一种马齿苋中有效成分的提取方法、马齿苋提取液

摘要

本发明属于化妆品领域，公开了一种马齿苋中有效成分的提取方法，采用马齿苋饮片，在水溶液中经过水提得到；所述水溶液中的溶质为抗坏血酸和抗坏血酸盐；所述溶质的浓度为0.5‑2wt%；抗坏血酸和抗坏血酸盐的比例为1:0.1‑0.5，即得到马齿苋提取液。该方法采用马齿苋饮片为原料，通过有机酸、有机酸盐的水溶液为提取体系，可提高提取物溶液中活性成分的含量，并有效改善提取物的活性。本发明的另一目的在于提供一种基于该方法得到的马齿苋提取液。

说明书

技术领域

本发明属于化妆品领域，具体涉及一种马齿苋中有效成分的提取方法、马齿苋提取液。

背景技术

马齿苋提取大致分为两种方法：新鲜马齿苋为原料提取、以马齿苋饮片为原料提取；

经过实验发现，如果以新鲜马齿苋为原料提取活性成分，在原料压榨后未经过灭酶处理，马齿苋新鲜原料自身所带的分解酶会导致原本活性成分的损失或直接无法保留。

所以，本发明所选择的研究方向就是以马齿苋饮片为原料进行活性成分的提取。经过检索，得到如下文献：

D1：CN112043736A公开了一种马齿苋活性组分及其制备方法和应用，属于天然活性成分技术领域。该马齿苋活性组分的制备方法包括以下步骤：提取：取马齿苋，加入水作为溶剂，加热提取，得水提液；超滤：将所述水提液通过截留分子量为5K-15K的超滤膜进行过滤，取滤液，即得。其说明书记载：马齿苋中药饮片购于保康中药饮片加工公司，经北华大学生药教研室检测鉴定，证实其为马齿苋。

D2：CN113274416A公开了一种马齿苋配方颗粒及其制备与检测方法，配方颗粒制备方法包括如下步骤：马齿苋饮片经水提、浓缩、减压干燥、干法制粒等工艺步骤。所述方法使用紫外分光光度法测定含量，其中，所述的紫外分光光度法检测波长为510nm，该方法包括以下步骤：分别制备对照品与马齿苋配方颗粒的供试品，绘制标准曲线，将上述样品分别经紫外分光光度法检测，比较计算获得马齿苋配方颗粒供试品中的总黄酮含量。

可见，采用马齿苋饮片进行水提是现有技术中广泛采用的技术。

采用有机酸对多糖的提取可参考如下文献：

D3：CN102417545A公开了一种高等植物或食药用真菌类中活性多糖的提取方法，具体为：在原料中加入有机酸或有机无机混酸溶液；加热物料，利用有机酸分子将活性多糖从原料上分离下来，并适度切断植物高分子活性多糖的糖苷键，实现其部分降解；采用蒸馏、过滤或离心方法，排除物料中大部分酸溶液,然后用有机溶剂洗涤除去少量残余的酸液；经有机酸处理的原料，加入约5-15倍体积水进行提取，提取液浓缩后醇沉可得活性粗多糖；粗多糖溶于5-15倍体积去离子水中，调节溶液的pH至中性，离心，上清液经透析或膜分离后，浓缩，干燥得到平均分子量低、多糖分子量分布窄、水溶性好的活性多糖产品，同时克服现有工艺耗水、耗能、产物收率低等诸多缺点。

其说明书记载：所述有机酸溶液选自质量百分比浓度为5％-50％的草酸、质量百分比浓度为10％-99％的甲酸、质量百分比浓度为10％-99％的乙酸和质量百分比浓度为10％-99％的丙酸水溶液中的一种。

经过广泛的论文调研和实验，大致可以得到如下结论：

1.采用马齿苋饮片进行提取，经过验证，醇提、水提、含盐水提的浓度不超过3mg/ml；

2.采用马齿苋饮片进行提取，提取物活性不佳，其体现在透明质酸酶抑制、DPPH抑制、弹性蛋白酶抑制、酪氨酸酶等方面。

所以，本案解决的技术问题是：如何进一步提高以马齿苋饮片为原料的提取物中多糖浓度和提取物活性。

发明内容

针对目前现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种马齿苋中有效成分的提取方法，该方法采用马齿苋饮片为原料，通过有机酸、有机酸盐的水溶液为提取体系，可提高提取物溶液中活性成分的含量，并有效改善提取物的活性。

