一种薏苡附子散保护缺血心肌作用机制的研究方法

摘要

本发明一种薏苡附子散保护缺血心肌作用机制的研究方法，包括以下步骤：（1）薏苡附子散对心肌缺血模型小鼠体内NO水平及组织病理影响研究；（2）薏苡附子散对小鼠离体的胸主动脉张力影响研究；（3）薏苡附子散对人冠状动脉内皮细胞内NO活性的影响研究；研究显示薏苡附子散可以作为NO补充剂，通过NO3‑‑NO2‑‑NO这条途径产生稳定的NO生物活性，从而调节内皮功能，舒张血管，维持血管内环境的稳定，保护缺血心肌，影响心血管疾病的发生发展；本发明从NO传导途径的全新角度揭示薏苡附子散作用的内在机制，为薏苡附子散的临床应用提供理论依据和实验基础。

说明书

技术领域

本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种薏苡附子散保护缺血心肌作用机制的研究方法。

背景技术

冠心病即冠状动脉粥样硬化性心脏病，是全球第一位的疾病死亡原因，多发生于中老年人群，男性多于女性，以脑力劳动者居多。China PEACE研究显示近10余年该病发病率及住院率在我国逐年上升趋势。中医药在改善CAD临床症状，提高患者生活质量，预防和延缓冠脉再狭窄等方面具有显著优势，但其缺乏科学理论依据，难以被广泛接受和认同。因此，科学家开始致力于传统中医药治疗CAD的深入研究，以期为传统中医药的使用提供科学依据并有望从中找到新的突破口。

近期研究发现，内皮细胞 (Endothelial Cells, EC) 通过血管壁中的内皮一氧化氮合酶 (eNOS) 产生的一氧化氮 (Nitric Oxide, NO)，是血流和血压的主要调节剂，可通过促进血管舒张、调节慢性组织缺血反应、减轻血管炎症、增强内皮细胞线粒体功能、抑制血小板凝集等方面发挥强大的生物活性，从而在血管稳态和心脏功能中起着重要作用。NO在体内有两条产生通道，经典通道是一氧化氮合酶（Endothelial Nitric OxideSynthase, eNOS）利用L-精氨酸(L- Arginine)和氧分子（O

早在3000年前的东汉古医书《金匮要略》就有提到薏苡附子散可治疗“胸痹缓急”，意在温阳通痹，散寒止痛。薏苡其干燥成熟种仁具有利水渗湿、健脾止泻、除痹、排脓、解毒散结等功效。附子为“回阳救逆”第一要药，具有强心、缓解心律失常功效，可保护缺血心肌、改善微循环、神经炎症及舒张血管，且其舒张血管的作用可能与内皮释放NO关系密切，而此方中使用的炮附子更是大大降低了其毒性。现代临床研究发现薏苡附子散不仅可以治疗胸痹心痛，还可兼治哮喘、痛风性关节炎、慢性盆腔炎、坐骨神经痛及神经性头痛等疾病，虽疗效显著但对其发挥作用的内在机制缺乏科学性的认知。

薏苡附子散出自于张仲景的《金匮要略》，用以治疗“胸痹缓急”。全方由薏苡仁、炮附子两味药物配伍而成，疗效显著但其作用机制尚未明确。将冠心病的治疗与NO的最新研究成果融合在一起，提出“薏苡附子散可作为NO补充剂，经硝酸盐（nitrate）—亚硝酸盐（nitrite）—一氧化氮（NO

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种从NO传导途径的全新角度揭示薏苡附子散作用的内在机制，为薏苡附子散的临床应用提供理论依据和实验基础的薏苡附子散保护缺血心肌作用机制的研究方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种薏苡附子散保护缺血心肌作用机制的研究方法，包括以下步骤：

（1）薏苡附子散对心肌缺血模型小鼠体内NO水平及组织病理影响研究：

1.1）实验药物的制备：取薏苡仁颗粒剂、附子颗粒剂，按照薏苡附子散的配方配置薏苡附子散颗粒剂；再利用薏苡附子散颗粒剂制备薏苡附子散颗粒剂的浓度梯度溶液；

1.2）薏苡附子散NO

1.3）动物分组、造模及给药：

1.31）分组：将小鼠随机分为6组：空白组、假手术组、AMI模型组、薏苡附子散颗粒剂高剂量组、薏苡附子散颗粒剂中剂量组、薏苡附子散颗粒剂低剂量组；

1.32）造模：空白组按正常条件饲养；假手术组开胸穿线不接扎冠状动脉左前降支；AMI模型组、薏苡附子散颗粒剂高剂量组、薏苡附子散颗粒剂中剂量组以及薏苡附子散颗粒剂低剂量组均采用在左心耳下缘1mm结扎LAD的方法建立AMI模型；

