痰瘀痹阻症痛风患者宏基因组库构建方法、基因库

摘要

本发明为一种痰瘀痹阻症痛风患者宏基因组库构建方法，基于用药前患者微生物宏基因组数据、用药后患者微生物宏基因组数据以及对照微生物宏基因组数据筛选得到差异数据录入宏基因数据库效果。该方法解决了现有方案中不容易发现一致的趋势，不能更精确、显著的表征的问题。本发明通过比较痛风患者用药前后和健康对照，发现筛选了体现病症的一致趋势，是更加有参考价值，更精确、明显的表征。

说明书

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种痰瘀痹阻症痛风患者宏基因组库构建方法、一种痰瘀痹阻症痛风患者宏基因组库和一种用于提供痰瘀痹阻症痛风诊断信息的试剂盒。

背景技术

痛风是一种尿酸盐晶体沉积的代谢性疾病，与慢性高尿酸血症有关。痛风临床实验室指标的研究为高尿酸血症和痛风性关节炎的病理生理学提供了临床见解。研究表明，在痛风的发展过程中，密切相关的尿酸单钠(MSU)晶体可以影响某些免疫细胞、细胞因子和效应分子表达的产生。

宏基因组学与肠道微生物，近年来，也被用于研究关节炎疾病。由于胃肠道消除了三分之一的尿酸负荷，对痛风患者肠道微生物群和代谢异常的研究也受到关注。16年代分析为我们提供了一种方法来调查主要痛风和肠道微生物群之间的关系，然而，我们发现先前的研究痛风患者的肠道微生物，是否使用16srRNA或宏基因组学，仅限于不同的组成和丰富的物种痛风患者和健康对照，不容易发现一致的趋势，无论基因或物种注释或KEGG功能。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种痰瘀痹阻症痛风患者宏基因组库构建方法、一种痰瘀痹阻症痛风患者宏基因组库和一种用于提供痰瘀痹阻症痛风诊断信息的试剂盒。这些方案解决了现有方案中不容易发现一致的趋势，不能更精确、显著的表征的问题。

为实现上述目的，根据本发明的实施例，本发明提供了一种痰瘀痹阻症痛风患者宏基因组库构建方法，基于用药前患者微生物宏基因组数据、用药后患者微生物宏基因组数据以及对照微生物宏基因组数据筛选得到差异数据录入宏基因数据库。

可选地，上述方法，包括如下步骤：

获取步骤：获取痰瘀痹阻症痛风患者宏基因组的初始数据资源，所述初始数据资源包括用药前患者微生物宏基因组数据、用药后患者微生物宏基因组数据以及对照微生物宏基因组数据；

处理步骤：对所述用药前患者微生物宏基因组数据、所述用药后患者微生物宏基因组数据以及所述对照微生物宏基因组数据进行分析，筛选得到差异数据；

存储步骤：依照设置的录入格式将处理后的数据进行存储以得到宏基因数据库。

可选地，对所述用药前患者微生物宏基因组数据、所述用药后患者微生物宏基因组数据以及所述对照微生物宏基因组数据进行分析，筛选得到差异数据，包括：

通过基因丰度谱分别生成所述初始数据资源的物种、KO和通路丰度谱；

通过所述丰度谱，筛选基因和/或物种注释差异和/或KEGG功能差异，得到差异数据。

可选地，所述物种注释差异包括Firmicute、Bacteroidetes一种或多种丰度差异。

可选地，所述物种注释差异包括Desulfitobacterium和Photorhabdus用药前后丰度趋势变化差异。

可选地，KEGG功能差异包括：谷胱甘肽代谢、泛醌和其他萜类醌生物合成、色氨酸代谢和丙酮酸代谢通路任一通路或多种通路用药前后丰度趋势变化差异。

本方法还提供一种由上述的宏基因组学的建库方法得到的宏基因组库。

本方法还提供一种试剂盒，包括：

从分离自受试者粪便中提取DNA；

对提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及通过对PCR的产物与来源于痰瘀痹阻症痛风患者肠道宏基因组库比较并确定所述受试者样品与痰瘀痹阻症痛风患者肠道宏基因组库的相似程度。

