小麦K-TCMS育性恢复基因Rfk1-1B(CS)的分子作图及育性恢复相关基因的鉴定

摘要

基于两系法研究的小麦KTM3315A是本课题组创制的一种K型细胞质温敏雄性不育（K-CMS）小麦，具有易恢复、易保持、无不良的细胞质效应等优点，使其在杂交小麦育种中具有重要的价值。因此，选育其优良、稳定且恢复度高的恢复系十分关键，在小麦杂种优势利用研究中具有重要的意义。为了解决K-TCMS小麦恢复度高而稳定的恢复系仍偏少的问题，以及从农业发展的角度出发，研究K-TCMS育性恢复基因及育性恢复的分子机理就显得尤为重要。本研究一方面以K型不育小麦KTM3315A和中国春为亲本构建的杂交组合BC1F1回交群体KTM3315A//中国春/TM3315B为试验材料，对其进行育性鉴定及遗传分析，此外，还利用SSR、EST-STS和KASP等分子标记对育性恢复基因Rfk1-1B(CS)进行了分子定位，旨在为K-TCMS小麦的遗传机理和选育提供一定的理论基础；另一方面，以课题组多年组配的K型小麦近等基因系KTM3315A和KTM3315R的二核期花药为测序材料，通过生物信息学分析差异表达基因，发掘和确定与育性恢复相关的重要候选基因和关键代谢通路，旨在为研究小麦育性恢复的分子机制提供有用信息和新的见解。主要研究结果如下： 1.以K型小麦雄性不育系KTM3315A、恢复系中国春、KTM3315A/中国春F1代、近等基因系KTM3315R为供试材料，对花药进行扫描电镜观察，小孢子I2-KI染色分析。结果发现，KTM3315A的花药干瘪、瘦小，顶端不开裂散粉，花药外壁显微结构排列杂乱，小孢子变形、瘪皱，呈典型的染败类型；而中国春、(KTM3315A/中国春)F1和KTM3315R的花药饱满均匀、顶端开裂散粉，花药外壁显微结构排列整齐，小孢子圆形、饱满，染色均匀育性正常。说明K型小麦恢复基因Rfk1-1B(CS)存在的条件下，可将K型小麦雄性不育系KTM3315A的育性恢复正常。 2.对KTM3315A//中国春/TM3315B的BC1F1群体进行遗传分析和育性恢复基因的定位分析。结果如下：可育株：不育株接近1:1的分离比，符合1对主效恢复基因（Rf）控制的育性恢复；将育性恢复基因Rfk1-1B(CS)定位在KASP标记C28882165A和EST-STS标记BG274848之间，它们距育性恢复基因Rfk1-1B(CS)的距离均为0.5cM，除此之外，有一个SSR分子标记gwm413与育性恢复基因Rfk1-1B(CS)共分离。 3.对KTM3315A及其近等基因系KTM3315R二核期的花药进行了转录组测序，共获得2642个差异表达基因（DEGs），其中上调1404个，下调1238个。对这些DEGs进行功能注释分析，GO显著富集分析发现大量DEGs参与代谢、细胞壁和酶活性等功能。KEGG富集分析表明，糖代谢、苯丙烷类代谢和生物合成途径与育性恢复密切相关。此外，转录因子分析发现，WRKY、bHLH和MYB转录因子与小麦的育性密切，均参与调控小麦的育性恢复。 4.对功能注释和关键代谢通路的综合分析结果进行验证表明，与KTM3315A花药相比，KTM3315R花药中糖含量和类黄酮含量的充足以及重要代谢通路中相关酶的上调表达，进而维持了小麦的正常育性。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 小麦杂种优势和雄性不育系的研究

1.2.1 小麦 K型雄性不育系的来源及特点

1.2.2 小麦 K 型不育系育性恢复的配子传递研究

1.2.3 小麦 K 型不育系育性恢复机理的研究

1.2.4 小麦光温敏不育系的研究与K型小麦温敏不育系KTM3315A

1.3 分子标记在小麦育性恢复基因上的应用

1.4 高通量转录组测序与花药发育研究

1.5 研究的目的意义及技术路线

1.5.1 研究的目的意义

1.5.2 技术路线

第二章 K-TCMS小麦KTM3315A育性恢复基因Rfk1-1B(CS)的分子作图

2.1 试验材料

2.1.1 主要试验材料

2.1.2 材料种植与创建杂交组合

2.1.3 挂牌、套袋与取材

2.2 试验方法

2.2.1 KTM3315A、中国春和（KTM3315A/中国春）F1育性的生物学观察

2.2.2 KTM3315A//中国春/TM3315B的花粉粒I2-KI染色鉴定

2.2.3 BC1F1群体的结实率育性调查

2.2.4 亲本及其BC1F1群体基因组DNA的提取、检测及混池构建

2.2.5 育性恢复基因Rfk1-1B(CS)的分子作图

2.3.1 花药及小孢子的形态学及扫描电镜观察结果

2.3.2 BC1F1群体的遗传分析

2.3.3 育性恢复基因Rfk1-1B(CS)的遗传图谱构建

2.4 讨论

2.4.1 KTM3315A发生败育的形态学特点

2.4.2 K型不育系育性恢复的遗传机制

2.4.3 对K型不育系恢复基因的定位

第三章 K-TCMS小麦育性恢复相关代谢通路及候选基因的转录组分析

3.1 试验材料

3.2 试验方法

3.2.1 表型特征和显微观察

3.2.2 RNA提取、cDNA文库构建及转录组深层测序

3.2.3 基因组比对和序列组装

3.2.4 差异表达基因的生物信息学分析

3.2.5 总糖含量测定

3.2.6 类黄酮含量测定

3.2.7 差异表达基因的实时荧光定量PCR检测（qRT-PCR）

3.3 试验结果

3.3.1 表型特征的显微观察

3.3.2 转录组测序和基因组比对

3.3.3 差异表达基因的鉴定

3.3.4 差异表达基因的功能分类

3.3.5 鉴定与育性恢复相关的转录因子

3.3.6 碳水化合物代谢和苯丙烷类生物合成途径参与了Aegilops kotschyi细

3.3.7 可溶性糖和类黄酮的测定

3.3.8 转录组测序结果的qRT-PCR验证

3.4 讨论

3.4.1 碳水化合物代谢影响细胞壁发育、花药生长和育性

3.4.2 黄酮类化合物对可育花药的发育至关重要

3.4.3 参与调控花粉发育和雄性育性的转录因子

结论

参考文献

附录

致谢

作者简介