本发明的另一目的在于提供一种基于该方法得到的马齿苋提取液。

具体方案如下：

一种马齿苋中有效成分的提取方法，采用马齿苋饮片，在水溶液中经过水提得到；所述水溶液中的溶质为抗坏血酸和抗坏血酸盐；所述溶质的浓度为0.5-2wt%；抗坏血酸和抗坏血酸盐的比例为1:0.1-0.5，即得到马齿苋提取液。

在一些实施案例中，所述溶质的浓度为0.5wt%、0.6wt%、0.7wt%、0.8wt%、0.9wt%、1.0wt%、1.1wt%、1.2wt%、1.3wt%、1.4wt%、1.5wt%、1.6wt%、1.7wt%、1.8wt%、1.9wt%或2.0wt%。

在一些实施案例中，抗坏血酸和抗坏血酸盐的比例为1:0.1、1:0.15、1:0.2、1:0.25、1:0.3、1:0.35、1:0.4、1:0.45或1:0.5；

马齿苋原料按照药典标准，水分小于9%，同时鉴别项目要求全部符合。此外，需额外进行检测，使用硫酸苯酚法测定其多糖含量，需达到3%以上，以保证最终成品的含量。马齿苋使用前必须用清水洗净、之后烘干干燥。由于马齿苋原料在采摘时使用的是全株，导致泥沙较多，如果不进行水洗会导致最终成品的电导率较高，影响最终使用。同时鼓风干燥箱烘干温度控制在60℃以下；之后粉碎20目左右颗粒。

相较于常见的使用有机酸溶液、碱性溶液或醇溶液进行提取，本发明的提取方法避免了多糖在碱性条件下容易不稳定易分解、在有机酸溶液中提取浓度不高、在醇溶液中溶解度不高的情况，使得整个马齿苋多糖的得率上升；

更为具体来说，对于马齿苋多糖和马齿苋中有机酸等其他有效成分的提取，单采用有机酸可实现多糖从饮片中浸出，但是经过实验发现，采用有机酸和有机酸盐复配使用，能够使多糖浸出率更高，有机酸可使新鲜原料中纤维素、半纤维素、果胶质等物质发生部分降解，从而改变植物细胞壁的结构层，使胞内多糖迅速溶出的同时，细胞壁多糖也得以尽快释放，加入有机酸盐之后，有机酸盐可维持体系中有机酸阴离子浓度的前提下，在体系中细胞壁吸水过程中，促进细胞壁的崩解，以加速多糖和其他有效成分的溶出。

同时，相比醇提和水提，蛋白浸出率低。

本发明的另外一个优势在于：目前大多数可查询到的马齿苋提取专利为实验性专利，存在提取流程复杂，提取过程步骤过多等问题，无法很好的转入至大规模生产。本发明在具有实验转生产能力的条件情况下，所摸索出的上述方法已经实现了扩大化生产，将马齿苋提取的步骤做到了极大的优化，抛弃了那些无用且繁琐的步骤，也避免了因为那些步骤带来的有效成分的无端损失。

在上述的马齿苋中有效成分的提取方法中，马齿苋饮片和水溶液的重量比例为1：6-12。

在一些实施案例中，马齿苋饮片和水溶液的重量比例为1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10；

在一些实施案例中，所述水提分为一次水提和二次水提；

所述一次水提的时间为1.5-2.5小时，所述二次水提的时间为1-2小时；一次水提和二次水提的温度均为50-60℃；一次水提和二次水提均采用循环提取的方式进行；将一次水提的溶液和二次水提的溶液合并得到马齿苋提取液。

优选地，一次水提的用水量为原料重量的5-8倍；二次水提的用水量为原料重量的3-6倍；

优选地，所述一次水提的溶液和二次水提的溶液合并，并经过离心、层析脱色、杀菌，得到马齿苋提取液。

在上述的马齿苋中有效成分的提取方法中，所述离心的工艺为：

将一次水提的溶液和二次水提的溶液合并后，通过物料泵，缓慢泵入平板离心机中，控制泵入流速为平板离心机每小时处理量的30-50%，同时控制平板离心机转速至最大转速；收集离心流出液至转运储罐中；之后将储罐中离心液通过蠕动泵泵入高速管式离心中，控制泵入流速为其最大载液量的40-60%，收集高速离心后流出液至转运储罐中，待用。

