人类人工多能干细胞的培养方法、人类人工多能干细胞培养物、以及脑类器官的制造方法

摘要

一种人类人工多能干细胞的培养方法，具有如下工序：将人类人工多能干细胞相对于培养器以1.0×104～1.0×106cells/cm2的接种密度接种于培养基，进行二维培养。一种脑类器官的制造方法，具有如下工序：工序1，将通过上述人类人工多能干细胞的培养方法而得到的人类人工多能干细胞的培养物在含有BMP抑制剂和转化因子β(TGFβ)抑制剂的培养基中进行培养，形成细胞聚集体；工序2，将上述细胞聚集体在含有Wnt信号转导通路增强剂和细胞外基质的培养基中进行培养；以及工序3，将上述工序2中得到的培养物进行搅拌培养。

说明书

技术领域

本发明涉及人类人工多能干细胞的培养方法、人类人工多能干细胞培养物、以及脑类器官的制造方法。

背景技术

在脑病的治疗药、诊断药的开发中，尝试了利用在体外形成的脑(脑类器官)。例如，已知有通过将人类人工多能干细胞的细胞团在高氧分压条件下进行培养的方法(专利文献1)、将人类人工多能干细胞在细胞外基质中进行培养的方法(专利文献2)而得到脑类器官的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利申请公开第2016/0289635号说明书

专利文献2：美国专利第10407664号说明书

发明内容

在脑的发育过程中，来自外胚叶的神经管的刚闭合后的神经干细胞形成神经上皮细胞呈层状出芽(budding)的形态，然后，通过非对称分裂而产生神经细胞。即，形成具有呈层状出芽的神经上皮细胞的细胞聚集体是脑类器官的形成所必需的。

然而，人类人工多能干细胞根据其细胞株种类、传代数的不同而性质大幅不同，因此，认为为了由人类人工多能干细胞稳定地得到脑类器官，优选使人类人工多能干细胞的性质恒定，在脑类器官的制造中，形成适于具有呈层状出芽的神经上皮细胞的细胞聚集体的形成的状态。

本发明是鉴于上述情况而完成的，本发明提供一种在脑类器官的制造中适于具有呈层状出芽的神经上皮细胞的细胞聚集体的形成的人类人工多能干细胞的培养方法、人类人工多能干细胞培养物、以及使用上述人类人工多能干细胞培养物的脑类器官的制造方法。

即，本发明包括以下方式。

(1)一种人类人工多能干细胞的培养方法，具有如下工序：将人类人工多能干细胞相对于培养器以1.0×l0

(2)根据(1)所述的人类人工多能干细胞的培养方法，其中，进行上述二维培养的工序包括在含有Rho激酶抑制剂的培养基中进行培养的工序。

(3)根据(1)或(2)所述的人类人工多能干细胞的培养方法，其中，进行上述二维培养的工序包括在不含有Rho激酶抑制剂的培养基中进行培养的工序。

(4)根据(1)～(3)中任一项所述的人类人工多能干细胞的培养方法，其中，进行上述二维培养的工序之后的汇合度为70～100面积％。

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的人类人工多能干细胞的培养方法，其中，上述培养器为实施了提高细胞粘附性的表面加工的培养器。

(6)一种脑类器官的制造方法，具有如下工序：

工序1，将通过(1)～(5)中任一项所述的人类人工多能干细胞的培养方法而得到的人类人工多能干细胞的培养物在含有BMP抑制剂和转化因子β(TGFβ)抑制剂的培养基中进行培养，形成细胞聚集体，

工序2，将上述细胞聚集体在含有Wnt信号转导通路增强剂和细胞外基质的培养基中进行培养，以及

工序3，将上述工序2中得到的培养物进行搅拌培养。

(7)根据(6)所述的脑类器官的制造方法，其中，上述工序3中的搅拌培养为在不含细胞外基质的培养基中的搅拌培养。

(8)一种人类人工多能干细胞培养物，产生选自下述表1所示的代谢产物中的3种以上的代谢产物，上述代谢产物的产生量在下述表1所示的范围内。

[表1]

