一种鉴定水稻育性恢复基因Rf4单倍型的SNP分子标记及其在恢复水稻育性中的应用

摘要

本发明公开了一种鉴定水稻育性恢复基因Rf4单倍型的SNP分子标记及其在恢复水稻育性中的应用。本发明发现了水稻野败型细胞质雄性不育育性恢复基因Rf4存在拷贝数变异和序列碱基变异，共存在7种等位基因型序列，8种单倍型，其中包括5种单拷贝单倍型：rf4j，rf4i，rf4aus，Rf4aI，和Rf4bM，以及3种双拷贝单倍型：Rf4aI‑rf4b、rf4a‑Rf4bM和Rf4aM‑Rf4bM。本发明基于这些等位基因型序列及SNP变异，开发了一套分子标记，实现筛选和鉴定水稻品种目的，筛选含有Rf4aM‑Rf4bM双拷贝单倍型的强恢复力水稻，通过与不育系杂交，加速强恢复力恢复系的选育和鉴定。

说明书

技术领域

本发明涉及作物分子遗传育种技术领域，具体地，涉及一种鉴定水稻育性恢复基因Rf4单倍型的SNP分子标记及其在恢复水稻育性中的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa)是世界超半数人口的主粮作物，为全球粮食安全做出了突出贡献。水稻细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)和育性恢复(fertilityrestorer,Rf)种质的发现和应用，是实现“三系”杂交稻生产的核心遗传材料，成为作物杂种优势利用的典范，并大幅提高了水稻产量。“三系”杂交稻利用的CMS/Rf育性控制遗传系统类型主要有三类：野败型(Wild Abortive,CMS-WA/Rf3Rf4)，包台型(BoroⅡ,CMS-BT/Rf1aRf1b)和红莲型(Hong-Lian,CMS-HL/Rf5Rf6)，其中90％的“三系”杂交稻采用基于CMS-WA/Rf3Rf4育性控制遗传系统。

CMS-WA/Rf3Rf4育性控制遗传系统由位于线粒体基因组的不育基因WA352和位于核基因组的主效恢复基因Rf3与Rf4构成。Rf4已被克隆(Tang等,The rice restorer Rf4for Wild abortive cytoplasmic male sterility encodes a mitochondrial-localized PPR protein that functions in reduction of WA352transcripts.Molecular Plant,2014,7:1497-1500.)，它编码一个含有782个氨基酸的PPR(pentatricopeptide repeat)蛋白，Rf4蛋白通过降解WA352的mRNA而行使恢复育性的功能。已报道Rf4存在多个等位基因，其中包括恢复系的显性(功能型)Rf4，籼稻不育系或保持系的隐性(非功能型)rf4i和粳稻的隐性rf4j三大类型(Tang等,The rice restorer Rf4for Wild abortive cytoplasmic male sterility encodes a mitochondrial-localized PPR protein that functions in reduction of WA352transcripts.Molecular Plant,2014,7:1497-1500.)。近年来，分子标记辅助选择育种已得到广泛的推广和应用。已报道用于辅助选择育种的Rf4分子标记都是与Rf4有一定遗传距离的连锁标记，只能判别显性Rf4和隐性rf4等位基因型，不能鉴别不同的显性Rf4单倍型的种质材料，不利于高效选育强恢复系。目前，尚无位于Rf4基因座位内及基因编码区内并能鉴别不同的显性Rf4单倍型的有效分子标记的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的上述不足，发现了细胞质雄性不育水稻的育性恢复基因Rf4是由a和b两个子座位构成的复合座位，存在拷贝数变异和序列碱基变异，共存在7种等位基因型序列，本发明基于这些等位基因型序列及其单碱基多态性(SNP)变异，开发了一套差异的PCR特异扩增分子标记，提供一种鉴定水稻育性恢复基因Rf4单倍型的SNP分子标记及其在恢复水稻育性中的应用。