在上述的马齿苋中有效成分的提取方法中，所述层析脱色的具体方法为：

将流出液通过物料泵泵入至柱层析设备储罐中，选择脱色树脂型号LX-T5或LX-T8，控制上柱速度1-2倍柱体积/h，收集流出液，待用。

LX-T5与LX-T8为碱性阴离子吸附树脂，供应商为西安蓝晓科技新材料股份有限公司。

目前市面上的马齿苋提取物在化妆品应用上及其广泛，但市面上的马齿苋提取物或多或少存在一些颜色问题，导致加入至配方中易导致成品颜色问题。由于马齿苋本身颜色较深，其脱色较为困难。本发明针对性的使用脱色树脂柱脱色马齿苋提取液，能得到颜色优异的马齿苋提取液产品，满足市场上的需求。

本发明尽量避免使用超滤或者纳滤设备带来的马齿苋多糖损失，马齿苋多糖作为马齿苋提取液中主要的有效成分，功效表现明显。

在上述的马齿苋中有效成分的提取方法中，所述杀菌的工艺具体为：

将层析脱色处理后得到的流出液转移至调配罐中，向其中加入多元醇，作为防腐手段，然后加热至85-95℃间，保温3-6小时，之后冷却至室温，通过0.1um压滤机灌装至消毒的成品罐中即得到马齿苋提取液；

所述多元醇为己二醇和1，3-丁二醇；己二醇的加入量相当于马齿苋提取液总量的1.5%-2.5%，所述1，3-丁二醇的加入量相当于马齿苋提取液总量的15-25%。

在上述的马齿苋中有效成分的提取方法中，所述马齿苋饮片的规格为20±3目。

在上述的马齿苋中有效成分的提取方法中，所述抗坏血酸盐为抗坏血酸钾、抗坏血酸钠或抗坏血酸钙。

最后，本发明还公开了一种马齿苋提取液，采用如上任一所述的方法提取得到。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.工艺简单，已经经过了小试至中试的转产实验；

2.多糖和其他有效成分提取率高；

3.提取物活性高；

4.适用于化妆品使用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

（1）选取河北安国市产马齿苋原料约55kg，硫酸苯酚法测得其多糖含量为5.32%。切段后水洗泥沙与灰尘，60℃烘干3小时。之后粉碎成20目颗粒，得到51kg投料原料。

（2）将这51kg原料投入至500L提取罐中，加入310kg水，加入3kg抗坏血酸和抗坏血酸钠（抗坏血酸：抗坏血酸钠的重量比=1:0.25），55℃搅拌提取2小时，之后初步分离提取液与提取原料，加入200kg水溶液，加入2kg抗坏血酸和抗坏血酸钠（抗坏血酸：抗坏血酸钠的重量比=1:0.25），保持55摄氏度继续提取1.5小时。将得到的提取液与提取渣一起泵入转运储罐中，待用。

（3）将上一步得到的提取渣提取液混合液加入至PS800型离心机中，控制离心速度500kg/h（最大处理量为1.3T/h），分离提取渣与提取液。将提取液转移至暂存罐中，之后通过蠕动泵泵入至GQ150型管式离心机中，控制泵入速度10L/min（最大载液量20L），收集所有的离心液，得到493kg提取液。

（4）将这部分提取液通过物料泵泵入至柱层析设备的储罐中，之后以450L/h的速度通过填料量300L的LX-T5树脂阵列中。舍弃前部约50L的原树脂柱内溶液，收集后续流出液，得到约470kg流出液。

（5）将这部分流出液转运至调配罐中，加入95kg1，3-丁二醇与9.5kg1，2己二醇溶液，在调配罐中搅拌均匀后，加热提取液至90摄氏度，保温4小时。之后冷却至室温，过0.1um压滤机后，灌装至成品桶中，共得到575kg马齿苋提取液。此次批号为LG-1。

实施例2

（1）选取河北定州市产马齿苋原料约55kg，硫酸苯酚法测得其多糖含量为5.46%。切段后水洗泥沙与灰尘，60℃烘干3小时。之后粉碎成20目颗粒，得到53kg投料原料。

（2）将这53kg原料投入至500L提取罐中，加入320kg水，加入3kg抗坏血酸和抗坏血酸钠（抗坏血酸：抗坏血酸钠的重量比=1:0.25），50℃搅拌提取1.5小时，之后初步分离提取液与提取原料，加入210kg水溶液，加入2kg抗坏血酸和抗坏血酸钠（抗坏血酸：抗坏血酸钠的重量比=1:0.25），保持50℃继续提取1小时。将得到的提取液与提取渣一起泵入转运储罐中，待用。