(9)根据(8)所述的人类人工多能干细胞培养物，其中，上述代谢产物包含腺苷酸基琥珀酸。

(10)根据(8)或(9)所述的人类人工多能干细胞培养物，其中，上述代谢产物包含一磷酸肌苷。

(11)根据(8)～(10)中任一项所述的人类人工多能干细胞培养物，其中，上述代谢产物包含一磷酸腺苷。

根据上述方式的人类人工多能干细胞的培养方法，能够提供一种在脑类器官的制造中适于神经上皮细胞的形成的形成人类人工多能干细胞的人类人工多能干细胞的培养方法。

附图说明

图1为表示实验例2中的各细胞聚集体的明视野观察图像和形态评价的图。

图2为表示实验例2中的各细胞聚集体的形态评价的基准的图。

图3为表示实验例3中的各细胞聚集体的明视野观察图像和形态评价的图。

图4为表示实验例4中的定量RT-PCR的结果的图表。

图5为表示实验例4中的样品A1(低接种密度：1.4×10

图6为表示实验例4中的样品A5(高接种密度：34.3×10

图7A为实验例5中的代谢物组学解析的基于HCA的热图。

图7B为实验例5中的代谢物组学解析的基于HCA的热图。

图7C为实验例5中的代谢物组学解析的基于HCA的热图。

图7D为实验例5中的代谢物组学解析的基于HCA的热图。

图7E为实验例5中的代谢物组学解析的基于HCA的热图。

图7F为实验例5中的代谢物组学解析的基于HCA的热图。

图7G为实验例5中的代谢物组学解析的基于HCA的热图。

具体实施方式

以下，示出实施方式对本发明进行进一步的详细说明，但本发明并不受以下的实施方式任何限定。

本说明书中例示的各成分、例如培养基中所包含的成分、各工序中使用的成分只要没有特别说明，可以分别单独使用1种，或者可以组合使用2种以上。

在本说明书中，表示“A～B”等数值范围的表述与“A以上且B以下”含义相同，该数值范围中包含A和B。

本说明书中，“包含物质X的培养基”、“在物质X的存在下”是指添加了外源性(exogenous)的物质X的培养基、包含外源性的物质X的培养基或在外源性的物质X的存在下。即，该培养基中存在的细胞或组织内源性(endogenous)地表达、分泌或产生该物质X时，将内源性的物质X与外源性的物质X相区别，即便不含外源性的物质X的培养基包含内源性的物质X，也不属于“包含物质X的培养基”的范畴。

<人类人工多能干细胞的培养方法>

本实施方式的人类人工多能干细胞(hiPSC：human induced pluripotent stemcell的培养方法具有如下工序：将人类人工多能干细胞相对于培养用容器(以下也称为“培养器”)以1.0×10

本实施方式的人类人工多能干细胞的培养方法中，如后述的实施例所示，通过人类人工多能干细胞的接种密度为上述范围内，能够制造在脑类器官的制造中适于神经上皮细胞的形成的人类人工多能干细胞培养物。

本实施方式的人类人工多能干细胞的培养方法启示了在人类人工多能干细胞的二维培养中，细胞间信号转导是重要的。

推测如果人类人工多能干细胞的接种密度小于上述下限值，则到人类人工多能干细胞增殖为止，人类人工多能干细胞间的距离较远，无法充分地进行细胞间信号转导。另外，推测如果人类人工多能干细胞的接种密度小于上述下限值，则在人类人工多能干细胞增殖的过程中，各人类人工多能干细胞间的距离产生偏差，其结果，细胞间转导物质的浓度等产生局部化，无法均匀地进行细胞间信号转导。

另一方面，推测如果人类人工多能干细胞的接种密度超过上述上限值，则到汇合为止的时间变短，无法充分地进行细胞间信号转导。

即，推测通过人类人工多能干细胞的接种密度为上述范围内，可充分地进行细胞间信号转导，防止细胞间转导物质的浓度的局部化，其结果，能够制造在脑类器官的制造中适于神经上皮细胞的形成的人类人工多能干细胞培养物。

经基因改良的人类人工多能干细胞也包含在人类人工多能干细胞中。经基因改良的人类人工多能干细胞可以通过将人工核酸酶即ZFN、TALEN或CRISPR转染到人类人工多能干细胞中而制作。人工核酸酶可以向靶基因导入双链DNA断裂(DSB：double strandbreak)，通过DSB修复机制之一的非同源性末端接合(NHEJ：non-homologous endjoining)而导入插入缺失变异。

人类人工多能干细胞是指利用公知的方法等将体细胞进行初始化(reprogramming)而诱导多能性的细胞。具体而言，可举出如下细胞：将成纤维细胞、外周血单核细胞或淋巴细胞等分化的体细胞通过选自包含Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、Lin28、Esrrb等的初始化基因簇中的多个基因的组合中的任一者的表达而进行初始化，诱导多分化能。