1.33）给药：除空白组外，其他各组给药前均使用腹腔注射eNOS阻滞剂抑制小鼠体内eNOS蛋白的表达；

空白组、假手术组、AMI模型组分别灌生理盐水；薏苡附子散颗粒剂高剂量组、薏苡附子散颗粒剂中剂量组以及薏苡附子散颗粒剂低剂量组分别灌高中低浓度的薏苡附子散颗粒剂溶液；

1.4）检测eNOS蛋白表达：利用蛋白免疫印迹法检测步骤1.33）中各组实验小鼠心肌组织eNOS蛋白表达；

1.5）血清中总NO含量检测：取步骤1.33）中各组实验小鼠全血离心取上清液得到血清，利用Griess法通过总一氧化氮检测试剂盒检测各组实验小鼠血清中NO生物活性；

1.6）观察心肌组织病理变化：取步骤1.33）中各组实验小鼠心脏组织样本，经过HE染色后置于显微镜下观察小鼠心肌组织病理变化情况，并拍照记录；

（2）薏苡附子散对小鼠离体的胸主动脉张力影响研究：

2.1）分组取血管环：将小鼠随机分为4组：生理盐水组、高剂量组、中剂量组、低剂量组，并获取各组小鼠的血管环，得到4组血管环样品；

2.2）血管环的检测：将4组血管环样品分别放入含有eNOS阻滞剂L-NAME的器官浴中孵育10min以阻断L-精氨酸-NOS-NO通路，再在每组血管环样品中加入去甲肾上腺素对分离的小鼠主动脉环进行预收缩，最后在其中一组血管环样品中加入等量的生理盐水、在另外三组血管环样品中对应加入薏苡附子散颗粒剂的浓度梯度溶液，测量4组血管环样品的松弛程度并定量；

（3）薏苡附子散对人冠状动脉内皮细胞内NO活性的影响研究：

3.1）细胞培养：将8次传代后的HCAECs分为两大组：有氧组、缺氧组；有氧组按正常培养条件培养，缺氧组建立缺氧条件后继续分为模型组、散剂高剂量组、散剂中剂量组、散剂低剂量组，并与eNOS阻滞剂一起孵育；

3.2）细胞内NO

（4）统计学分析：采用SPSS 20.0软件进行统计分析，所有数据均表示为：以xˉ±s对于每项实验进行三个独立的重复，使用t检验和方差分析进行统计评估，以P<0.05表示具有统计学意义。

进一步地，所述步骤1.1）中取薏苡仁颗粒剂、附子颗粒剂，按照薏苡附子散的配方配置薏苡附子散颗粒剂；再利用薏苡附子散颗粒剂制备浓度分别为：0.8g/mL、0.4g/mL、0.2g/mL的薏苡附子散颗粒剂溶液。

进一步地，所述步骤1.2）中薏苡附子散NO

进一步地，所述步骤1.3）中建立AMI模型的方法为：常规消毒备皮后沿左锁骨中线切开小鼠皮肤，在第四、五肋间打开胸腔，剪开心包，结扎左冠状动脉前降支，收紧线结即完成左冠状动脉闭塞致心肌缺血，以肉眼观察结扎处远端心室壁由红润变苍白，动态心电图检测ST段抬高，判断为造模成功。

进一步地，所述步骤1.3）中eNOS阻滞剂的剂量为20mg/kg；薏苡附子散颗粒剂高剂量组、薏苡附子散颗粒剂中剂量组以及薏苡附子散颗粒剂低剂量对应摄入浓度为0.8g/mL、0.4g/mL、0.2g/mL的薏苡附子散颗粒剂溶液，剂量为200ul/d/只，灌胃给药。

进一步地，所述步骤1.4）中检测eNOS蛋白表达的方法为：提取药物干预后各组小鼠心肌组织中的总蛋白，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度后在100℃条件下变性；之后分别在10%和6%的SDS-PAGE凝胶电泳分离、充分电转和封闭后使用TBST洗膜，分别使用eNOS一抗、β-actin一抗于4℃孵育12h；TBST洗膜后加入HRP标记的山羊抗兔/小鼠IgG二抗于室温孵育2h；使用超敏ECL化学发光试剂盒将膜显影成像，再使用Image Lab软件测定各蛋白条带的灰度值，以β-actin作为内参检测eNOS蛋白的表达水平。