（3）将上一步得到的提取渣提取液混合液加入至PS800型离心机中，控制离心速度600kg/h（最大处理量为1.3T/h），分离提取渣与提取液。将提取液转移至暂存罐中，之后通过蠕动泵泵入至GQ150型管式离心机中，控制泵入速度12L/min（最大载液量20L），收集所有的离心液，得到509kg提取液。

（4）将这部分提取液通过物料泵泵入至柱层析设备的储罐中，之后以400L/h的速度通过填料量300L的LX-T5树脂阵列中。舍弃前部约50L的原树脂柱内溶液，收集后续流出液，得到约482kg流出液。

（5）将这部分流出液转运至调配罐中，加入97kg1，3-丁二醇与9.7kg1，2己二醇溶液，在调配罐中搅拌均匀后，加热提取液至85摄氏度，保温3小时。之后冷却至室温，过0.1um压滤机后，灌装至成品桶中，共得到584kg马齿苋提取液。此次批号为LG-2。

实施例3

大体同实施例1，不同的是，步骤2中，两次提取均采用重量比为1:0.1的抗坏血酸和抗坏血酸钠；提取过程的现象、马齿苋提取液重量和实施例1之间误差不明显；马齿苋提取液的重量为572kg；此次批号为LG-3。

实施例4

大体同实施例1，不同的是，步骤2中，两次提取均采用重量比为1:0.5的抗坏血酸和抗坏血酸钠；提取过程的现象、马齿苋提取液重量和实施例1之间误差不明显；马齿苋提取液的重量为580kg；此次批号为LG-4。

实施例5

大体同实施例1，不同的是，步骤2中，将51kg原料投入至500L提取罐中，加入310kg水，加入6kg抗坏血酸和抗坏血酸钠（抗坏血酸：抗坏血酸钠的重量比=1:0.25），55℃搅拌提取2小时，之后初步分离提取液与提取原料，加入200kg水溶液，加入4kg抗坏血酸和抗坏血酸钠（抗坏血酸：抗坏血酸钠的重量比=1:0.25），保持55摄氏度继续提取1.5小时。将得到的提取液与提取渣一起泵入转运储罐中，待用；

马齿苋提取液的重量为579kg；此次批号为LG-5。

实施例6

大体同实施例1，不同的是，步骤2中，将51kg原料投入至500L提取罐中，加入310kg水，加入1.8kg抗坏血酸和抗坏血酸钠（抗坏血酸：抗坏血酸钠的重量比=1:0.25），55℃搅拌提取2小时，之后初步分离提取液与提取原料，加入200kg水溶液，加入1.16kg抗坏血酸和抗坏血酸钠（抗坏血酸：抗坏血酸钠的重量比=1:0.25），保持55摄氏度继续提取1.5小时。将得到的提取液与提取渣一起泵入转运储罐中，待用；

马齿苋提取液的重量为573kg；此次批号为LG-6。

实施例7

大体同实施例1，不同的是，步骤2中，将51kg原料投入至500L提取罐中，加入350kg水，加入3.5kg抗坏血酸和抗坏血酸钠（抗坏血酸：抗坏血酸钠的重量比=1:0.25），55℃搅拌提取2小时，之后初步分离提取液与提取原料，加入250kg水溶液，加入2.5kg抗坏血酸和抗坏血酸钠（抗坏血酸：抗坏血酸钠的重量比=1:0.25），保持55摄氏度继续提取1.5小时。将得到的提取液与提取渣一起泵入转运储罐中，待用；

马齿苋提取液的重量为632kg；此次批号为LG-7。

实施例8

大体同实施例1，不同的是，步骤2中，将51kg原料投入至500L提取罐中，加入250kg水，加入2.5kg抗坏血酸和抗坏血酸钠（抗坏血酸：抗坏血酸钠的重量比=1:0.25），55℃搅拌提取2小时，之后初步分离提取液与提取原料，加入150kg水溶液，加入1.5kg抗坏血酸和抗坏血酸钠（抗坏血酸：抗坏血酸钠的重量比=1:0.25），保持55摄氏度继续提取1.5小时。将得到的提取液与提取渣一起泵入转运储罐中，待用；