可选地，所述比较并确定包括比较并确定来源于选自由Desulfitobacterium和Photorhabdus组成的群组中的一种或多种细菌的丰度。

可选地，其特征在于，所述比较并确定包括比较并确定来源于选自由谷胱甘肽代谢、泛醌和其他萜类醌生物合成、色氨酸代谢和丙酮酸代谢通路组成的群组中一种或多种代谢通路的丰度。

本发明的有益效果：

发明人发现，先前的研究痛风患者的肠道微生物，使用16srRNA或宏基因组学，仅限于不同的组成和丰富的物种痛风患者和健康对照，很少使用的痰瘀痹阻证的痛风患者前后药物研究肠道微生物的变化。如果痰瘀痹阻证的痛风患者之前和之后痛风患者用药分析，和对照组使用健康人同时，它将更清楚地找痰瘀痹阻证的痛风的特定症状对患者的影响。本发明通过比较痛风患者用药前后和健康对照，发现筛选了体现病症的一致趋势，是更加有参考价值，更精确、明显的表征

附图说明

图1：痛风患者的粪便微生物组与健康对照组的比较；

图1A:A-B-对照三个类群在门水平上的物种注释结果；

图1B：A-B-对照三个类群的PCoA，反映了类群间的相似性；

图1C和D：反映alpha多样性的Box图；

图2：A-B-对照组间在属水平上的物种差异统计，ABCD依次代表了A&B&对照、A&B、A&对照和B&对照的组间比较；

图3：两组间KEGG通路富集的气泡图。ABC图分别为两组差异表达基因富集的KEGG通路比较；D～F图分别为两组差异KOs富集的KEGG通路比较。

图4：H组与T组在属属水平上的物种差异统计；

图4A：用药前H组与T组肠道微生物群的变化；

图4B：H组与T组后肠道微生物群的变化；

图4C：H组用药前后肠道微生物群的变化；

图4D：T组用药前后肠道微生物群的变化；

图5：两组中的B：F比值和丰度(log2)变化趋势曲线；左图为下组患者治疗前后B/F比值变化的方框图，右图为治疗前后上组患者B/F比值变化的方框图；

图6：三组菌类在门水平上的物种丰度趋势图；左图为三组A&B&对照对Bacteroidetes和Firmicutes的B/F比值变化的箱形图；左图为三组A&B&对照对Bacteroidetes和Firmicutes的B/F比值变化的箱形图；

图7：A：体检指标与门级种的相关性分析；临床试验指标与门级种的相关性分析；B：临床试验指标与属级种的相关性分析；x轴为临床试验指标，y轴为种名；

图8：A、B组主要焦点种与临床实验室指标交互网络图；A：下组A、B聚焦物种与临床实验室指标的交互图；B：上组A、B聚焦物种与临床实验室指标的交互图。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

下文中，将参考所附附图对本申请进行详细描述，使得本领域技术人员可以容易地实施本发明。然而，本发明可以由很多不同方式实现，而不限于本文描述的示例性具体实施方案。

参考下文中的描述，将会理解本发明的示例性实施方案的目标和优点，并且使本发明的示例性实施方案的目标和优点更加明显，但是本发明的示例性实施方案的目标和优点并不限于以下描述。在示例性实施方案的描述中，当认为对现有技术的详细解释可能会不必要地模糊本发明的重点时，会将这些对现有技术的详细解释省略。

