小鼠胚胎干细胞培养液及诱导培养两种不同类型的胚胎干细胞系和类囊胚的方法

摘要

本发明公开了一种小鼠胚胎干细胞培养液、胚胎干细胞体外诱导培养方法、以及利用该培养液和培养方法，首次从3‑4天的小鼠囊胚建立两种不同类型胚胎干细胞系，进一步利用这两种类型的干细胞系，体外诱导获得类囊胚结构。这种来源于同一个囊胚的两种细胞系聚合获得的类囊胚排除了不同个体细胞之间的免疫排斥反应，为人类干细胞的临床应用和药物筛选提供理论依据和技术支撑。该方法制备的小鼠两种不同类型的胚胎干细胞和类囊胚能用于基因编辑、动物克隆、医学模型和药物筛选研究等领域。

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域、发明的类囊胚结构涉及药理学研究领域，特别涉及一种小鼠胚胎干细胞培养液及诱导培养两种不同类型的胚胎干细胞系和类囊胚的培养方法。

背景技术

胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ESCs)是由早期胚胎诱导培养获得的具有体外无限增殖、自我更新能力和多向分化的特性的细胞系。目前ESCs成为细胞治疗、体外类器官再生和高效基因编辑等领域细胞原料，具有广泛的生命科学基础研究和潜在的生物医学应用价值。哺乳动物胚胎干细胞研究开始于上世纪八十年代初，目前已成功获得小鼠、大鼠、猪、人类和牛等不同物种的胚胎干细胞系。2006年，由Takahashi和Yamanaka建立了成体细胞向诱导多能干细胞的诱导技术，获得了2012年诺贝尔生理医学奖。我国科研团队在小鼠、大鼠、人类、猪和牛等干细胞研究领域取得了多项世界领先水平的研究成果。

虽然干细胞研究取得了多项突破性进展，但是胚胎干细胞多能性维持的精确调控机制仍需进一步深入研究。而且目前具有高发育潜能的ESCs多数培养在含有饲养层细胞或含有动物血清的体外培养条件下培养。由于饲养层细胞可分泌多种复杂的生长因子，动物血清成分更为复杂，因此很难确定哪些因子对胚胎干细胞多能性维持起关键的作用。除此之外，一个囊胚只能建立一种类型的胚胎干细胞系，但是囊胚包含三种不同类型的细胞，因此如果想建立三种不同类型的胚胎干细胞系，至少需要利用三种不同的培养液和三个囊胚。

因此，提供一种小鼠干细胞培养液，从同一个囊胚建立不同类型的胚胎干细胞系的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种小鼠胚胎干细胞培养液及诱导培养两种不同类型的胚胎干细胞系和类囊胚的培养方法，小鼠胚胎干细胞培养液，首次从小鼠同一个囊胚诱导培养出两种不同类型的胚胎干细胞系，再利用这两种类型的胚胎干细胞系诱导获得了小鼠类囊胚结构。

为了解决上述技术问题，本发明的一种小鼠胚胎干细胞诱导培养液，其特征在于：包括以下组分：每500ml诱导培养液含激活素A+CHIR99021+白血病抑制因子的组成为：

余量由基础培养液补充，

所述基础培养液为基础培养液DMEM/F12和基础培养液Neurobasal，二者体积比为1:1。

优选，每500ml诱导培养液含激活素A+CHIR99021+白血病抑制因子的组成为：

一种利用小鼠胚胎干细胞诱导培养液从小鼠同一个囊胚建立两种不同类型胚胎干细胞系的诱导培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)取受精后3-4天的小鼠囊胚，去除透明带后用小鼠胚胎干细胞诱导培养液，在37℃、5％ CO

(2)培养5-7天后胚胎细胞长出200μm左右的圆形细胞克隆和圆形细胞克隆周围的扁平细胞；

(3)利用玻璃针和口吸管把圆形细胞克隆挑出来，把两种形态的细胞克隆分开培养；

(4)继续培养后建系，获得同一个囊胚来源的两种类型的胚胎干细胞系，即圆形形态的细胞成为ACL-ESCs细胞系，扁平形态的细胞成为ACL-XEN细胞系。

所述从小鼠同一个囊胚建立两种不同类型胚胎干细胞系的诱导培养方法，其特征在于：所述小鼠的品系选自129品系小鼠、C57BL/6品系小鼠、B6D2F1杂交品系小鼠或DBA/2品系小鼠。

一种利用得到的所述ACL-ESCs细胞系和ACL-XEN细胞系在体外诱导建立类囊胚的应用方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)先将ACL-ESCs细胞系和ACL-XEN细胞系进行计数后细胞数量以1:5的比例混合、细胞总数为1×10