马齿苋提取液的重量为458kg；此次批号为LG-8。

实施例9

大体同实施例1，不同的是，抗坏血酸盐为抗坏血酸钾；此次批号为LG-9。

实施例10

大体同实施例1，不同的是，抗坏血酸盐为抗坏血酸钙；此次批号为LG-10。

对比例1

大体同实施例1，不同的是，一次水提、二次水提的水溶液中均不加有机酸和有机酸盐；此次批号为DG-1。

对比例2

大体同实施例1，不同的是，一次水提、二次水提的水溶液为2%氨水溶液；此次批号为DG-2。

对比例3

大体同实施例1，不同的是，一次水提、二次水提的水溶液为1%碳酸钠溶液；此次批号为DG-3。

对比例4

大体同实施例1，不同的是，一次水提、二次水提的水溶液为30%乙醇溶液；此次批号为DG-4；

需要说明的是：本对比例4通过乙醇溶液提取得到的溶液在通过LX-T5树脂阵列前均对乙醇进行回收，已符合通过脱色树脂柱的条件。

对比例5

大体同实施例1，不同的是，一次水提、二次水提的水溶液的溶质为抗坏血酸，抗坏血酸的浓度为1%；此次批号为DG-5。

对比例6

大体同实施例1，不同的是，一次水提、二次水提的水溶液的溶质为草酸，草酸的浓度为1%；此次批号为DG-6。

对比例7

大体同实施例1，不同的是，一次水提、二次水提的水溶液的溶质为草酸和草酸钠，草酸和草酸钠的总浓度为1%，草酸和草酸钠的比例为1:0.25；此次批号为DG-7。

对比例8

大体同实施例1，不同的是，一次水提、二次水提的水溶液的溶质为乙酸和乙酸钠，乙酸和乙酸钠的总浓度为1%，乙酸和乙酸钠的比例为1:0.25；此次批号为DG-8。

对比例9

大体同实施例1，不同的是，一次水提、二次水提的水溶液的溶质为抗坏血酸和氯化钠（抗坏血酸：氯化钠的重量比=1:0.15），抗坏血酸和氯化钠的总浓度为1%；此次批号为DG-9。

对比例10

大体同实施例1，不同的是，一次水提、二次水提的水溶液的溶质为抗坏血酸和抗坏血酸钠（抗坏血酸：抗坏血酸钠的重量比=1:1），抗坏血酸和抗坏血酸钠的总浓度为1%；此次批号为DG-10。

测试项目1马齿苋提取液多糖含量检测

原理：苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。

试剂：6%苯酚溶液、浓硫酸、标准葡萄糖。

实验方法：

1制作标准曲线：

准确称取标准葡聚糖或葡萄糖20mg于500ml容量瓶中加水至刻度分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却室温放置20分钟；

以后于490nm测吸光度值，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖浓度，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

2样品含量测定：

原料：取马齿苋原料50g，粉碎成约60目粉末，之后取1g粉末，100ml水超声30min，0.22um微孔滤膜过滤，待用。

成品：直接使用即可。

检测：吸取2.0ml样品，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却室温放置30分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。测试结果可见下表1：

表1多糖含量测试结果

通过表1的结果可见：

1.采用碱提、醇提、水提、有机酸酸提，多糖浓度低于本发明的有机酸和有机酸盐的复配的情况；

2.参考LG-1和DG-10，当采用有机酸和有机酸盐的复配的实验条件时，有机酸的浓度应该至少为有机酸盐浓度的2倍；有机酸浓度过低，整个体系的pH将会偏向中性，马齿苋多糖的提取率虽然变高，但是杂质较多，使得最终成品多糖含量下降；

3.参考LG-1和DG-9，当采用无机盐替换抗坏血酸盐时，多糖的浸出浓度较低，可能的原因在于：抗坏血酸盐能够增加多糖的提取率而不增加杂质的提取率，而无机盐则没有这方向的效果；

4.参考LG-1和DG-7、DG-8，当采用其他类型的有机酸/盐代替抗坏血酸/盐时，多糖的浸出浓度较低，可能的原因在于：抗坏血酸与抗坏血酸盐的结构与葡萄糖类似，可能能够促进多糖的溶解和浸出，使得使用这种方式提取得到的提取率最高。

测试项目2马齿苋提取液体外法检测

1.透明质酸酶抑制：

原理：透明质酸酶是透明质酸的特异性裂解酶，是过敏反应的参与者，与肥大细胞释放组胺有强相关性。试验样品是否具有舒缓功效，可以利用透明质酸酶抑制率来判断，透明质酸酶抑制率越高则反映该物质舒缓功效越强，反之则越弱。

