一株促进葛根素功效发挥的肠膜明串珠菌肠膜亚种及其应用

摘要

本发明公开了一株促进葛根素功效发挥的肠膜明串珠菌肠膜亚种及其应用，属于微生物技术领域。本发明筛选得到的肠膜明串珠菌肠膜亚种CCFM1282可将葛根素转化为包含大豆苷元在内的多种活性小分子物质；转化后发酵液较发酵前能提高HepG2酒精性细胞损伤的细胞增殖能力与抗氧化能力；葛根素与菌株复合预处理肝细胞可提高其应对酒精损伤的能力；该肠膜明串珠菌肠膜亚种CCFM1282能显著提高葛根素解酒功效。本发明将肠膜明串珠菌肠膜亚种CCFM1282用于转化葛根素并显著提高解酒功效，具有巨大的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一株促进葛根素功效发挥的肠膜明串珠菌肠膜亚种及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

中国酒文化历史悠久，但饮酒过量会导致酒精中毒。目前，西医对急性酒精中毒的治疗多采用注射50％葡萄糖，对预防、治疗宿醉及酒后保健缺乏对应有效药物。而从中药草本植物中寻找解酒药物具有巨大的潜力。

葛根始载于汉代《神农本草经》，具有悠久的药食两用历史。其主要成分有异黄酮类、三萜类、皂苷类和多糖类等。其中，葛根异黄酮类是主要的药理活性成分，存在形式一般为游离型苷元和结合型糖苷，前者主要是大豆苷元，后者主要为葛根素(C

一、有的人群缺乏能够转化葛根素的菌群，因此在食用含葛根素膳食时，功效发挥作用差；二、食品和医药领域缺乏能够通过促进葛根素功效发挥的菌株。

虽已有其各种益生功能研究，但均未发现其能通过转化葛根素并协同增效缓解肝细胞损伤。因此，挖掘此类菌株，实现菌株与富含葛根素膳食的协同增效具有广泛的应用前景。

目前，通过分离筛选的方法获得的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesensteroides)是一种植物附生菌，常见于传统发酵乳制品和泡菜中。因其能发酵产生乳酸及双乙酰类物质，被认为对这些传统食品的风味有重要贡献。2012年卫生部将肠膜明串珠菌肠膜亚种肠膜亚种(Leuconostoc mesensteroides subsp.mesenteroides)列入可用于食品的菌种目录(卫生部公告2012年第8号)，关于肠膜明串珠菌肠膜亚种的发酵特性及其特殊生理活性的研究逐步深入。

已有研究证实，肠膜明串珠菌肠膜亚种能发酵糖类产生乳酸，具有高产酸能力、抗氧化能力和括抗致病菌等能力。目前肠膜明串珠菌肠膜亚种肠膜亚种在食品领域已被广泛应用于风味剂；虽已有其各种益生功能研究，但均未发现其能通过促进葛根素发挥缓解肝细胞损伤功效。因此，挖掘此类菌株，实现菌株与富含葛根素膳食的协同增效具有广泛的应用前景。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一株能够增强葛根素功效的肠膜明串珠菌肠膜亚种及应用。此方法提供一株可通过高度转化葛根素为活性小分子增强缓解酒精肝细胞损伤的肠膜明串珠菌肠膜亚种，并提供一种提高解酒功效的应用方法，利用此方法可成功实现解酒效果的提高。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一株能够提高葛根素解酒功效的肠膜明串珠菌肠膜亚种CCFM1282，已于2022年10月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62884，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，该菌株的分类学命名为：肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostoc mesensteroides subsp.mesenteroides)，株名为CCFM1282；该菌株在改良MRS培养基上培养48h后菌落呈圆形、凸面或透镜状，微白,不透明,有平滑至粘液状的柔软表面，可高度转化葛根素为大豆苷元并提高解酒功效。

本发明还提供了含所述肠膜明串珠菌肠膜亚种CCFM1282的组合物。

在一种实施方式中，所述组合物为食品、保健品或药物。

在一种实施方式中，所述组合物中所述肠膜明串珠菌肠膜亚种CCFM1282的数量≥1×10

在一种实施方式中，所述组合物含有所述肠膜明串珠菌肠膜亚种CCFM1282和含葛根素的膳食。

在一种实施方式中，所述组合物含有所述肠膜明串珠菌肠膜亚种CCFM1282和葛根粉。

在一种实施方式中，所述组合物是肠膜明串珠菌肠膜亚种在含葛根素的发酵基料中发酵后的发酵液。

在一种实施方式中，所述组合物是按如下方法制备：将肠膜串珠菌肠膜亚种CCFM1282在MRS液体培养基中培养一段时间，转接至含葛根素的发酵基料中，35～40℃发酵24～48h，获得的菌液浓度为8×10