人类人工多能干细胞的传代数通常为1～100次，优选为5～80次，更优选为10～40次。通过使用传代数为上述范围内的人类人工多能干细胞，能够制造在脑类器官的制造中更适于神经上皮细胞的形成的人类人工多能干细胞培养物。

二维培养是指以细胞与培养器的培养面、或者与通过表面加工而形成于培养面的细胞外基质粘附的状态进行二维培养的培养方法。

本实施方式的二维培养使人类人工多能干细胞增殖，因此，也可以将二维培养称为扩大培养。

二维培养中，人类人工多能干细胞向培养基的接种密度为1.0×10

接种密度可以通过接种的细胞数(单位：cells)除以培养器的培养面的面积(em

作为培养器，优选为培养面施加了用于提高细胞粘附性的表面加工的培养器。作为用于提高粘附性的表面加工，例如可举出层粘连蛋白α5β1γ1、层粘连蛋白α1β1γ1、层粘连蛋白511E8等层粘连蛋白、巢蛋白、胶原蛋白、明胶、玻连蛋白(Vitronectin)、聚赖氨酸和聚鸟氨酸等细胞外基质的涂布处理、以及正电荷处理。

作为培养器的形态，例如可举出烧瓶、组织培养用烧瓶、培养皿(dish)、组织培养用培养皿、多培养皿、微板、微孔板、多板、多孔板、腔室载玻片、浅底盘、管、托盘、培养袋、微载体、堆叠板、转瓶。

作为二维培养中使用的培养基(以下也称为“扩大培养培养基”)，优选为无饲养层的培养基。作为无饲养层的培养基，例如可举出hES9培养基、hES9a培养基和hESF-FX培养基等公知的培养基、以及TeSR-E8(STEMCELL Technologyes公司产品名)、StemFit(注册商标)等市售品等。

扩大培养培养基中，为了实现人类人工多能干细胞的分化能的维持、增殖能的提高以及细胞死亡的抑制，可以在用上述无饲养层的培养基进行培养之前，用在上述无饲养层培养基中含有Rho激酶抑制剂(ROCK抑制剂)的培养基进行培养。即，二维培养可以包括在含有ROCK抑制剂的培养基中进行培养的工序。在使用向无饲养层培养基中添加了ROCK抑制剂的培养基的情况下，其培养期间最多可以为5天，然后，利用不含ROCK抑制剂的无饲养层培养基通常培养1天以上，优选培养3天以上。即，二维培养可以进一步包括在不含有ROCK抑制剂的培养基中进行培养的工序。

二维培养优选依次包括在含有ROCK抑制剂的培养基进行培养的工序，以及在不含有ROCK抑制剂的培养基进行培养的工序。

作为ROCK抑制剂，例如可举出Y-27632(CAS编号：129830-38-2)、Fasudil/HA1077(CAS编号：105628-07-7)、H-1152(CAS编号：871543-07-6)和Wf-536(CAS编号：539857-64-2)、以及它们的衍生物。

含有ROCK抑制剂的培养基中所含的ROCK抑制剂的浓度通常是成为0.1μM～100μM的量，优选是成为1μM～80μM的量，更优选是成为5μM～50μM的量。

关于培养中的培养器，放入培养器的容器内的温度通常为30℃～50℃，优选为32℃～48℃，更优选为34℃～46℃的温度下。关于培养中的培养器，放入培养器的容器内的二氧化碳含有比例通常为1体积％～15体积％，优选为2体积％～14体积％，更优选为3体积％～13体积％的气氛下。

在进行二维培养之前，可以将人类人工多能干细胞分散。分散是指将细胞通过酶处理、物理处理等分散处理而分离为100个以下的细胞群体、优选为50个以下的细胞群体、更优选为单一细胞。作为分处处理，例如可举出机械分散处理、细胞分散液处理和细胞保护剂添加处理。这些处理可以组合。这些之中，优选细胞分散液处理。

作为用于细胞分散液处理的细胞分散液，例如可举出包含胰蛋白酶、胶原蛋白酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、链霉蛋白酶、DNase和木瓜蛋白酶等酶类；以及乙二胺四乙酸等螯合剂；中的任一者的溶液等。作为市售的细胞分散液，例如可举出Thermo FisherScientific公司制的TrypLE Select、TrypLE Express。作为机械分散处理，可举出移液处理以及利用刮刀的刮取操作。分散处理可以将细胞分散液处理与机械分散处理组合进行。