试剂：透明质酸酶、透明质酸钠。

实验方法：设立样品组A（既含有样品也含有透明质酸酶）、样品本底组B（含有样品不含透明质酸酶）、溶剂组C（不含样品含有透明质酸酶）和溶剂本底组D（不含样品不含透明质酸酶组），每个组别需设立3个平行，分别加入不同试剂溶液，摇匀，室温放置30min显色，用紫外分光光度计测定波长为528nm处吸光度值。

结果计算：测得上述A、B、C、D组的吸光度，通过以下公式计算：

透明质酸酶抑制率（%）=

结果参考表2：

表2透明质酸酶抑制结果

注：透明质酸酶抑制率保留三位小数，

2.DPPH抑制：

原理：自由基过量产生会导致皮肤自然衰老和光老化，从而产生皱纹。因此，是否具有清除自由基的能力是评价延缓衰老、抗皱的化妆品(原料)的重要指标一。

试剂：DPPH（1，1-二苯基-2-苦基肼）。

实验方法：设立样品管T、样品本底管T

结果计算：

DPPH自由基清除率（%）=

结果参考表3：

表3 DPPH抑制结果

注：透明质酸酶抑制率保留三位小数，

3.弹性蛋白酶抑制：

原理：抗皱、紧致功效主要通过评估试验样品对弹性蛋白酶的抑制率来表征。弹性蛋白酶主要由成纤维细胞合成分泌，能够降解皮肤中的弹性蛋白导致皮肤老化。抑制弹性蛋白酶的实验原理是猪胰腺弹性蛋白酶与酶底物发生催化反应，添加活性物质后吸光度发生变化，通过吸光度变化的大小反映弹性蛋白酶抑制剂抑制率大小。

试剂：弹性蛋白酶（猪胰），BR、N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酸溶液、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）溶液；N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酸溶液中N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酸的浓度为98wt%；表没食子儿茶素没食子酸酯溶液中表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为98wt%。

实验方法：设立样品组A、样品本底组B、溶剂组C和溶剂本底组D，每个组别需设立3个平行，在96孔板中分别加入不同试剂溶液，轻轻摇匀，25℃孵育15min后，将其放在酶标仪中，在410nm处测定吸光值。

结果计算：测得上述ABCD四组的吸光度，通过以下公式计算：

弹性蛋白酶抑制率（%）=

结果参考表4：

表4弹性蛋白酶抑制结果

注：弹性蛋白酶抑制率保留三位小数，P<0.05，表示样品和阳性对照与阴性对照相比有显著性差异。

4.酪氨酸酶：

原理：在皮肤黑色素生物合成中，酪氨酸酶是关键酶，作用于多巴，形成多巴醌，后者自发进行一系列反应最后形成黑色素。酪氨酸酶在pH6.8的磷酸溶液中，可催化多巴转化成多巴醌，在分光光度计475nm处可测定吸光值。具有酪氨酸酶活性抑制作用的化妆品可以减少多巴转化成多巴醌，从而降低吸光值，根据吸光值的变化，评估化妆品对酪氨酸酶活性的抑制作用。

试剂：多酚氧化酶（菌菇），BR、左旋多巴，BR。

实验方法：设立样品管T、样品本底管T

结果计算：

酪氨酸酶抑制率（%）=

结果参考表5：

表5酪氨酸酶抑制结果

注：酪氨酸酶抑制率保留三位小数，P<0.05，表示样品和阳性对照与阴性对照相比有显著性差异。

总结：上述四种体外实验证明，本发明的提取方法相比于醇提、水提、有机酸提、有机酸+无机盐提得到的提取物，其活性更高。

测试项目3 马齿苋提取液人体安全性评价

方法：皮肤封闭性斑贴测试：

选取35名符合《化妆品安全技术规范2015版》人体皮肤斑贴实验的受试者。将0.02ml马齿苋提取物原液使用标准斑试器用低敏胶带敷至受试者手臂内侧，持续24小时。24小时之后除去斑试器，之后等待30min待压痕消失，观察测试点皮肤状态变化，之后24、48小时时再次观察皮肤变化。其中评价标准按下表6。

表6评价标准表

结果参考表7：

表7安全性测试结果

上述实验证明该工艺提取的马齿苋提取液在人体上无安全性问题，可以放心使用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。