本发明的第一个目的是提供检测水稻基因组中SNP位点的试剂的应用。

本发明的第二个目的是提供一种鉴别或辅助鉴别水稻品种、检测任意两个水稻的相似性和/或鉴定水稻育性的成套PCR试剂。

本发明的第三个目的是提供含有所述的PCR试剂的试剂盒。

本发明的第四个目的是提供所述的试剂盒在鉴别或辅助鉴别水稻品种、检测任意两个水稻的相似性和/或鉴定水稻育性中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种提高水稻野败型细胞质雄性不育育性恢复能力的方法。

本发明的第六个目的是提供一种构建对野败型细胞质雄性不育具有高育性恢复能力水稻的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

检测水稻基因组中SNP位点的试剂在如下任何一种中的应用：

鉴别或辅助鉴别水稻品种；

检测任意两个水稻的相似性；

鉴定水稻育性；

所述SNP位点如下：

所述SNP位点1位于Rf4基因所在的水稻第10染色体的第21058519位碱基，为T或A；

所述SNP位点2位于Rf4基因所在的水稻第10染色体的第21058518位碱基，为G或C；

所述SNP位点3位于Rf4基因所在的水稻第10染色体的第21058193位碱基，为A或T；

所述SNP位点4位于Rf4基因所在的水稻第10染色体的第21058190位碱基，为C或T；

所述SNP位点5位于Rf4基因所在的水稻第10染色体的第21058560位碱基，为A或T；

所述SNP位点6位于Rf4基因所在的水稻第10染色体的第21058559位碱基，为T或C；

所述SNP位点7位于Rf4基因所在的水稻第10染色体的第21058745位碱基，为T或A；

所述SNP位点8位于Rf4基因所在的水稻第10染色体的第21058435位碱基，为A或G；

所述SNP位点9位于Rf4基因所在的水稻第10染色体的第21058942位碱基，为A或G；

所述SNP位点10位于Rf4基因所在的水稻第10染色体的第21058935位碱基，为G或T；

所述SNP位点11位于Rf4基因所在的水稻第10染色体的第21058931位碱基，为G或A；

所述SNP位点12位于Rf4基因所在的水稻第10染色体的第21058924位碱基，为T或C；

所述SNP位点13位于Rf4基因所在的水稻第10染色体的第21059126位碱基，为A或C；

所述SNP位点14位于Rf4基因所在的水稻第10染色体的第21058070位碱基，为C或T；

所述SNP位点15位于Rf4基因所在的水稻第10染色体的第20978195位碱基，为A或G；

所述SNP位点16位于Rf4基因所在的水稻第10染色体的第20977909位碱基，为A或G；

所述SNP位点17位于Rf4基因所在的水稻第10染色体的第20977907位碱基，为T或G；

所述SNP位点18～23位于Rf4基因所在的水稻第10染色体的第21055894～21055889位碱基，为GGAATA或TCGCAC；

所述SNP位点24～26位于Rf4基因所在的水稻第10染色体的第21055647～21055645位碱基，为TGT或CGC。

所述Rf4基因所在的水稻第10染色体在GenBank上的编号为CP018166.1。

优选地，所述检测水稻基因组中的SNP位点的试剂包含核苷酸序列如SEQ ID NO：8～23所示的引物组合的任意一条或几条的组合。

优选地，所述SNP位点1的碱基为T，SNP位点2的碱基为G，SNP位点3的碱基为A且SNP位点4的碱基为C，则水稻的细胞质雄性不育恢复基因Rf4座位为rf4j单拷贝单倍型，水稻品种即为9522、IRGC 125981、IRGC 128077、IRGC 128086、IRGC 128314、IRGC 128360、IRGC128467、IRGC 131964、IRGC 131968、IRGC 132274、IRGC 132278、IRGC 132307、IRGC132339、IRGC 132345、中花11、台中65、日本晴和秀水中的一种或几种；