在将人类人工多能干细胞分散之前，为了防止细胞死亡，可以利用细胞保护剂进行处理。作为细胞保护剂，例如可举出成纤维细胞增殖因子(Fibroblast growth factor，以下也称为“FGF”)、肝素、ROCK抑制剂、胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor，以下也称为“IGF”)、血清、和血清代替物。

二维培养之后的汇合度(细胞占有面积)优选为70～100面积％，更优选为75～100面积％，进一步优选为80～100面积％。通过汇合度在上述范围内，能够得到性质更均匀的细胞培养物。

应予说明，这里所谓的汇合度是指二维培养工序之后的人类人工多能干细胞培养物的占有面积相对于培养器的培养面的总面积的比例的百分率。

<人类人工多能干细胞培养物>

本实施方式的人类人工多能干细胞培养物可以通过本实施方式的人类人工多能干细胞的培养方法而制造。

本实施方式的人类人工多能干细胞培养物产生选自下述表2所示的代谢产物中的3种以上的代谢产物，上述代谢产物的产生量在下述表1所示的范围内，代谢产物及其产生量可以通过代谢物组学解析来确认。表2所示的候选代谢产物可以通过对以低接种密度得到的人类人工多能干细胞培养物以及本实施方式的多能干细胞培养物的代谢物组学解析的结果进行层次聚类分析(Hierarchical Cluster Analysis，简称为“HCA”)来提取。

在表2所示的代谢产物中，与嘌呤代谢相关的腺苷酸基琥珀酸、一磷酸肌苷(IMP)和一磷酸腺苷(AMP)为本实施方式的人类人工多能干细胞培养物中特别特征性的代谢产物，优选这3种中的至少1种以上为表2所示的产量的人类人工多能干细胞培养物。

[表2]

<脑类器官的制造方法>

本实施方式的脑类器官的制造方法具有如下工序：工序1，将通过上述人类人工多能干细胞培养物的培养方法而得到的人类人工多能干细胞培养物在含有BMP抑制剂和转化因子β(TGFβ)抑制剂的培养基(以下，也称为“培养基1”)中进行培养，形成细胞聚集体；工序2，将上述细胞聚集体在含有Wnt信号通路增强剂和细胞外基质(以下，也称为“ECM”)的培养基(以下，也称为“培养基2”)中进行培养；以及工序3，将上述工序2中的培养物进行搅拌培养。

根据本实施方式的脑类器官的制造方法，在工序2中，工序2的培养物可形成具有呈层状出芽的神经上皮细胞的细胞聚集体。另外，能够形成FOXG1、SIX3等端脑标志物充分地表达的脑类器官。

工序1和工序2中的培养优选为悬浮培养。

悬浮培养是指一边维持培养细胞悬浮于培养液而存在的状态一边进行培养、以及进行该培养的方法。悬浮培养是指以不使培养细胞与培养器的培养面粘附的条件进行的培养。

作为悬浮培养中使用的培养器，优选培养面为细胞非粘附性的培养器。作为培养面为细胞非粘附性的培养器，可举出对烧瓶、组织培养用烧瓶、培养皿、组织培养用培养皿、多培养皿、微板、微孔板、多板、多孔板、腔室载玻片、浅底盘、管、托盘、培养袋、微载体、堆叠板、转瓶等的表面进行了MPC聚合物等的细胞非粘附性处理的培养器，以及以凹凸进行了形状加工的培养器。

[工序1]

工序1中，将人类人工多能干细胞培养物在培养基1中进行培养，形成细胞聚集体。细胞聚集体表示2个以上的细胞粘粘附而形成聚集体的状态，也称为神经球(neurosphere)。

利用培养基1的培养中使用的培养器可以使用培养空间狭窄的培养器以便所培养的细胞彼此能够聚集。作为培养空间狭窄的培养器，例如可举出24孔板(面积以平底换算计为1.88cm

培养基1含有BMP抑制剂和TGFβ抑制剂。培养基1通常在基础培养基中添加BMP抑制剂和TGFβ抑制剂等而制备。

作为基础培养基，例如可举出BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、GlasgowMEM(GMEM)培养基、Improved MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、F-12培养基、DMEM/F12培养基、IMDM/F12培养基、Ham′s培养基、RPMI 1640培养基和Fischer’s培养基；以及这些混合培养基的培养基；以及从这些培养基中减少了与神经分化有关的成分的培养基等。这些之中，优选为减少了与神经分化有关的成分的培养基。

