合对硬性渗出有较佳的区分效果，AUC＝0.804，95％可信区间0.644～0.928，20个脂质分子组成的集合对硬性渗出有最佳的区分效果，AUC＝0.804，95％可信区间0.674～0.916。通过ME1脂质建立的ROC曲线。20个脂质分子具体组成见图5，纵坐标表示代谢物名称，横坐标表示特征选定频率。

(c)对结果的简要说明或讨论

糖尿病视网膜病变患者眼底硬性渗出这一病理改变对视功能危害严重。本发明发现了一种和眼底硬性渗出有关的生物标志物集合，可以用于评估待测对象的眼底硬性渗出的患病风险或待测对象的眼底硬性渗出的诊断，具有高灵敏性、高特异性的优点，具有重要的应用价值。有利于在临床上早期鉴别容易发展为眼底硬性渗出的糖尿病视网膜病变患者，及早血糖、血脂等进行全身情况干预，保护视功能。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。