(2)然后接种于抗贴壁处理的24孔板中；

(3)在37℃、5％ CO

(4)培养3-5天后培育获得胚胎干细胞来源的类囊胚结构。

所述从小鼠同一个囊胚建立的两种不同类型的胚胎干细胞系在体外诱导建立类囊胚的应用方法，其特征在于：每500ml类囊胚诱导培养液组成为：

本发明的有益效果是：

(1)提供一种化学成分明确的含激活素A+CHIR99021+白血病抑制因子的小鼠胚胎干细胞培养液。

(2)利用小鼠胚胎干细胞诱导培养液，首次从小鼠同一个囊胚诱导培养出两种不同类型的胚胎干细胞系，一种是具有高发育潜能的干细胞系(ACL-ESCs)，另一种是具有发育为胚外内胚层特性的干细胞系(ACL-XEN细胞)；两种胚胎干细胞，具有多能性、安全性、能在体外稳定传代。

(3)ACL-ESCs和ACL-XEN细胞系能贡献嵌合体胚胎组织分化。

(4)利用ACL-ESCs和ACL-XEN细胞系，在类囊胚诱导培养液条件下悬浮培养获得了小鼠类囊胚结构；这种来源于同一个囊胚的两种细胞系聚合获得的类囊胚排除了不同个体细胞之间的免疫排斥反应，为人类干细胞的临床应用和药物筛选提供理论依据和技术支撑。

(5)该方法制备的小鼠两种不同类型的胚胎干细胞和类囊胚能用于基因编辑、动物克隆、医学模型和药物筛选研究等领域。

附图说明

图1是本发明所述的小鼠胚胎干细胞ACL-ESCs及建系流程图片。

图2是本发明所述的小鼠胚胎干细胞ACL-XEN细胞及建系流程图片。

图3是本发明所述的小鼠胚胎干细胞ACL-ESCs和ACL-XEN细胞中代表性多能性蛋白的免疫荧光染色结果图片。

图4是本发明所述的小鼠胚胎干细胞ACL-ESCs和ACL-XEN细胞嵌合体胚胎贡献能力检测图片。

图5是本发明所述的小鼠胚胎干细胞ACL-ESCs和ACL-XEN细胞共同培养获得类囊胚的技术流程和实验结果图片。

具体实施方式

实施例1：小鼠胚胎干细胞诱导培养液的配置方法

一种小鼠胚胎干细胞诱导培养液，每500ml诱导培养液含激活素A(Activin A)+CHIR99021(WNT通路激活剂)+白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的组成为：2-3ml N2细胞培养添加剂、4-6ml B27细胞培养添加剂、20-30mg牛血清白蛋白、4-6ml非必需氨基酸、4-6ml左旋谷氨酰胺、0.5-2mlβ巯基乙醇、4-5ml青霉素链霉素、20.0ng/mlActivin A、3.0μM CHIR99021、500-1500U/ml LIF、余量由基础培养液补充；所述基础培养液为基础培养液DMEM/F12和基础培养液Neurobasal，二者体积比为1:1。

优选于，每500ml诱导培养液N2B27+激活素A(Activin A)+CHIR99021+白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的组成为：238.0ml基础培养液DMEM/F12、238.0ml基础培养液Neurobasal、2.5ml N2细胞培养添加剂、5.0ml B27细胞培养添加剂、25.0mg牛血清白蛋白、5.0ml非必需氨基酸、5.0ml左旋谷氨酰胺、1.0mlβ巯基乙醇、5.0ml青霉素链霉素、20.0ng/ml Activin A、3.0μM CHIR99021、1000U/ml LIF。该培养液被命名为ACL培养液。

实施例2：ACL-ESCs和ACL-XEN细胞的建系和传代培养方法，包括以下步骤：

1.两种不同类型小鼠胚胎干细胞系建立的准备

材料来源：取与Oct4-DPE-GFP(GOF/GFP)转基因雄性小鼠交配成功的129/sv雌性小鼠第3-4天子宫，用M2冲出质量良好的囊胚，使用台式酸去除透明带后，M2清洗三遍，胚胎接种至实施例1的小鼠胚胎干细胞诱导培养液中，使用纤维连接蛋白预处理的24孔板，在37℃、5％ CO

2.ACL-ESCs细胞系的建立

(1)在第3天后，用小鼠胚胎干细胞诱导培养液隔天换液。

(2)当培养第7-9天时显示GFP阳性绿色荧光蛋白信号的半球状克隆直径达200μm左右，用玻璃针将其挑取后切成小块进行2-3次机械传代。

(3)从第3-4代开始，克隆用Accutase进行消化传代，细胞接种到实施例1的小鼠胚胎干细胞诱导培养液中，使用纤维连接蛋白预处理的24孔板，在37℃、5％ CO

3.ACL-XEN细胞系的建立

(1)将呈三维穹顶半球状的GFP阳性克隆挑取后，第10-12天，培养皿中剩余的GFP阴性细胞形成的扁平上皮状细胞用TrypLE消化成单细胞，接种到纤维连接蛋白预处理的24孔板中，用实施例1的小鼠胚胎干细胞诱导培养液继续在37℃、5％ CO2浓度条件下培养。