作为BMP抑制剂，例如可举出腱蛋白、头蛋白(Nogin)、卵泡抑素、多索吗啡(Dorsomorphin)、(6-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基-吡唑并[1，5-a]嘧啶)、DMH1(4-[6-(4-异丙氧基苯基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基]喹啉、4-[6-[4-(1-甲基乙氧基)苯基]吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基]-喹啉)和LDN193189、(4-(6-(4-(哌啶-1-基)苯基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)喹啉)。这些之中，优选为多索吗啡和LDN193189。

培养基1中所含的BMP信号转导通路抑制剂的浓度优选为0.5μM～10μM，更优选为0.75μM～5μM，进一步优选为1μM～3μM。

TGFβ抑制剂是抑制由Smad家族转导的信号转导通路的物质，作为TGF-β抑制剂，可举出A83-01(CAS编号：909910-43-6)、SB-431542(CAS编号：301836-41-9)、SB-505124(CAS编号：694433-59-5)、SB-525334(CAS编号：356559-20-1)、LY364947(CAS编号：396129-53-6)、SD-208(CAS编号：627536-09-8)和SJN2511(CAS编号：446859-33-2)等。这些之中，优选为A83-01和SB-431542。

培养基1中所含的TGFβ抑制剂的浓度优选为0.5μM～10μM，更优选为0.75μM～5μM，进一步优选为1μM～3μM。

培养基1可以进一步含有神经系统补充剂、培养基补充剂、血清、血清代替物、抗菌剂、以及胰岛素和白蛋白等来自血清的蛋白质等。

作为神经系统补充剂，可举出包含生物素、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺、视黄醇、乙酸视黄酯、亚硒酸钠、三碘甲状腺原氨酸(T3)、DL-α-生育酚(维生素E)、白蛋白、胰岛素和转铁蛋白的B27补充剂(Thermo Fisher公司产品名)；以及包含人转铁蛋白、牛胰岛素、黄体酮、腐胺和亚硒酸钠的N2补充剂等。

作为培养基补充剂，例如可举出含有L-谷氨酸和由L-谷氨酸得到的二肽的“GlutaMax系列”(Thermo Fisher公司产品名)等含谷氨酸的补充剂、“MEM Non-EssentialAmino Acids Solution”(Thermo Fisher公司产品名)等氨基酸水溶液、以及2-巯基乙醇。

作为抗菌剂，例如可举出青霉素系抗生物质、头孢烯系抗生物质、大环内酯系抗生物质、四环素系抗生物质、磷霉素系抗生物质、氨基糖苷系抗生物质和新型喹诺酮系抗生物质。

培养期间通常为1天以上，优选为3天～14天，更优选为4天～12天。

培养中的培养器通常在30℃～50℃、优选在32℃～48℃、更优选在34℃～46℃的温度下。培养中的培养器的容器内的二氧化碳含有比例通常为1体积％～15体积％，优选为2体积％～14体积％，更优选为3体积％～13体积％的气氛下。

在利用培养基1进行培养前，可以将人类人工多能干细胞培养物分散。对于分散的处理方法，与上述二维培养工序中记载的分散的处理方法相同。

[工序2]

工序2中，将工序1中得到的细胞聚集体在培养基2中进行培养，形成具有呈层状出芽的神经上皮细胞的细胞聚集体(以下也称为“工序2的细胞聚集体”)。

工序2中，可以不取出工序1的细胞聚集体而仅替换培养基来连续进行，也可以取出工序1的细胞聚集体后进行。

培养期间通常为1天以上，优选为3天～14天，更优选为4天～12天。

关于培养中的培养器，放入培养器的容器内的温度通常为30℃～50℃，优选为32℃～48℃，更优选为34℃～46℃的温度下。关于培养中的培养器，放入培养器的容器内的二氧化碳含有比例通常为1体积％～15体积％，优选为2体积％～14体积％，更优选为3体积％～13体积％的气氛下。

培养基2是与干细胞的增殖、未分化性的维持相关的含有Wnt信号转导通路增强剂和ECM的培养基。培养基2通常在基础培养基中添加Wnt信号转导通路增强剂和ECM等而制备。

作为基础培养基，例如可举出BME培养基、BGJb培养基、CMRL1066培养基、GMEM(Thermo Fisher公司产品名)、Improved MEM Zinc Option培养基(Thermo Fisher公司产品名)、IMDM培养基、Medium 199(Thermo Fisher公司产品名)、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、Ham′s培养基、Ham′s F-12培养基和RPMI1640培养基、以及将这些混合而得的培养基。