所述SNP位点5的碱基为A且SNP位点6的碱基为T，则Rf4座位为rf4i单拷贝单倍型，水稻品种即为1209A、843A、9311、D62A、D62B、E农13、F32A、F32B、F59A、F59B、IR64、IRGC125858、IRGC 126249、IRGC 127056、IRGC 127268、IRGC 127698、IRGC 127725、IRGC128041、IRGC 128335、IRGC 132315、IRGC 132364、R211、R286、中恢7259、中恢7265、冈46A、冈46B、华A、华B、双桂A、宜香1A、宜香1B、川农1B、川农3A、川农3B、巨2A、广恢128、广泰A、昌恢121、昌农1A、桂华占、沪旱1A、沪旱1B、沪旱7A、沪旱7B、泰丰A、珍汕97A、珍汕97B、蓉7A、蜀6A、蜀8B、蜀9A、西农1A、西农1B、西大2A、西大2B、西大5A、西大5B、赣香73A、赣香73B、赣香A、赣香B、金23A、金23B、长粳1B和靓占中的一种或几种；

所述SNP位点7的碱基为T且SNP位点8的碱基为A，则Rf4座位为rf4aus单拷贝单倍型，水稻品种即为Albania、CISOKAN、IRGC 128344、IRGC 128317、八香和杂草稻13中的一种或几种；

所述SNP位点14的碱基为C，SNP位点15的碱基为A，SNP位点16的碱基为A且SNP位点17的碱基为T，则Rf4座位为Rf4a

所述SNP位点14的碱基为C，SNP位点18～23的碱基为GGAATA且SNP位点24～26的碱基为TGT，则Rf4座位为Rf4b

所述SNP位点14的碱基为C，SNP位点15的碱基为A，且SNP位点16的碱基为A，且SNP位点17的碱基为T；SNP位点18～23的碱基为GGAATA，SNP位点24～26的碱基为TGT，则Rf4座位为Rf4a

所述SNP位点13的碱基为A，所述SNP位点14的碱基为C，SNP位点15的碱基为A，且SNP位点16的碱基为A，且SNP位点17的碱基为T；SNP位点18～23的碱基为GGAATA，SNP位点24～26的碱基为TGT，则Rf4座位为Rf4a

所述SNP位点9的碱基为A，所述SNP位点10的碱基为G，所述SNP位点11的碱基为G，所述SNP位点12的碱基为T，所述SNP位点13的碱基为A，所述SNP位点14的碱基为C，SNP位点15的碱基为A，且SNP位点16的碱基为A，且SNP位点17的碱基为T；SNP位点18～23的碱基为GGAATA，SNP位点24～26的碱基为TGT，则Rf4座位为rf4a-Rf4b

所述Rf4座位为rf4j、rf4i或rf4aus单拷贝单倍型的水稻为非恢复系；

所述Rf4座位为Rf4a

一种细胞质雄性不育恢复基因Rf4座位为rf4j单拷贝单倍型的水稻，所述SNP位点1的碱基为T，SNP位点2的碱基为G，SNP位点3的碱基为A且SNP位点4的碱基为C。

一种细胞质雄性不育恢复基因Rf4座位为rf4i单拷贝单倍型的水稻，所述SNP位点5的碱基为A且SNP位点6的碱基为T。

一种细胞质雄性不育恢复基因Rf4座位为rf4aus单拷贝单倍型的水稻，所述SNP位点7的碱基为T且SNP位点8的碱基为A。

一种细胞质雄性不育恢复基因Rf4座位为Rf4a

一种细胞质雄性不育恢复基因Rf4座位为Rf4b

一种细胞质雄性不育恢复基因Rf4座位为Rf4a

一种细胞质雄性不育恢复基因Rf4座位为Rf4a

一种细胞质雄性不育恢复基因Rf4座位为rf4a-Rf4b

一种鉴别或辅助鉴别水稻品种、检测任意两个水稻的相似性和/或鉴定水稻育性的成套PCR试剂，由PCR试剂1、PCR试剂2、PCR试剂3、PCR试剂4、PCR试剂5、PCR试剂6、PCR试剂7和PCR试剂8组成；