在一种实施方式中，所述发酵基料中的葛根素浓度≥0.1mg/mL。

在一种实施方式中，所述细胞培养物经过高压均质破碎。

本发明还提供了所述肠膜明串珠菌肠膜亚种CCFM1282在转化葛根素中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是将所述肠膜明串珠菌肠膜亚种CCFM1282在含葛根素的培养基中培养一段时间。

在一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：

(1)将前述的肠膜明串珠菌肠膜亚种在MRS固体培养基上划线，平板于37℃倒置培养48h。挑取单菌落接入5mL的MRS液体培养基中于37℃培养48h。

(2)在富含葛根素的发酵基料中，加入5％(v/v)该肠膜明串珠菌肠膜亚种的菌液，37℃恒温发酵48h。

在一种实施方式中，所述步骤(2)中所述的富含葛根素MRS液体培养基中葛根素浓度为0.1～0.8mg/mL。

本发明还要求保护所述肠膜明串珠菌肠膜亚种或所述组合物，或所述肠膜明串珠菌肠膜亚种的细胞培养物在制备解酒药物方面的应用。

本发明还要求保护所述肠膜明串珠菌肠膜亚种或所述肠膜明串珠菌肠膜亚种的细胞培养物在制备化学性肝损伤辅助保护的保健品方面的应用。

在一种实施方式中，所述细胞培养物包括肠膜明串珠菌肠膜亚种CCFM1282在培养基中培养一段时间后的细胞培养液，或将所述细胞培养液均质破碎后的产物。

有益效果：

(1)本发明提供了一株能够提高葛根素解酒功效的肠膜明串珠菌肠膜亚种及应用，能够实现将葛根素转化为包含大豆苷元在内的多种活性小分子物质，并且在发酵完成后代谢产物中大豆苷元浓度高于15.91μg/mL(0.1mg/mL葛根素)；

(2)应用所述肠膜明串珠菌肠膜亚种转化葛根素制备的发酵液具有缓解酒精肝损伤的能力，能提高HepG2酒精性细胞损伤的细胞增殖能力与抗氧化能力，并具有很强的解酒功效。

生物材料保藏

肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostoc mesensteroides subsp.mesenteroides)CCFM1282，分类学命名为Leuconostoc mesensteroides subsp.mesenteroides，已于2022年10月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62884保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1为各组别MDA含量比。

图2为各组别细胞活力比。

图3为各组别谷草转氨酶活性比。

图4为各组别谷丙转氨酶活性比。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述，但本发明不受实施条例的限制。

下述实施例中涉及的葛根素(产品编号：P816259、CAS：3681-99-0)购自麦克林公司；草本葛根粉购自北京同仁堂；大豆苷元(产品编号：SD8010、CAS：486-66-8)购自索莱宝科技有限公司；DMEM培养液与胎牛血清购自gibco公司；无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司；谷草转氨酶试剂盒、谷丙转氨酶试剂盒、丙二醛试剂盒均购自南京建成公司；乙酸为分析纯，甲醇为色谱纯均购自国药集团化学试剂有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二胺2g/L、K

MRS固体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二胺2g/L、K

含葛根素的发酵基料(g/L)：葛根素0.1mg/mL，蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二胺2g/L、K

实施例1：肠膜明串珠菌肠膜亚种的筛选、菌种鉴定及保存

1、筛选

以来源于四川成都，泡菜样品为样本，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10

2、鉴定

对分离得到的菌株进行PCR扩增16S rDNA，PCR产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，将测序得到的结果在NCBI中进行核酸序列比对，最终得到1株肠膜明串珠菌肠膜亚种，命名为肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostoc mesensteroidessubsp.mesenteroides)CCFM1282。

3、保存

将肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostoc mesensteroidessubsp.mesenteroides)CCFM1282接种于5mL MRS液体培养基中，37℃培养24h；取1mL菌液于无菌离心管中，8000r/min离心3min后弃去上层培养基，菌泥重悬于30％甘油溶液中置于-80℃中保藏。

实施例2：肠膜明串珠菌肠膜亚种高效转化葛根素

1、将实施例1中的肠膜明串珠菌肠膜亚种CCFM1282在MRS固体培养基上划线，平板于37℃倒置培养48h；挑取单菌落接入5mL的MRS液体培养基中于37℃培养48h。

2、在含葛根素的发酵基料中，加入5％(v/v)该肠膜明串珠菌肠膜亚种的菌液，使接种后的菌体浓度达到1×10

3、发酵完成后，利用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液，将上清液在50℃下于通风橱中进行旋转蒸馏，并最终在温度为55℃下水浴蒸干，得到葛根素发酵物，并于4℃冷藏保存。