进一步地，所述步骤1.6）中观察心肌组织病理变化的方法为：将取得的各组小鼠心脏组织样本，生理盐水冲洗干净后浸入10%中性组织固定液中固定24h，固定后，样品放入自动脱水机中脱水、透明及浸蜡，洗涤过的样品被处理并包埋在石蜡中，切割4μm厚的石蜡切片，经过HE染色后置于显微镜下观察小鼠心肌组织病理变化情况，并拍照记录。

进一步地，所述步骤3.1）中将8次传代后的HCAECs分为两大组：有氧组、缺氧组；有氧组按正常培养条件培养，缺氧组建立缺氧条件后继续分为模型组、散剂高剂量组、散剂中剂量组、散剂低剂量组；将各组HCAECs放入含有10％胎牛血清的Dulbecco's ModifiedEagle培养基中，并在37℃恒温的5% CO

进一步地，所述步骤3.2）中血清灭活的方法为：56℃水浴灭活30分钟。

进一步地，所述步骤3.2）中除菌的方法为：经0.22μm微孔过滤器滤过除菌。

本发明一种薏苡附子散保护缺血心肌作用机制的研究方法，在前期对薏苡附子散的基础研究中发现：薏苡附子散中含有较多的NO

本发明一种薏苡附子散保护缺血心肌作用机制的研究方法，研究发现薏苡附子散中含有较多的NO

本发明的有益效果是：

1、首次以治疗CAD的“胸痹缓急”古方“薏苡附子散”为研究的切入药物。在阻断NO信号经典通路确保干预药物通过NO

2、揭示中医“心合小肠”理论的作用内涵，为进一步探索中医理论的分子生物学机制提供初步的研究基础和启示，为创制基于中医传统理论的原创新药和优化经方提供理论依据和实验基础，为防治CAD疾病提供一条崭新的研究思路。

说明书附图

图1是本发明实施例1中建立AMI模型前后小鼠心电图监测图片；

图2是本发明实施例1中的Western blot检测小鼠eNOS蛋白的表达图；

图3是本发明实施例1中的薏苡附子散对HEAECs内NO

各横坐标为中药分组，纵坐标为相应中药分组的细胞内NO

图4是本发明实施例1中的薏苡附子散对小鼠离体胸主动脉环血管张力的影响图；其中，A： L-NAME，NE和药物干预后离体胸主动脉环血管舒张比，横坐标为组别，纵坐标为舒张百分比（%）；Saline：生理盐水组；与生理盐水组比，

B： L-NAME，NE和药物干预后离体胸主动脉环血管舒张曲线；横坐标为时间（min），纵坐标为血管张力值（mN），n代表独立的血管环实验组；

图5是本发明实施例1中各组小鼠心肌组织病理形态学显微图。

具体实施方式

下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不可以以任何方式限制本发明。

本发明一种薏苡附子散保护缺血心肌作用机制的研究方法，下述实施例1-3中各步骤所用薏苡附子散颗粒剂溶液的浓度分别是：高浓度为0.8g·mL-1、中浓度为0.4g·mL-1、低浓度为0.2g·mL-1；下述实施例1-3中各步骤所用薏苡附子散颗粒剂中含有少量的NO

表1薏苡附子散中的硝酸盐和亚硝酸盐含量（

本发明一种薏苡附子散保护缺血心肌作用机制的研究方法，下述实施例1-3中，各组小鼠在建立AMI模型前的生命体征均正常，心电图结果显示为正常心电图，具体如图1中A部分所示；建立AMI模型后，心电图结果显示：ST段明显抬高，即表明小鼠AMI模型建立成功，具体如图1中B部分所示；下述实施例1中各组小鼠干预4周后存活只数见表2所示：

表2

本发明一种薏苡附子散保护缺血心肌作用机制的研究方法，下述实施例1-3中，经过注射L-NAME后的小鼠心肌组织中eNOS蛋白表达受到明显抑制，即抑制了体内依赖eNOS蛋白生成NO的经典途径：L-Arg-NOS-NO，从而体内NO由补充途径NO