实施例一

样本收集

我们从深圳市中医院招募了30名痛风患者和29名年龄匹配的健康对照组。本研究招募的所有患者均为痛风，其他疾病携带者均排除在本研究之外。发病年份见表S1(6.33±5.58年，平均±SD)。30例痛风患者分别用不同中药H(对应于痰瘀痹阻通风)、T(对应于湿热瘀阻痛风)治疗2周，在治疗前(A)和治疗后(B)采集粪便样本，共取60例。所有被招募的患者，包括痰瘀痹阻症痛风患者、湿热蕴结症痛风患者和健康对照者，都被排除在其他药物治疗之外。其中，痛风患者服药后的抽样标准是痛风症状明显缓解或消失，如痛风患者关节肿胀得到缓解。每个健康对照1份，共29份对照。我们的研究最终共使用了全部89份粪便样本。所有入组人员均已被告知并自愿签署知情同意书，并经深圳中医药医院伦理委员会伦理批准后进行抽样。

宏基因组学文库的构建与测序

从每个样品中提取总DNA并进行质量检查。使用MGIEasyDNA快速文库准备试剂盒(BGI，目录号，1000006985)，按照制造商的说明，使用0.5μg的高质量DNA进行文库构建。简单地说，使用CovarisLE220超声仪(Covaris，Woburn，MA，USA)随机分割DNA，选择200-400bp的DNA片段，用AMPureXP磁珠纯化。选择的DNA片段进行PE指数连接，纯化连接的DNA。将纯化的连接DNA形成环状DNA，随后进行滚动环扩增(RCA)，生成DNA纳米球(DNBs)，然后在DNBSEQ-T1平台上对DNBs进行测序，生成PE100reads。

宏基因组学物种和功能注释

为了获得准确和可靠的结果，低质量的读取过滤获得干净数据SOAPnuke(v1.5.6)，然后将人类宿主污染通过使用领结2(v2.2.5)与90％相似为下游分析生成高质量的清洁数据。然后将每个样本的高质量reads与Bowtie2(v2.2.5)的集成基因目录(IGC，v100064)进行比对，后计算每个样本的基因丰度。同样，我们基于IGC数据库中先前的物种和功能注释，通过基因ID匹配检索蛋白质，获得注释结果，生成物种、KO和通路丰度谱。在生物多样性分析中，通常采用香农指数来评价样品的群落多样性。使用布雷-柯蒂斯距离和Jaccard距离对Beta多样性来测量样本之间的差异。所有的αandβ-多样性统计均采用R软件的“vegan”软件包(v3.6.1)进行。

统计分析

非参数检验方法威尔克森秩和检验克鲁斯卡沃利斯检验差异基因，KO和物种分析，而students t检验和威尔克森秩和检验进行非参数测试两组独立样本和确定两组之间是否有差异，克鲁斯卡沃利斯检验用于检验三组或三组以上样本之间的差异。p值校正通过R包中的p.调整进行，校正方法为“BH”(即berg)。采用Spearman算法对肠道微生物群与临床实验室指标进行相关性分析，只考虑与|r|>0.40和P<0.05的稳健相关性。通过R软件计算并可视化相关性(v3.6.1)。

具体的步骤：

获取步骤：获取痰瘀痹阻症痛风患者宏基因组的初始数据资源，所述初始数据资源包括用药前患者微生物宏基因组数据、用药后患者微生物宏基因组数据以及对照微生物宏基因组数据。

本步骤中，招募了30名痛风患者和29名健康对照组。痰瘀痹阻症痛风患者16例，服用H中药治疗；湿热蕴结症患者14例，服用T中药治疗。每个患者在用药前后采集粪便样本，共获得60份患者粪便样本，包括16份HA和16份HB样本，14份TA和14份TB样本。每个健康对照组均收集1份粪便样本。最终使用89份粪便样本，根据不同的分类标准显示不同组(表1)经过DNA提取、文库构建和测序后，89个样本共生成2.06TB数据，平均每个样本生成22.44GB。经过过滤掉低质量和重复读取后，干净读取Q30约为92.37％，干净数据比大于91.50％(表S1)。这些指标反映了我们的数据是高质量的，足以进行后续的分析。