4、将葛根素发酵物进行HPLC检测后发现，葛根素发酵物中已检测不到葛根素。由此可见葛根素经过适宜的条件可以被完全转化，但大豆苷元只是其中一种代谢产物。

实施例3：HPLC检测葛根素发酵后大豆苷元含量

1、色谱条件如下：色谱柱：Waters HSS Peptide T3；流速：1.0mL/min；检测波长：250nm；进样量：5μL；流动相：甲醇(A)-0.2％乙酸水(B)；柱温35℃。按照以下梯度进行洗脱：0-10min，0-30％A；10–30min，30-70％A；30-35min，70-0％A。

2、分别精密称取葛根素、大豆苷元对照品约10mg于100mL容量瓶中，用分析纯乙醇溶液定容，并在300W 50Hz条件下超声提取30min，冷却后用乙醇补充缺失的重量。精密吸取上述溶液并稀释到10.0μg/mL，25.0μg/mL，50.0μg/mL，75.0μg/mL，100.0μg/mL浓度的2ml溶液。在流动相下做工作曲线，得到结果，并拟合曲线。

3、当原料全部发酵时，样品溶液的浓度为0.1mg/mL，以标样浓度10μg/mL作为内参浓度计算待测品浓度。

4、待测样品稀释从100μg/ml稀释到10μg/ml后，吸取10mL葛根素发酵产物(待测样品)，用0.45μm薄膜过滤后用分析纯乙醇溶液定容至100mL。吸取对照品溶液和样品供试溶液进样，照上述色谱条件测定，用外标法计算得发酵产物中大豆苷元含量的结果。其结果为该肠膜明串珠菌肠膜亚种发酵液中大豆苷元浓度为15.91μg/mL，发酵液中菌体浓度为1×10

实施例4：应用肝癌细胞HepG2验证菌株与葛根素复合解酒功效

肠膜串珠菌肠膜亚种CCFM1282与葛根素复合发酵液的制备：将实施例1中的活化完成的肠膜串珠菌肠膜亚种CCFM1282接入MRS液体培养基中于37℃厌氧培养24h。以5％(v/v)接种量接入含葛根素的发酵基料中，37℃恒温发酵48h，获得的菌液浓度为8×10

按如下步骤验证解酒功效：

1、将HepG2细胞在含5％胎牛血清的DMEM培养基于37℃、5％CO

2、以10

3、选择750mM乙醇浓度进行肝细胞损伤造模。将细胞悬液完成细胞计数后，添加培养基稀释，使细胞混悬液最终细胞密度为10

4、实验分为实验组、模型组与空白组进行。实验组每孔加入9μL无水乙醇，按照4个浓度梯度(以复合发酵液浓度计，10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL)加入肠膜串珠菌肠膜亚种CCFM1282与葛根素复合发酵液；模型组仅加入9μL无水乙醇和细胞悬液；空白组仅加入细胞悬液。将96孔板送回培养箱中继续培养12h。

5、根据CCK-8法测定细胞增殖活力，按照丙二醛(MDA)、谷草转氨酶(AST/GOT)与谷丙转氨酶(ALT/GPT)测试盒的操作说明进行实验，最后得MDA、GOT与GPT值。结果如图1～4所示：经过该肠膜串珠菌肠膜亚种CCFM1282与葛根素复合发酵(图中CCFM1282代谢转化葛根素组)能显著提高细胞增殖活力在不同浓度梯度下均较模型组提高12％以上；能降低细胞内MDA含量，在不同浓度梯度下均较模型组降低40％以上；降低谷草转氨酶活性比，在不同浓度梯度均较模型组降低15％以上；降低谷丙转氨酶活性比，在不同浓度梯度下均较模型组降低15％以上；提升抗氧化效果，并进一步提高解酒功效。

实施例5：应用肝癌细胞HepG2细胞实验验证菌株与草本葛根粉复合提高解酒功效

肠膜串珠菌肠膜亚种CCFM1282与草本葛根粉复合液(CCFM1282复合葛根粉)的制备：将实施例1中的活化完成的肠膜串珠菌肠膜亚种CCFM1282接入MRS液体培养基中于37℃厌氧培养24h。以8000r/min离心20min，收集菌泥，真空冷冻干燥，冻干成粉(保证菌粉活性为1×10