本发明一种薏苡附子散保护缺血心肌作用机制的研究方法，下述实施例1-3中，与AMI模型组比较，薏苡附子散颗粒剂高剂量组、薏苡附子散颗粒剂中剂量组、薏苡附子散颗粒剂低剂量组NO浓度显著升高（

表3.薏苡附子散对AMI模型小鼠体内NO生物活性的影响（

注：与模型组比较

本发明一种薏苡附子散保护缺血心肌作用机制的研究方法，下述实施例1-3中，在缺氧条件下，使用含有薏苡附子散的小鼠血清干预的HEAECs内NO

本发明一种薏苡附子散保护缺血心肌作用机制的研究方法，下述实施例1-3中，药物干预后的血管松弛率分别达到了1.8%、42.5%、65.8%、86.3%，检测指标以去甲肾上腺素（NE）诱发动脉环的最大收缩幅度与起始张力之间的差值作为最终的收缩幅度，以药物干预后血管张力变化的幅度与最终的收缩幅度之比反应动脉环张力的变化；下述实施例1中的实验结果：以中药干预血管后的舒张值占NE预收缩值的百分比（%）来表示中药舒张血管的能力如图4中A部分所示，在一定范围内具有浓度依赖性，药物浓度越高，血管松弛程度越高如图4中B部分所示。

本发明一种薏苡附子散保护缺血心肌作用机制的研究方法，下述实施例1-3中，HE染色显示，在光镜下，与空白组和假手术组相比，AMI组具有明显的心肌组织损伤，心肌细胞排列紊乱、破裂坏死，内有炎性细胞浸润，在给予薏苡附子散后，心肌组织损伤恢复，并具有一定的浓度依赖性；下述实施例1中的小鼠心肌组织病理形态学显微图如图5所示。

实施例1

一种薏苡附子散保护缺血心肌作用机制的研究方法，包括以下步骤：

（1）薏苡附子散对心肌缺血模型小鼠体内NO水平及组织病理影响研究：

1.1）实验药物的制备：薏苡附子散由薏苡仁颗粒剂（批号：20040201）和附子颗粒剂（批号：20031391）组成，皆购于江阴天江药业（中国），由广西中医药大学鉴定为正品；薏苡附子散按《金匮要略》中原方配伍薏苡仁：附子（炮）=1：1，成人用量3g/d。依据普通成人（体质量70 kg）的临床用量、动物与人间的等效剂量换算公式将颗粒剂制成浓度为高中低不同浓度（0.8g·mL-1、0.4g·mL-1、0.2g·mL-1）的药液，每2 d重新配制；

1.2）薏苡附子散NO

1.3）动物分组、造模及给药：

1.31）分组：适应性喂养7天后，将48只小鼠随机分为6组：空白组、假手术组、AMI模型组、薏苡附子散颗粒剂高剂量组、薏苡附子散颗粒剂中剂量组、薏苡附子散颗粒剂低剂量组；

1.32）造模：空白组按正常条件饲养；假手术组开胸穿线不接扎冠状动脉左前降支；AMI模型组、薏苡附子散颗粒剂高剂量组、薏苡附子散颗粒剂中剂量组以及薏苡附子散颗粒剂低剂量组均采用在左心耳下缘1mm结扎LAD的方法建立AMI模型； 建立AMI模型的方法为：常规消毒备皮后沿左锁骨中线切开小鼠皮肤，在第四、五肋间打开胸腔，剪开心包，结扎左冠状动脉前降支，收紧线结即完成左冠状动脉闭塞致心肌缺血，以肉眼观察结扎处远端心室壁由红润变苍白，动态心电图检测ST段抬高，判断为造模成功；

1.33）给药：除空白组外，其他各组给药前均使用腹腔注射eNOS阻滞剂抑制小鼠体内eNOS蛋白的表达，eNOS阻滞剂的剂量为20mg/kg；

空白组、假手术组、AMI模型组分别灌生理盐水；薏苡附子散颗粒剂高剂量组、薏苡附子散颗粒剂中剂量组以及薏苡附子散颗粒剂低剂量组分别灌高中低浓度的薏苡附子散颗粒剂溶液（0.8g·mL