作为Wnt信号转导通路增强剂，可举出GSK-3β抑制剂、Wnt蛋白质、Wnt激动剂等。这些之中，优选为GSK-3β抑制剂和Wnt蛋白质。培养基2中所含的Wnt信号转导通路增强剂的浓度通常为0.1μM～10μM，优选为0.2μM～5μM。

作为GSK-3β抑制剂，可举出CHIR99021(CAS编号：252917-06-9)、肯帕罗酮(Kenpaullone)(CAS编号：142273-20-9)和6-溴靛玉红-3’-肟(6-Bromoindirubin-3’-oxime)(BIO，CAS编号：667463-62-9)等。这些之中，优选为CHIR99021。

作为Wnt蛋白质，优选为来自哺乳动物的Wnt蛋白质。作为哺乳动物的Wnt蛋白质，可举出Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16等。这些之中，优选为Wnt3a，更优选为Wnt3a与阿法明(Afamin)的复合物。

作为在包含ECM的培养基中进行培养的方法，可举出将工序1的细胞聚集体包埋于ECM进行培养的方法、将工序1的细胞聚集体在混合有ECM的培养基中进行培养的方法等。这些之中，优选将工序1的细胞聚集体在混合有ECM的培养基中进行培养的方法。

混合有ECM的培养基可以混合如下的量而制备：相对于培养基中的ECM以外的成分的体积，ECM的体积通常为1体积％以上，优选为5体积％～100体积％，更优选为10体积％～90体积％。作为混合ECM的方法，可举出在冰浴上进行的移液方法。混合是指通过目视在培养基中观察不到ECM的状态。

作为ECM，例如可举出基底膜中所含的成分、存在于细胞间隙的糖蛋白。作为基底膜中所含的成分，例如可举出IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、巢蛋白等。作为ECM，可以使用包含ECM的市售品。作为存在于细胞间隙的糖蛋白，可举出胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、纤连蛋白、肝素硫酸盐等。作为包含ECM的市售品，例如可举出基质胶(Corning公司产品名)、人型层粘连蛋白(Sigma公司产品名)等。

培养基2优选进一步含有TGFβ抑制剂。作为TGFβ抑制剂，可举出与上述的培养基1同样的抑制剂。这些之中，优选能够选择性地抑制ALK5的激酶活性的SB-431542或SC-203294。培养基2中所含的TGF-β抑制剂的浓度通常为0.1～20μM，优选为0.1μM～10μM。

培养基2可以进一步含有神经系统补充剂、培养基补充剂、胰岛素和白蛋白等来自血清的蛋白质、血清、血清代替物等。对于神经系统补充剂、和培养基补充剂的详细内容，可举出与上述的培养基1中所例示的补充剂相同的补充剂。

[工序3]

工序3中，通过搅拌培养使工序2的细胞聚集体成熟，形成胶质细胞，形成脑类器官。这里，将搅拌培养中使用的培养基作为培养基3。

工序3中，可以不从培养器中取出工序2的细胞聚集体而仅将培养基从培养基2替换成培养基3来连续地进行培养，也可以将工序2的细胞聚集体从培养器中取出，转移到其它培养器后，在培养基3中进行培养。

培养期间通常为1天以上，优选为2天～700天，更优选为10天～365天。关于培养中的培养器，放入培养器的容器内的温度通常为30℃～50℃，优选为32℃～48℃，更优选为34℃～46℃的温度下。关于培养中的培养器，放入培养器的容器内的二氧化碳含有比例通常为1体积％～15体积％，优选为2体积％～14体积％，更优选为3体积％～13体积％的环境下。

作为搅拌培养中使用的培养器，通常使用细胞非粘附性的培养器。

培养基3通常含有基础培养基。另外，培养基3通常在基础培养基中添加神经系统补充剂、培养基补充剂、胰岛素和白蛋白等来自血清的蛋白质、血清、血清代替物等其他成分而制备。对于基础培养基，可举出与上述的培养基2中例示的基础培养基同样的基础培养基。

培养基3优选实质上不含ECM。“实质上不含ECM”是指不会特意地在培养基3中添加ECM，可允许作为不可避免的杂质而混入的ECM。

培养基3可以进一步含有选自神经系统补充剂、培养基补充剂、胰岛素和白蛋白等来自血清的蛋白质、血清和血清代替物中的至少1种。对于神经系统补充剂和培养基补充剂的详细内容，可举出与上述的培养基1中同样的补充剂。