所述PCR试剂1包括所述核苷酸序列如SEQ ID NO：8～9所示的引物组合；

所述PCR试剂2包括所述核苷酸序列如SEQ ID NO：10～11所示的引物组合；

所述PCR试剂3包括所述核苷酸序列如SEQ ID NO：12～13所示的引物组合；

所述PCR试剂4包括所述核苷酸序列如SEQ ID NO：14～15所示的引物组合；

所述PCR试剂5包括所述核苷酸序列如SEQ ID NO：16～17所示的引物组合；

所述PCR试剂6包括所述核苷酸序列如SEQ ID NO：18～19所示的引物组合；

所述PCR试剂7包括所述核苷酸序列如SEQ ID NO：20～21所示的引物组合；

所述PCR试剂8包括所述核苷酸序列如SEQ ID NO：22～23所示的引物组合。

含有所述的PCR试剂的试剂盒。

所述的试剂盒在鉴别或辅助鉴别水稻品种、检测任意两个水稻的相似性和/或鉴定水稻育性中的应用。

一种提高水稻野败型细胞质雄性不育育性恢复能力的方法，使水稻恢复基因Rf4座位携带Rf4a

优选地，用所述的试剂盒鉴别出Rf4座位为Rf4a

所述不育系为所述的试剂盒鉴别出水稻的Rf4座位为rf4i单拷贝单倍型；

所述rf4i单拷贝单倍型为：所述SNP位点5的碱基为A且SNP位点6的碱基为T。

一种构建对野败型细胞质雄性不育具有高育性恢复能力水稻的方法，使水稻细胞质雄性不育恢复基因Rf4座位为Rf4a

优选地，用所述的试剂盒鉴别出Rf4座位为Rf4a

所述不育系为所述的试剂盒鉴别出水稻的Rf4座位为rf4i单拷贝单倍型；

所述rf4i单拷贝单倍型为：所述SNP位点5的碱基为A且SNP位点6的碱基为T。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种鉴定水稻育性恢复基因Rf4单倍型的SNP分子标记及其在恢复水稻育性中的应用。本发明通过对165份水稻的Rf4座位及基因编码区的序列比对，发现了水稻野败型细胞质雄性不育育性恢复基因Rf4是由a和b两个子座位构成的复合座位，存在拷贝数变异和序列碱基变异，在栽培稻共存在7种等位基因型序列，共有8种单倍型，其中包括5种单拷贝单倍型：rf4j，rf4i，rf4aus，Rf4a

附图说明

图1为在3种水稻的Rf4座位(位于第10染色体)基因组结构变异示意图。灰色背景表示此区间的其它PPR基因，黑色背景表示功能型的Rf4基因型，白色背景表示无功能的rf4基因型。

图2为A为功能型Rf4(包括Rf4a

图3为Rf4不同基因型的功能验证示意图。CMS-WA不育系J23A为转化受体，花粉表型为全不育。其中不同的rf4基因型的转化体(t表示转基因)均表现为花粉败育，Rf4(Rf4a

图4为Rf4座位等位基因特异分子标记鉴定不同栽培稻材料中基因型和单倍型示意图。图4A中的水稻材料含有单拷贝的隐性rf4等位基因(rf4j、rf4i或rf4aus)。图4B中的水稻材料含有单拷贝的显性Rf4，它们构成的单倍型为rf4a-Rf4b

图5为使用不同的Rf4近等基因系验证Rf4对育性恢复的剂量效应。其中图5A为J23A×ZSRf4I(WA352/rf4iRf4a

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 Rf4座位的基因组结构变异分析及单倍型鉴定和功能分析

一、实验方法

CMS-WA为水稻野败型细胞质雄性不育，其基于CMS-WA/Rf3Rf4育性控制遗传系统，CMS-WA/Rf3Rf4育性控制遗传系统由位于线粒体基因组的不育基因WA352和位于核基因组的主效恢复基因Rf3与Rf4构成。Rf4编码一个含有782个氨基酸的PPR(pentatricopeptiderepeat)蛋白。Rf4存在多个等位基因，其中包括恢复系的显性(功能型)Rf4，籼稻不育系或保持系的隐性(非功能型)rf4i和粳稻的隐性rf4j三大类型。

1、Rf4座位的基因组结构变异分析

根据恢复基因Rf4(恢复系)，及其等位基因rf4j(粳稻)和rf4i(不育系和保持系，翻译提前终止)的序列和水稻品种明恢63(MH63)、日本晴(Nip)和珍汕97(ZS97)的Rf4座位及其侧翼序列的比对和分析，发现Rf4座位存在结构变异。