1.4）检测eNOS蛋白表达：利用蛋白免疫印迹法检测步骤1.33）中各组实验小鼠心肌组织eNOS蛋白表达；具体为：提取药物干预后各组小鼠心肌组织中的总蛋白，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度后在100℃条件下变性；之后分别在10%和6%的SDS-PAGE凝胶电泳分离、充分电转和封闭后使用TBST洗膜，分别使用eNOS一抗、β-actin一抗（稀释比例均为1：1000）于4℃孵育12h；TBST洗膜后加入HRP标记的山羊抗兔/小鼠IgG二抗（稀释比例1∶3000）于室温孵育2h；使用超敏ECL化学发光试剂盒将膜显影成像。使用Image Lab软件测定各蛋白条带的灰度值，以β-actin作为内参检测eNOS蛋白的表达水平；

1.5）血清中总NO含量检测：取步骤1.33）中各组实验小鼠全血离心取上清液得到血清，利用Griess法通过总一氧化氮检测试剂盒检测各组实验小鼠血清中NO生物活性；

1.6）观察心肌组织病理变化：取步骤1.33）中各组实验小鼠心脏组织样本，将取得的各组小鼠心脏组织样本用生理盐水冲洗干净后浸入10%中性组织固定液中固定24h，固定后，样品放入自动脱水机中脱水、透明及浸蜡，洗涤过的样品被处理并包埋在石蜡中，切割4μm厚的石蜡切片，经过HE染色后置于显微镜下观察小鼠心肌组织病理变化情况，并拍照记录；

（2）薏苡附子散对小鼠离体的胸主动脉张力影响研究：

2.1）分组取血管环：将12只8周龄的雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组：生理盐水组、高剂量组、中剂量组、低剂量组，使用过量乙醚致安乐死后剥离小鼠胸主动脉血管环，每只小鼠获得4个不同的血管环，得到4组血管环样品；

2.2）血管环的检测：将4组血管环样品分别放入含有eNOS阻滞剂L-NAME的器官浴中孵育10min以阻断L-精氨酸-NOS-NO通路，再在每组血管环样品中加入10 mg去甲肾上腺素对分离的小鼠主动脉环进行预收缩后分别加入等量的生理盐水和高、中、低浓度的薏苡附子散(200mg/mL，400mg/mL，800mg/mL)，测量4组血管环样品的松弛程度并定量；

（3）薏苡附子散对人冠状动脉内皮细胞内NO活性的影响研究：

3.1）细胞培养：将8次传代后的HCAECs以每孔2×10

3.2）细胞内NO

（4）统计学分析：采用SPSS 20.0软件进行统计分析，所有数据均表示为：以xˉ±s对于每项实验进行三个独立的重复，使用t检验和方差分析进行统计评估，以P<0.05表示具有统计学意义。

实施例2

一种薏苡附子散保护缺血心肌作用机制的研究方法，包括以下步骤：

（1）薏苡附子散对心肌缺血模型小鼠体内NO水平及组织病理影响研究：

1.1）实验药物的制备：薏苡附子散由薏苡仁颗粒剂（批号：20040201）和附子颗粒剂（批号：20031391）组成，皆购于江阴天江药业（中国），由广西中医药大学鉴定为正品；薏苡附子散按《金匮要略》中原方配伍薏苡仁：附子（炮）=1：1，成人用量3g/d。依据普通成人（体质量70 kg）的临床用量、动物与人间的等效剂量换算公式将颗粒剂制成浓度为高中低不同浓度（0.8g·mL-1、0.4g·mL-1、0.2g·mL-1）的药液，每2 d重新配制；

1.2）薏苡附子散NO

1.3）动物分组、造模及给药：

1.31）分组：适应性喂养7天后，将60只小鼠随机分为6组：空白组、假手术组、AMI模型组、薏苡附子散颗粒剂高剂量组、薏苡附子散颗粒剂中剂量组、薏苡附子散颗粒剂低剂量组；

1.32）造模：空白组按正常条件饲养；假手术组开胸穿线不接扎冠状动脉左前降支；AMI模型组、薏苡附子散颗粒剂高剂量组、薏苡附子散颗粒剂中剂量组以及薏苡附子散颗粒剂低剂量组均采用在左心耳下缘1mm结扎LAD的方法建立AMI模型； 建立AMI模型的方法为：常规消毒备皮后沿左锁骨中线切开小鼠皮肤，在第四、五肋间打开胸腔，剪开心包，结扎左冠状动脉前降支，收紧线结即完成左冠状动脉闭塞致心肌缺血，以肉眼观察结扎处远端心室壁由红润变苍白，动态心电图检测ST段抬高，判断为造模成功；