按如下步骤验证解酒功效：

具体实施方式同实施例4，区别在于实验分为实验组、模型组与空白组进行。实验组每孔加入9μL无水乙醇，按照4个浓度梯度加入肠膜串珠菌肠膜亚种CCFM1282与草本葛根粉复合液，分别使每孔中复合液的终浓度为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL；模型组仅加入9μL无水乙醇和细胞悬液；空白组仅加入细胞悬液。将96孔板送回培养箱中继续培养12h。

根据CCK-8法测定细胞增殖活力，按照丙二醛(MDA)、谷草转氨酶(AST/GOT)与谷丙转氨酶(ALT/GPT)测试盒的操作说明进行实验，最后得MDA、GOT与GPT值。结果如图1～4所示：经过该肠膜串珠菌肠膜亚种CCFM1282与葛根素复合发酵能显著提高细胞增殖活力，在不同浓度梯度下均较模型组提高12％以上；能降低细胞内MDA含量，在不同浓度梯度下均较模型组降低40％以上；降低谷草转氨酶活性比，在不同浓度梯度均较模型组降低15％以上；降低谷丙转氨酶活性比，在不同浓度梯度均较模型组降低15％以上；提升抗氧化效果，并进一步提高解酒功效。

对比例1：HepG2细胞实验验证单一葛根素解酒功效

具体实施方式同实施例4，区别在于实验分为实验组、模型组与空白组进行。实验组每孔加入9μL无水乙醇，按终浓度计，分别加入10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL单一葛根素；模型组仅加入9μL无水乙醇和细胞悬液；空白组仅加入细胞悬液。将96孔板送回培养箱中继续培养12h。

根据CCK-8法测定细胞增殖活力，按照丙二醛(MDA)、谷草转氨酶(AST/GOT)与谷丙转氨酶(ALT/GPT)测试盒的操作说明进行实验，最后得MDA、GOT与GPT值。结果如图1～4所示：单一葛根素虽然能够提高细胞增殖活力、降低细胞内MDA含量、谷草转氨酶与谷丙转氨酶的含量，提升抗氧化效果，但效果远低于肠膜明串珠菌肠膜亚种CCFM1282发酵转化产物。

对比例2：HepG2细胞实验验证单一菌株解酒功效

具体实施方式同实施例4，区别在于，将肠膜串珠菌肠膜亚种CCFM1282接入MRS液体培养基中于37℃厌氧培养至菌体浓度为8×10

根据CCK-8法测定细胞增殖活力，按照丙二醛(MDA)、谷草转氨酶(AST/GOT)与谷丙转氨酶(ALT/GPT)测试盒的操作说明进行实验，最后得MDA、GOT与GPT值。结果如图1～4所示：单一菌株虽然能够提高细胞增殖活力、降低细胞内MDA含量、谷草转氨酶与谷丙转氨酶的含量，提升抗氧化效果，但效果远低于肠膜明串珠菌肠膜亚种CCFM1282发酵转化产物。

对比例3：HepG2细胞实验验证其他益生菌发酵转化解酒功效

具体实施方式同实施例4，区别在于，将CCFM1282替换为保藏编号为CGMCCNo.6077的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM8610(记载于公开号为CN102586148 A的专利申请文本中)，或保藏编号为GDMCC No：61495的动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)CCFM1155(记载于公开号为CN 113088473 A的专利文本中)。

根据CCK-8法测定细胞增殖活力，按照丙二醛(MDA)、谷草转氨酶(AST/GOT)与谷丙转氨酶(ALT/GPT)测试盒的操作说明进行实验，最后得MDA、GOT与GPT值。结果如图1～4所示：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM8610与动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)CCFM1155与葛根素复合发酵虽然能够提高细胞增殖活力、降低细胞内MDA含量、谷草转氨酶与谷丙转氨酶的含量，提升抗氧化效果，但效果远低于肠膜明串珠菌肠膜亚种CCFM1282发酵转化产物。

对比例4：现有技术中其他发酵转化葛根素技术方案及效果

1、记载于杂志《Mini Reviews in Medicinal Chemistry》的文章《RecentAdvances in Methods of Puerarin Biotransformation》中提及微生物转化发酵葛根素研究相对较少。

2、记载于杂志《BIOLOGICAL&PHARMACEUTICAL BULLETIN》的文章《Biotransformation of C-Glucosylisoflavone Puerarin to Estrogenic(3S)-Equolin Co-culture of Two Human Intestinal Bacteria》中虽然菌株能够完全转化葛根素，但菌株无法食用也难以培养，所以并不具有其他附属价值。

3、记载于杂志《Biotechnology and Bioprocess Engineering》的文章《Bioconversion of Isoflavones during the Fermentation of Samso-Eum withLactobacillus Strains》中大多数菌株无法将葛根素转化，即使能够转化的菌株转化率也非常低，仅为5％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。