(2)细胞集落汇合率达80-90％时，每2-3天传代一次。这些形态呈扁平上皮状且GFP阴性细胞被命名为ACL-XEN，可以进行自我更新35代以上，详见图2。

4.两种不同类型小鼠胚胎干细胞系ACL-ESCs和ACL-XEN细胞的冻存

ACL-ESCs和ACL-XEN细胞冷冻保存液组成为：90％的血清替代物添加10％的二甲基亚砜，每管冻存细胞密度为每毫升5-10万个细胞。将状态良好的ACL-ESCs和ACL-XEN细胞样本放置于程序性降温盒(程序性降温盒添加规定体积的异丙醇)，转移到-80℃冰箱24h后，将细胞转移到液氮罐中长期保存。

实施例3：ACL-ESCs和ACL-XEN细胞的多能性检测方法

利用免疫荧光染色方法检测ACL-ESCs和ACL-XEN细胞中多能性及谱系相关蛋白水平，检测结果显示，ACL-ESCs中多能性蛋白OCT4和NANOG具有较高的表达，检测结果详见图3；ACL-XEN细胞中内胚层发育相关蛋白GATA4和SOX17具有较高的表达，检测结果详见图3。

实施例4：ACL-ESCs和ACL-XEN细胞嵌合体胚胎贡献能力检测方法

嵌合体胚胎体外培养液配方如下：每500ml嵌合胚胎体外培养液组成为：250.0mlKSOM胚胎培养基(购自Millipore，货号：MR-101)、119.0ml基础培养液DMEM/F12(购自Gibco，货号：11320-033)、119.0ml基础培养液Neurobasal(购自Gibco，货号：21103-049)、1.25ml N2细胞培养添加剂(购自Gibco，货号：17502-048)、2.5ml B27细胞培养添加剂(购自Gibco，货号：17504-044)、12.5mg牛血清白蛋白(购自Sigma，货号：A3311)、2.5ml非必需氨基酸(购自Gibco，货号：11140-035)、2.5ml左旋谷氨酰胺(购自Gibco，货号：35050-061)、0.5mlβ巯基乙醇(购自Gibco，货号：21985-023)、2.5ml青霉素链霉素(购自Sigma，货号：010M0650)、20.0ng/mL Activin A(购自R&D Systems,货号：338-AC)、3.0μM CHIR99021(购自Miltenyi Biotec，货号：130-103-926)、1000U/ml白血病抑制因子LIF(购自Millipore，货号：ESG1106)。

1.ACL-ESCs的嵌合体胚胎贡献能力检测方法

将8-12个转染H2B tdTomato的ACL-ESCs细胞注入到小鼠8-细胞期胚胎中，随后将嵌合体胚胎培养于KSOM胚胎培养基或嵌合体胚胎体外培养液中,在37℃、5％ CO

2.ACL-XEN细胞的嵌合体胚胎贡献能力检测方法

将8-12个转染H2B tdTomato的ACL-XEN细胞注入到小鼠8-细胞期胚胎中，随后将嵌合体胚胎培养于KSOM胚胎培养基或嵌合体胚胎体外培养液中,在37℃、5％ CO

实施例5：利用ACL-ESCs和ACL-XEN细胞制备类囊胚的方法

1.类囊胚诱导培养液配方

每500ml类囊胚诱导培养液组成为：250.0ml KSOM胚胎培养基(购自Millipore，货号：MR-101)、N2细胞培养添加剂(购自Gibco，货号：17502-048)、119.0ml基础培养液DMEM/F12(购自Gibco，货号：11320-033)、119.0ml基础培养液Neurobasal(购自Gibco，货号：21103-049)、2.5ml N2细胞培养添加剂(购自Gibco，货号：17502-048)、5.0ml B27细胞培养添加剂(购自Gibco，货号：17504-044)、25.0mg牛血清白蛋白(购自Sigma，货号：A3311)、5.0ml非必需氨基酸(购自Gibco，货号：11140-035)、5.0ml左旋谷氨酰胺(购自Gibco，货号：35050-061)、1.0mlβ巯基乙醇(购自Gibco，货号：21985-023)、5.0ml青霉素链霉素(购自Sigma，货号：010M0650)、20.0ng/ml Activin A(购自RD systems，货号：338-AC)、3.0μMCHIR99021(购自Miltenyi Biotec，货号：130-103-926)、1000U/ml LIF(购自Millipore，货号：ESG1106)。

2.类囊胚诱导方法

(1)把消化成单细胞悬液的ACL-ESCs和ACL-XEN细胞按照1：5比例混合，细胞总数为1×10

(2)混匀好的细胞接种到防粘附处理的24孔板里，用上述类囊胚诱导培养液进行悬浮培养，转入37℃、5％ CO

(3)类囊胚诱导培养液隔天进行换液，培养3-5天后培育获得ACL-ESCs和ACL-XEN细胞来源的类囊胚结构，详见图5。

以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即，所有这些通过对本发明提供的系统进行相类似的改动或变更与重新组合，都被视为在本发明的保护范围和内容中。