通过本实施方式的脑类器官的制造方法而制造的脑类器官优选包含端脑或端脑部样组织。在此，作为端脑部样组织，可举出大脑皮质、基底神经节、海马体、脉络丛等。在此，脑类器官是否包含端脑、端脑部样组织可以从形态上判断。或者，也可以对各组织测定特征性的标志物基因或标志物蛋白质的表达，从而进行判断。

作为端脑标志物，例如可举出FOXG1、SIX3等。另外，作为大脑皮质标志物，例如可举出作为大脑皮质的第V层标志物的CTIP2、作为大脑皮质的第II/III层标志物的SATB2等。另外，作为基底神经节标志物，例如可举出NKX2.1、GSH2等。另外，作为海马体标志物，例如可举出KA1、ZBTB2等。另外，作为脉络丛标志物，例如可举出TTR、LMX1A等。

脑类器官优选抑制作为前脑和中脑标志物的OTX2的表达。

脑类器官可以通过延长工序3的培养期间而更多地包含端脑或端脑部样组织。

<药效评价方法>

药效评价方法具有：使上述脑类器官与受试物质接触的工序(以下也称为“工序A”)，以及检定受试物质对脑类器官造成的影响的工序(以下也称为“工序B”)。

工序A中，作为受试物质，例如可举出天然化合物库、合成化合物库、现有药库和代谢物库。现有药物例如包含AZD2858、甲基硫

工序B中，受试物质对脑类器官造成的影响可以通过蛋白质印迹(WesternBlotting)、ELISA、免疫染色等进行检定(评价)。

进而，在工序A之前，可以具有将脑类器官移植到哺乳动物的脑的工序(以下也称为“工序a”)。在脑类器官呈现阿尔茨海默症样的病态的情况下，通过具有工序a，能够在更接近患有阿尔茨海默症的生物体的环境下评价受试物质的药效。

实施例

以下，基于实施例对本实施方式进一步的具体地进行说明，但本实施方式并不限定于这些实施例。

[实验例1]

(人类iPS细胞的培养)

将人类iPS细胞(PChiPS771株，Lot.A01QM28、ReproCELL Inc.制)用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)清洗后，使用TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific公司制)分散成单一细胞。将分散的人类iPS细胞以表3所示的接种密度接种于培养基，将培养器放入孵化器内(37℃、1atm、CO

培养器使用涂布有仅包含层粘连蛋白-511的活性部位的人类重组型层粘连蛋白片段(产品名“iMatrix-511”，Nippi公司制)的60mm培养皿(IWAKI公司制，细胞培养用)，培养基使用在基础培养基(StemFit AK02N培养基，味之素公司制)中加入Y27632(ROCK抑制剂，培养基中浓度：10μM)的培养基。

从培养开始起1天后，将培养基替换为仅包含不含Y27632的基础培养基(StemFitAK02N培养基，味之素公司制)的培养基。其后，每天将培养基替换为仅基础培养基的培养基，培养7天，得到各人类iPS细胞培养物。

[表3]

[实验例2]

(具有呈层状出芽的神经上皮细胞的细胞聚集体的形成)

将实验例1中得到的人类iPS细胞培养物使用TrypLE Select(Thermo FisherScientific公司产品名)进行细胞分散液处理，进一步通过移液操作而分散成单一细胞。在96孔培养板(产品名“PrimeSurface 96V型底板”，Sumitomo Bakelite公司制)上，将分散的人类iPS细胞以成为1×10

去除培养基1，以150μL/孔的量添加表5所示的组成的培养基2，将人类iPS细胞的聚集体在孵化器内(37℃、CO

将从人类iPS细胞培养开始起第7天和第14天的基于光学显微镜的明视野图像与细胞聚集体的形态评价示于图1。

应予说明，细胞聚集体的形态评价利用从人类iPS细胞培养开始起第14天的基于光学显微镜的明视野图像以图2所示的基准进行。

[表4]

[表5]

[表6]

根据图1，接种密度为17.1×10

[实验例3]

(对于人类iPS细胞的传代数的影响)

实验例1中，使用图4所示的传代数的人类iPS细胞，除此以外，以与实验例1和实验例2同样的操作制造神经上皮细胞。将其利用光学显微镜得到的明视野图像和细胞聚集体的形态评价示于图3。

如图3所示，在使用任一传代数的人类iPS细胞的情况下，接种密度为34.3×10

[实验例4]