1.33）给药：除空白组外，其他各组给药前均使用腹腔注射eNOS阻滞剂抑制小鼠体内eNOS蛋白的表达，eNOS阻滞剂的剂量为20mg/kg；

空白组、假手术组、AMI模型组分别灌生理盐水；薏苡附子散颗粒剂高剂量组、薏苡附子散颗粒剂中剂量组以及薏苡附子散颗粒剂低剂量组分别灌高中低浓度的薏苡附子散颗粒剂溶液（0.8g·mL

1.4）检测eNOS蛋白表达：利用蛋白免疫印迹法检测步骤1.33）中各组实验小鼠心肌组织eNOS蛋白表达；具体为：提取药物干预后各组小鼠心肌组织中的总蛋白，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度后在100℃条件下变性；之后分别在10%和6%的SDS-PAGE凝胶电泳分离、充分电转和封闭后使用TBST洗膜，分别使用eNOS一抗、β-actin一抗（稀释比例均为1：1000）于4℃孵育12h；TBST洗膜后加入HRP标记的山羊抗兔/小鼠IgG二抗（稀释比例1∶3000）于室温孵育2h；使用超敏ECL化学发光试剂盒将膜显影成像。使用Image Lab软件测定各蛋白条带的灰度值，以β-actin作为内参检测eNOS蛋白的表达水平；

1.5）血清中总NO含量检测：取步骤1.33）中各组实验小鼠全血离心取上清液得到血清，利用Griess法通过总一氧化氮检测试剂盒检测各组实验小鼠血清中NO生物活性；

1.6）观察心肌组织病理变化：取步骤1.33）中各组实验小鼠心脏组织样本，将取得的各组小鼠心脏组织样本用生理盐水冲洗干净后浸入10%中性组织固定液中固定24h，固定后，样品放入自动脱水机中脱水、透明及浸蜡，洗涤过的样品被处理并包埋在石蜡中，切割4μm厚的石蜡切片，经过HE染色后置于显微镜下观察小鼠心肌组织病理变化情况，并拍照记录；

（2）薏苡附子散对小鼠离体的胸主动脉张力影响研究：

2.1）分组取血管环：将24只8周龄的雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组：生理盐水组、高剂量组、中剂量组、低剂量组，使用过量乙醚致安乐死后剥离小鼠胸主动脉血管环，每只小鼠获得4个不同的血管环，得到4组血管环样品；

2.2）血管环的检测：将4组血管环样品分别放入含有eNOS阻滞剂L-NAME的器官浴中孵育10min以阻断L-精氨酸-NOS-NO通路，再在每组血管环样品中加入10 mg去甲肾上腺素对分离的小鼠主动脉环进行预收缩后分别加入等量的生理盐水和高、中、低浓度的薏苡附子散(200mg/mL，400mg/mL，800mg/mL)，测量4组血管环样品的松弛程度并定量；

（3）薏苡附子散对人冠状动脉内皮细胞内NO活性的影响研究：

3.1）细胞培养：将8次传代后的HCAECs以每孔2×10

3.2）细胞内NO

（4）统计学分析：采用SPSS 20.0软件进行统计分析，所有数据均表示为：以xˉ±s对于每项实验进行三个独立的重复，使用t检验和方差分析进行统计评估，以P<0.05表示具有统计学意义。

实施例3

一种薏苡附子散保护缺血心肌作用机制的研究方法，包括以下步骤：

（1）薏苡附子散对心肌缺血模型小鼠体内NO水平及组织病理影响研究：

1.1）实验药物的制备：薏苡附子散由薏苡仁颗粒剂（批号：20040201）和附子颗粒剂（批号：20031391）组成，皆购于江阴天江药业（中国），由广西中医药大学鉴定为正品；薏苡附子散按《金匮要略》中原方配伍薏苡仁：附子（炮）=1：1，成人用量3g/d。依据普通成人（体质量70 kg）的临床用量、动物与人间的等效剂量换算公式将颗粒剂制成浓度为高中低不同浓度（0.8g·mL-1、0.4g·mL-1、0.2g·mL-1）的药液，每2 d重新配制；

1.2）薏苡附子散NO

1.3）动物分组、造模及给药：

1.31）分组：适应性喂养7天后，将36只小鼠随机分为6组：空白组、假手术组、AMI模型组、薏苡附子散颗粒剂高剂量组、薏苡附子散颗粒剂中剂量组、薏苡附子散颗粒剂低剂量组；