明恢63(MH63)为籼稻恢复系；日本晴(Nip)为粳稻品种；珍汕97(ZS97)为籼稻不育系或保持系。

MH63中含有双拷贝Rf4，分别命名为a拷贝和b拷贝(或称为Rf4a和Rf4b子座位)，其编码区序列相同但远端上、下游序列不同；Nip含有位于a座位的单拷贝的rf4j；ZS97含有位于a座位的单拷贝的rf4i，其中rf4i为序列插入形成的截断假基因(提前出现终止密码子)(图1)。

2、Rf4座位的等位基因变异和单倍型鉴定及功能分析

根据Rf4基因a和b拷贝序列的SNP差异，设计引物STI-Rf4-F，STI-Rf4a-R(分别简写为F，a-R)，STI-Rf4b-R(简写为b-R)，rf4i-F1，rf4i-R1(分别简写为i-F1，i-R1)，R/rf4-seq-F1～F4，rf4i-seq-F1和rf4i-seq-F2(表1)。

表1栽培稻种质资源PCR扩增和测序引物序列

从华南农业大学遗传工程研究室搜集的165份国内外栽培稻种质资源提取基因组DNA(SDS法)为模板，使用表1所述引物组，进行PCR扩增和测序分析。其中F和a-R引物用于特异扩增a拷贝，F和b-R用于特异扩增b拷贝，i-F1和i-R1用于特异扩增籼稻不育系或非恢复性材料的rf4i拷贝。R/rf4-seq-F1～F4为Rf4、rf4j、rf4aus、rf4a和rf4b的测序引物，rf4i-seq-F1和rf4i-seq-F2为rf4i的测序引物。

扩增所用20μL的PCR反应体系如下表2所示：

表2实施例1的PCR反应体系

PCR反应条件为STI PCR方法(Zhao等，STI PCR:An efficient method foramplification and de novo synthesis of long DNA sequences.Molecular Plant,2022,4:620-629..)，具体如下：

其中“*”表示巢式内循环，适用的PCR仪有耶拿、朗基、东胜龙等品牌。

二、实验结果

j表示粳稻；i表示籼稻；aus表示籼稻的aus类型品种；I对应籼稻恢复系IR24的Rf4基因型，M对应MH63的Rf4基因型。

经测序及氨基酸序列进行比对分析，发现栽培稻中Rf4座位共有7种基因型，将此7种等位基因型分别命名为rf4j、rf4i、rf4aus、rf4a、rf4b、Rf4

Rf4包括Rf4

根据水稻品种来源及基因所在子座位，隐性等位基因包括rf4j、rf4i、rf4aus、rf4a和rf4b。

隐性rf4编码蛋白与功能型Rf4(Rf4a

Rf4

在检测的165份栽培稻种质资源中，共发现有8种单倍型，其中包括5种单拷贝单倍型：rf4j，rf4i，rf4aus，Rf4a

为了验证Rf4座位不同基因型的功能，本发明将rf4a、rf4b、rf4aus、rf4j和Rf4分别转化不育系J23A，所有rf4基因型(rf4a、rf4b、rf4aus和rf4j)的转化体均表现为花粉败育，Rf4转化体则可以恢复育性，表现为花粉可育(图3)。

实施例2Rf4座位单倍型特异分子标记的开发

根据Rf4座位的上、下游序列和Rf4不同单倍型的SNP差异，开发一种精准、快速鉴定筛选水稻种质不同Rf4单倍型的分子标记方法。

1、根据实施例1测序结果分析Rf4基因a和b拷贝的7种等位基因型序列的SNP差异，设计不同单倍型特异的分子标记，包括rf4j-F、rf4j-R、rf4i-F2、rf4i-R2、rf4aus-F、rf4aus-R、rf4a-F、rf4a-R、rf4a/b-F、rf4a/b-R、Rf4-F、Rf4-R、a-locus-F、a-locus-R、b-locus-F和b-locus-R。Actin1-F、Actin1-R为阳性对照(表3)。