(基于RT-qPCR的脑类器官的制造和其表达基因的测定)

将实验例1中得到的样品A1(低接种密度：1.4×10

接下来，将孔的内容物转移到放有10mL的PBS的50mL的FalconTM锥形管(CorningInc.制)中。接下来，颠倒混合5次，除去上清液，从而除去培养基2，回收细胞聚集体。将回收的细胞聚集体30个和30mL的表6所示的组成的培养基3加入到一次性生物反应器(ABLE公司)中，一边搅拌一边进行悬浮培养，制造脑类器官。培养基每4天替换一次。

使用市售的试剂盒(产品名“RNeasy PlusMini试剂盒”，Qiagen公司)提取脑类器官的全RNA。另外，使用NanoDrop(Thermo Fisher Scientific公司产品名)测定全RNA的浓度。接下来，将全RNA通过RT Master Mix(TOYOBO公司产品名)和无核酸酶水(Nucleasefree water)进行逆转录，合成cDNA。

在上述cDNA中加入Premix Ex Taq(Takara Bio Inc.产品名)、ROX ReferenceDye II(Takara Bio Inc.产品名)，制备反应溶液。接下来，使用实时PCR系统(产品名“ViiA7”，Thermo Fisher Scientific公司)进行上述反应溶液的RT-qPCR解析，测定区域性标志物(端脑：FOXG1、视网膜：OTX2)、大脑皮质的神经细胞标志物(SATB2、CTIP2)和神经干细胞标志物(PAX6)的表达量。将测定结果示于图4((A)：FOXG1、(B)：OTX2、(C)：SATB2、(D)：CTIP2、(E)：PAX6)。表达量表示将样品A1(低接种密度：1.4×10

在样品A5(高接种密度：34.3×10

进而，通过样品A1(低接种密度：1.4×10

如图5和图6所示，蛋白质的表达量也与mRNA的表达量同样地确认到高接种密度的来自人类iPS培养物的脑类器官与低接种密度的来自人类iPS培养物的脑类器官相比，SATB2和CTIP2的表达量高，PAX6的表达量低。

[实验例5]

(基于代谢物组学解析的多能干细胞培养物的代谢产物的测定)

以下述表7所示的传代数和接种密度进行接种，除此以外，以与实验例1同样的操作准备试样名“30-3-13”、“30-3-14”、“30-3-15”、“33-72-16”、“33-72-17”、和“33-72-18”的各人类iPS细胞培养物。

进行各人类iPS细胞培养物的代谢物组学解析，进行代谢产物量的测定(表8-1～表8-14和表9)和基于HCA的HeatMap的制作(图7A～图7G)。表8-1～表8-14为实验例5中的试样名、“30-3-13”、“30-3-14”、“30-3-15”、“33-72-16”、“33-72-17”和“33-72-18”的各人类iPS细胞培养物的代谢物组学解析中候选化合物的全代谢产物数据。表9为算出表8-1～表8-14中有变动的代谢产物的结果。表8-1～表8-14和表9中，ID由测定模式的首字母和序号构成，C表示阳离子模式，A表示阴离子模式。“N.D.”为Not Detected的缩写，表示虽然是解析对象，但为检测限以下。“N.A.”为Not Available的缩写，表示虽然是计算对象，但由于数据不足而无法计算。2组间的检测平均值的比将后者作为分母而算出。Welch的t-检验的p-value和其范围为*＜0.05、**＜0.01、***＜0.001。另外，图7A～图7G中，ID由测定模式的首字母和序号构成，C表示阳离子模式，A表示阴离子模式。“HMT DB”的“化合物名称(Compoundname)”为由检测峰的m/z和MT与HMT数据库进行对照而得到的候选化合物。“标准化相对面积(Standardized Relative Area)”为将检测峰的相对面积(Relative area)标准化而得的值，为了算出距离，用eps(2-52)代替原始数据的ND。

[表7]

[表8-1]

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[表8-2]

[表8-3]

[表8-4]

[表8-5]

[表8-6]

[表8-7]

[表8-8]

[表8-9]

[表8-10]

[表8-11]

[表8-12]

[表8-13]

[表8-14]

[表9]

确认到各人类iPS细胞培养物中产生了表9所示的各种类代谢产物。

产业上的可利用性

根据本实施方式的人类人工多能干细胞的培养方法，能够形成人类人工多能干细胞培养物，其适于具有呈层状出芽的神经上皮细胞的细胞聚集体的形成。