1.32）造模：空白组按正常条件饲养；假手术组开胸穿线不接扎冠状动脉左前降支；AMI模型组、薏苡附子散颗粒剂高剂量组、薏苡附子散颗粒剂中剂量组以及薏苡附子散颗粒剂低剂量组均采用在左心耳下缘1mm结扎LAD的方法建立AMI模型； 建立AMI模型的方法为：常规消毒备皮后沿左锁骨中线切开小鼠皮肤，在第四、五肋间打开胸腔，剪开心包，结扎左冠状动脉前降支，收紧线结即完成左冠状动脉闭塞致心肌缺血，以肉眼观察结扎处远端心室壁由红润变苍白，动态心电图检测ST段抬高，判断为造模成功；

1.33）给药：除空白组外，其他各组给药前均使用腹腔注射eNOS阻滞剂抑制小鼠体内eNOS蛋白的表达，eNOS阻滞剂的剂量为20mg/kg；

空白组、假手术组、AMI模型组分别灌生理盐水；薏苡附子散颗粒剂高剂量组、薏苡附子散颗粒剂中剂量组以及薏苡附子散颗粒剂低剂量组分别灌高中低浓度的薏苡附子散颗粒剂溶液（0.8g·mL

1.4）检测eNOS蛋白表达：利用蛋白免疫印迹法检测步骤1.33）中各组实验小鼠心肌组织eNOS蛋白表达；具体为：提取药物干预后各组小鼠心肌组织中的总蛋白，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度后在100℃条件下变性；之后分别在10%和6%的SDS-PAGE凝胶电泳分离、充分电转和封闭后使用TBST洗膜，分别使用eNOS一抗、β-actin一抗（稀释比例均为1：1000）于4℃孵育12h；TBST洗膜后加入HRP标记的山羊抗兔/小鼠IgG二抗（稀释比例1∶3000）于室温孵育2h；使用超敏ECL化学发光试剂盒将膜显影成像。使用Image Lab软件测定各蛋白条带的灰度值，以β-actin作为内参检测eNOS蛋白的表达水平；

1.5）血清中总NO含量检测：取步骤1.33）中各组实验小鼠全血离心取上清液得到血清，利用Griess法通过总一氧化氮检测试剂盒检测各组实验小鼠血清中NO生物活性；

1.6）观察心肌组织病理变化：取步骤1.33）中各组实验小鼠心脏组织样本，将取得的各组小鼠心脏组织样本用生理盐水冲洗干净后浸入10%中性组织固定液中固定24h，固定后，样品放入自动脱水机中脱水、透明及浸蜡，洗涤过的样品被处理并包埋在石蜡中，切割4μm厚的石蜡切片，经过HE染色后置于显微镜下观察小鼠心肌组织病理变化情况，并拍照记录；

（2）薏苡附子散对小鼠离体的胸主动脉张力影响研究：

2.1）分组取血管环：将16只8周龄的雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组：生理盐水组、高剂量组、中剂量组、低剂量组，使用过量乙醚致安乐死后剥离小鼠胸主动脉血管环，每只小鼠获得4个不同的血管环，得到4组血管环样品；

2.2）血管环的检测：将4组血管环样品分别放入含有eNOS阻滞剂L-NAME的器官浴中孵育10min以阻断L-精氨酸-NOS-NO通路，再在每组血管环样品中加入10 mg去甲肾上腺素对分离的小鼠主动脉环进行预收缩后分别加入等量的生理盐水和高、中、低浓度的薏苡附子散(200mg/mL，400mg/mL，800mg/mL)，测量4组血管环样品的松弛程度并定量；

（3）薏苡附子散对人冠状动脉内皮细胞内NO活性的影响研究：

3.1）细胞培养：将8次传代后的HCAECs以每孔2×10

3.2）细胞内NO

（4）统计学分析：采用SPSS 20.0软件进行统计分析，所有数据均表示为：以xˉ±s对于每项实验进行三个独立的重复，使用t检验和方差分析进行统计评估，以P<0.05表示具有统计学意义。

上述实施例1-3中每项实验进行三个独立的重复，使用t检验和方差分析进行统计评估，结果显示：P<0.05；由上述实验结果可知，本发明一种薏苡附子散保护缺血心肌作用机制的研究方法，薏苡附子散具有较强的NO

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。