表3核苷酸序列如SEQ ID NO：8～25所示的引物序列

2、以实施例1中的165份栽培稻基因组DNA为模板，分别用表3中的8对分子标记进行PCR扩增。

扩增所用20μL的PCR反应体系如下表4所示：

表4实施例2的PCR反应体系

PCR反应条件为：

用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

二、实验结果

以下所述Rf4基因在MBKbase数据库(http://www.mbkbase.org/riice)上的基因号为：OsR498G1018978200.01。Rf4基因所在的水稻第10染色体在GenBank上的编号为CP018166.1。

rf4j-F和rf4j-R引物扩增产物为371bp，扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示，在扩增产物的5’端的第23、24、349和352个碱基处(即Rf4基因的第1237、1238、1563和1566个碱基；CP018166.1的21058519、21058518、21058193和21058190位碱基)，分别存在一个T/A、G/C、A/T和C/T的SNP位点。

rf4i-F2和rf4i-R2引物扩增产物为358bp，扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示，在扩增产物的5’端的第341和342个碱基处(即Rf4基因的第1196和1197个碱基；CP018166.1的21058560和21058559位碱基)，分别存在一个A/T和T/C的SNP位点。

rf4aus-F和rf4aus-R引物扩增产物为351bp，扩增产物的核苷酸序列如SEQ IDNO：28所示，在扩增产物的5’端的第20和330个碱基处(即Rf4基因的第1011和1321个碱基；CP018166.1的21058745和21058435位碱基)，分别存在一个T/A和A/G的SNP位点。

rf4a-F和rf4a-R引物扩增产物为446bp，扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示，在扩增产物的5’端的第10、17、21和428个碱基处(即Rf4基因的第814、821、825和1232个碱基；CP018166.1的21058942、21058935、21058931和21058924位碱基)，分别存在一个A/G、G/T、G/A和T/C的SNP位点。

rf4a/b-F和rf4a/b-R引物扩增产物为197bp，扩增产物的核苷酸序列如SEQ IDNO：30所示，在扩增产物的5’端的第176个碱基处(即Rf4基因的第630个碱基；CP018166.1的21059126位碱基)，存在一个A/C的SNP位点。

Rf4-F和Rf4-R引物扩增产物为262bp，扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示，在扩增产物的5’端的第238个碱基处(即Rf4基因的第1686个碱基；CP018166.1的21058070位碱基)，存在一个C/T的SNP位点。

a-locus-F和a-locus-R引物扩增产物为331bp，扩增产物的核苷酸序列如SEQ IDNO：32所示，在扩增产物的5’端的第21、307和309个碱基处(即Rf4基因的终止密码子后第2030、2316和2318个碱基；CP018166.1的第20978195、20977909和20977907位碱基)，分别存在A/G、A/G和T/G的SNP位点。

b-locus-F和b-locus-R引物扩增产物为282bp，扩增产物的核苷酸序列如SEQ IDNO：33所示，在扩增产物的5’端的第15～20和262～264位连续的碱基处分别存在SNP位点，在扩增产物的5’端的第15～20位存在GGAATA/TCGCAC的连续SNP位点，在扩增产物的5’端的第262～264位存在TGT/CGC的连续SNP位点(即Rf4基因的终止密码子后第1513～1518，1760～1762个碱基；CP018166.1的第21055894～21055889和21055647～21055645位碱基)。

日本晴、台中65、中花11和9522为粳稻品种。金23A、金23B、珍汕97A、珍汕97B、IR64和9311，赣恢993、先恢207、珍汕Rf4I、IR8、Jalmagna、广恢102、绵恢725、R60、明恢63、蜀恢498、辐恢838和IR30为籼稻品种。CISOKAN、八香、杂草稻13和Albania为籼稻aus品种。Actin1为对照。