表1样本编号和群组信息

处理步骤：对所述用药前患者微生物宏基因组数据、所述用药后患者微生物宏基因组数据以及所述对照微生物宏基因组数据进行分析，筛选得到差异数据；

将干净的reads定位到人类肠道微生物组整合基因目录(IGC)(J.Lietal.，2014)，以生成基因丰度图谱。89个样本共有5195879个非冗余基因，平均比较率75.15％，表明我们的数据可以有效的基因集(表S1)我们总结了基因注释的数量门水平和所有基因通过IGC物种注释的结果，发现Firmicutes(54.48％),Bacteroidetes(25.24％),Proteobacteria(12.29％),Actinobacteria(5.40％),Fusobacteria(1.11％)及Verrucomicrobia(0.66％)的比例最高(表S2)。结合之前发表的关于亚洲肠道微生物群的研究，我们发现Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria是最丰富的物种。根据IGC数据库的功能注释结果，通过匹配基因ID检测到9073个KOs。我们通过基因丰度谱生成物种、KO和通路丰度谱，并对组间进行不同的分析。

组间差异的比较：我们计算了门和属两个分类水平上A、B和对照的相对丰度。其中，基因比例最高的Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria在三组中仍然最为丰富(图1A和表S2)。PCoA(主坐标分析)常用于微生物β-多样性分析，通过输入样本相似度距离表。我们发现A组和B之间的区别并不大，A组之间的区别和反对或组B组和反对之间更明显的比较组A和B和反对(图1B)，表明痛风患者的肠道和非痛风患者的菌群是不同的，但对肠道微生物群药物前后并不显著。在α多样性分析的箱形图中，我们发现A组与B组之间差异不显著，但A组与B组的基因丰富度显著低于对照(对照)组，而shannon-指数没有显著结果(图1C，D)。说明痛风患者(A组和B组)的肠道微生物群多样性低于健康对照组(对照组)。

考虑到时间积累的影响，肠道微生物群的变化需要一个过程，我们的治疗之间的间隔约为两周，这可能会影响差异微生物的丰度。我们比较了不同组间的微生物种类、基因、KO和通路丰度，以检测痛风患者与健康组之间的变化。通过分别比较两组间存在显著差异的物种，我们发现A组vs对照组在门水平上的物种差异明显高于B组vs对照组(图2A)。其中，Proteobacteria在A组与对照差异有显著性意义，而B组与对照差异无显著性意义。虽然Proteobacteria在A组和B组中不显著，但其丰度在处理前后都发生了变化(图2A)。虽然A组和B组在门水平上没有明显的种种差异，但我们检测到了一些显著不同的属(图2B)。我们可以清楚地看到，这些差异集中在Proteobacteria，在A组较多，在B组较少。

同时，我们计算了三组间微生物基因丰度和KO丰度的差异，然后利用差异基因或KOs进行通路富集分析。基于差异表达基因(DEGs)每两组之间，经过对比发现，无论是用药前的A组与对照组相比，还是用药后的B组与对照组相比，其差异表达基因的数量都多于用药前后(A vs B)的比较，说明痛风患者与健康对照间的微生物菌群差异巨大(图3)。根据结果显示，在谷胱甘肽代谢、泛醌和其他萜类醌生物合成、色氨酸代谢和丙酮酸代谢等通路的基因在A组和B组之间显著差异。

此外，当我们比较用药前组vs对照与用药后组vs对照的差异表达通路时，发现有45条显著差异通路重合，包括代谢通路、次生代谢物的生物合成、抗生素的生物合成和氨基酸的生物合成(图3)。用药前后检测A/B两组差异发现，谷胱甘肽代谢通路等通路显著差异(图3)参与谷胱甘肽代谢的谷氨酸不仅是克雷布斯循环的主要代谢物，是尿酸合成的前体，还抑制谷氨酸-胱氨酸抗转运系统，导致细胞内谷胱甘肽水平显著降低。作为谷胱甘肽代谢相关基因，A组和B组的平均值分别为0.005803和0.011429，可以推测痛风患者治疗前后谷胱甘肽代谢水平改变。

此外，我们还试图寻找H治疗组和T治疗组之间的不同种类。属相对丰度结果显示，H治疗患者和T治疗患者之间的微生物组成相似，在T和H组治疗前后，我们没有发现显著差异是否TA和TB或HA和HB。在不同种类的物种检测中，在门水平上，T组中Verrucomicrobia的丰度显著高于H组(图4A)。在属水平上，T组中Firmicutes门的Butyrivibrio,Abiotrophia,Streptococcus和Bacillus，以及Verrucomicrobia门的Akkermansia含量明显高于H组。H组的Desulfitobacterium和Photorhabdus数量多于T组(图4B)。属的数量有显著差异(P值≤0.05)，T组明显超过H组，这是完全符合患者的表型，T组的患者有更多的急性发作和更明显的炎症反应比H组的患者。为了排除年龄指标的干扰，我们还对所有患者和所有对照组样本进行了差异统计学分析，通过t-检验(p-value>0.05)发现两组间差异无统计学意义。

离岸比率的变化

B：F比值已被报道为评估炎症的有效标准(比较，罗、桑帕雷利，2016；M.Liu等人，2018年)。同样，我们使用B/F比值来评估治疗前后对肠道菌群组成和丰度的影响。统计6个门用药前后的上调和下调表达以及B：F比值的变化(表S3)，对相同上调和下调的样本进行筛选后，最终将其分为两种类型(表S3)。.

通过构建下组和上组的B/F比值的箱线图，我们发现下组的A和B的变化趋势与上组正好相反(图5)。对下组和上组分别进行A-B-对照组的比较，发现Bacteroidetes和Firmicutes分布趋势较为明显。Bacteroidetes从A_向下组到B_down组下降，从B_down组到对照组增加(图6)。而对于Firmicutes，则有相反的趋势，从A_向下组到B_down组增加，从B_down组到对照组下降(图6)。从下组的结果可以发现，治疗前和对照组的Bacteroidetes和Firmicutes的丰度是一致的，并且在治疗后发生了变化。但在上组中，治疗后患者和对照组患者的Bacteroidetes和Firmicutes的丰度没有明显变化。除Bacteroidetes和Firmicutes外，还研究了Actinobacteria,Fusobacteria,Proteobacteria,Verrucomicrobia等4个门的趋势。

体检指标与菌种的相关性分析

基于获得的24个人的临床实验室指标(表S4)，相关分析进行医学检查指数和显著不同的物种(图7)，以及交互网络构建显著不同的物种和临床实验室指标组A_down和B_down(图8)和组A_up和B_up(图8B)。从交互网络图中发现，有一些有趣的关联，上组的物种与临床实验室指标之间的关联比下组强，Bacteroides与尿酸和Cr均呈明显正相关，均与痛风显著相关，但下组不相关，Akkermansia,Bifidobacterium,Clostridium,Haemophilus,Rhodococcus,Ruminococcus和Phascolarctobacterium在上下组中存在相似的关联(图8)。此外，有五个物种包括Bacteroides,Bifidobacterium,Clostridium,Haemophilus和Phascolarctobacterium在上组与尿素氮有明显相关性，而在下组则无相关性，而Akkermansia,Rhodococcus和Ruminococcus在上组和下组中具有相似的相关性。(图8)。

存储步骤：依照设置的录入格式将处理后的数据进行存储以得到宏基因数据库。

上述并未列出所有可能的应用情况。下面表格是实施例1的实验数据。TableS1A实施例每例样本具体测序数据信息

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TableS1B实施例每例样本临床数据信息

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TableS2不同组菌群丰度

TableS3关键菌群用药前后表达量变化

TableS4关键菌群与临床指标关联

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。/>