结果表明，如图4A所示，rf4j-F和rf4j-R引物对在粳稻(如日本晴、台中65、中花11和9522)中特异扩增371bp的片段；rf4i-F2和rf4i-R2引物对在野败型细胞质雄性不育系、保持系和部分非恢复性籼稻品种(如金23A、如金23B、珍汕97A、珍汕97B、IR64和9311)中特异扩增358bp的片段；rf4aus-F和rf4aus-R引物对在籼稻aus品种(如CISOKAN、八香、杂草稻13和Albania)中特异的扩增351bp的片段，而且rf4j、rf4i和rf4aus基因均位于a座位，为单拷贝rf4。

如表5所示，rf4j基因位于a座位，Rf4座位为rf4j单拷贝单倍型的水稻品种为9522、IRGC125981、IRGC 128077、IRGC 128086、IRGC 128314、IRGC 128360、IRGC 128467、IRGC 131964、IRGC 131968、IRGC 132274、IRGC 132278、IRGC 132307、IRGC 132339、IRGC132345、中花11、台中65、日本晴和秀水。

rf4i基因位于a座位，Rf4座位为rf4i单拷贝单倍型的水稻品种为1209A、843A、9311、D62A、D62B、E农13、F32A、F32B、F59A、F59B、IR64、IRGC 125858、IRGC 126249、IRGC127056、IRGC 127268、IRGC 127698、IRGC 127725、IRGC 128041、IRGC 128335、IRGC132315、IRGC 132364、R211、R286、中恢7259、中恢7265、冈46A、冈46B、华A、华B、双桂A、宜香1A、宜香1B、川农1B、川农3A、川农3B、巨2A、广恢128、广泰A、昌恢121、昌农1A、桂华占、沪旱1A、沪旱1B、沪旱7A、沪旱7B、泰丰A、珍汕97A、珍汕97B、蓉7A、蜀6A、蜀8B、蜀9A、西农1A、西农1B、西大2A、西大2B、西大5A、西大5B、赣香73A、赣香73B、赣香A、赣香B、金23A、金23B、长粳1B、靓占。

rf4aus基因位于a座位，Rf4座位为rf4aus单拷贝单倍型的水稻品种为Albania、CISOKAN、IRGC 128344、IRGC 128317、八香和杂草稻13。

图4B显示携带单拷贝显性Rf4的水稻品种，其中同时扩增出rf4a-F和rf4a-R引物对的扩增片段(446bp)，rf4a/b-F和rf4a/b-R引物对的扩增片段(197bp)，Rf4-F和Rf4-R引物对的扩增片段(262bp)，a-locus-F和a-locus-R引物对的扩增片段(331bp)和b-locus-F和b-locus-R引物对的扩增片段(282bp)，共五对分子标记的水稻品种(如赣恢993和先恢207)，对应的Rf4座位的单倍型为rf4a-Rf4b

如表5所示，rf4a基因位于a座位，Rf4b

如图4B所示，同时扩增出rf4a/b-F和rf4a/b-R引物对的扩增片段，Rf4-F和Rf4-R引物对的扩增片段，a-locus-F和a-locus-R引物对的扩增片段和b-locus-F和b-locus-R引物对的扩增片段，共四对分子标记的水稻品种(如珍汕Rf4I和IR8)，对应的Rf4座位的单倍型为Rf4a

如表5所示，Rf4a

如图4B所示，同时扩增出Rf4-F和Rf4-R引物对的扩增片段和a-locus-F和a-locus-R引物对的扩增片段，共二对分子标记的水稻品种(如Jalmagna和广恢102)，对应的Rf4座位的单倍型为Rf4a

如表5所示，Rf4a

如图4B所示，同时扩增出Rf4-F和Rf4-R引物对的扩增片段和b-locus-F和b-locus-R引物对的扩增片段，共二对分子标记的水稻品种(如绵恢725和R60)，对应的Rf4座位的单倍型为Rf4b

如表5所示，Rf4b

如图4C所示，同时扩增出Rf4-F和Rf4-R引物对的扩增片段，a-locus-F和a-locus-R引物对的扩增片段和b-locus-F和b-locus-R引物对的扩增片段，共三对分子标记，表明水稻品种(如明恢63、蜀恢498、辐恢838和IR30)，携带双拷贝显性Rf4(Rf4a

如表5所示，Rf4a

表5水稻品种及Rf4座位单倍型信息

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实施例3不同Rf4拷贝数的恢复力验证

一、实验方法

验证双拷贝Rf4对CMS-WA育性恢复的剂量效应，并筛选强恢复力恢复系(携带双拷贝Rf4水稻)。

以不育系J23A(rf4i)为母本，分别以携带隐性rf3背景的Rf4单基因复育系ZSRf4I(Rf4a

为了确认恢复基因Rf4对CMS-WA的育性恢复的剂量效应，本发明还开发了用于检测Rf4和不育基因WA352表达水平的特异引物Rf4-qF、Rf4-qR和WA352-qF、WA352-qR，内参基因的引物分别为UFC1-qF、UFC1-qR和Atp6-qF、Atp6-qR(表6)。

表6核苷酸序列如SEQ ID NO：24～31所示的引物序列

二、实验结果

J23A×ZSRf4M(WA352/rf4iRf4a

qRT-PCR检测(参考诺唯赞公司ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix的体系和方法)结果表明，在水稻小孢子母细胞时期花药中J23A×ZSRf4M的Rf4表达量是J23A×ZSRf4I中Rf4表达量的约2倍(图5B)，相应的WA352的表达水平相反(由于Rf4蛋白具有介导降解WA352 mRNA的作用)(图5C)。

Rf4和WA352的表达水平进一步验证了双拷贝Rf4对CMS-WA育性恢复的剂量效应，也表明实施例2的Rf4分子标记可以精确的鉴定和筛选携带双拷贝Rf4的水稻品种。

实施例4一种鉴别水稻细胞质雄性不育恢复基因Rf4单倍型的试剂盒

一、组成

1、核苷酸序列如SEQ ID NO：8～25所示的引物序列(实施例1的表3)、Taq PCR Mix和ddH

二、使用方法

以待测稻基因组DNA为模板，PCR扩增所用20μL的PCR反应体系为：2×Taq PCRMix10μL，ddH

PCR反应条件为：94℃处理4min；94℃处理30s，59℃处理30s，72℃处理20s，重复28～29个巢式内循环；72℃处理2min。

用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

三、结果判读

如图4A所示，在一个待测水稻品种中，仅核苷酸序列如SEQ ID NO：8～9所示的引物对扩增出特异片段，则其细胞质雄性不育恢复基因Rf4座位为rf4j单拷贝单倍型。

如图4A所示，在一个待测水稻品种中，仅核苷酸序列如SEQ ID NO：10～11所示的引物对扩增出特异片段，则其Rf4座位为rf4i单拷贝单倍型。

如图4A所示，在一个待测水稻品种中，仅核苷酸序列如SEQ ID NO：12～13所示的引物对扩增出特异片段，则其Rf4座位为rf4aus单拷贝单倍型。

如图4B所示，在一个待测水稻品种中，核苷酸序列如SEQ ID NO：18～19与SEQ IDNO：22～23所示的引物对，同时扩增出2条特异片段，则其Rf4座位为Rf4a

如图4B所示，在一个待测水稻品种中，核苷酸序列如SEQ ID NO：18～19与SEQ IDNO：20～21所示的引物对，同时扩增出2条特异片段，则其Rf4座位为Rf4b

如图4B所示，在一个待测水稻品种中，核苷酸序列如SEQ ID NO：14～15、SEQ IDNO：16～17、SEQ ID NO：18～19、SEQ ID NO：20～21及SEQ ID NO：22～23所示的引物对，同时扩增出5条特异片段，则其Rf4座位为rf4a-Rf4b

如图4B所示，在一个待测水稻品种中，核苷酸序列如SEQ NO：16～17、SEQ ID NO：18～19、SEQ ID NO：20～21及SEQ ID NO：22～23所示的引物对，同时扩增出4条特异片段，则其Rf4座位为Rf4a

如图4C所示，在一个水稻品种中，核苷酸序列如SEQ ID NO：18～19、SEQ ID NO：20～21和SEQ ID NO：22～23所示的引物对，同时扩增出3条特异片段，则其Rf4座位为Rf4a

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。